李敏，徐艷嬌，張程亮，祖越，高前艷，王熙敏，陳云舟

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 430030)

羧酸酯酶(carboxylesterases，CESs)是一類重要的絲氨酸水解酶，也是重要的I相藥物代謝酶，可催化水解內(nèi)源性和外源性物質(zhì)，在藥物代謝和脂質(zhì)代謝中發(fā)揮重要作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)在肝臟、腸道、肺臟等器官中CESs高表達(dá)[2]，在腦、胃、腎、脾等組織中有少量表達(dá)[3]。CESs的表達(dá)和活性與基因多態(tài)性、核受體和疾病等多種因素相關(guān)[4-5]。如其活性發(fā)生變化，將會影響藥物以及外源性毒物的代謝，造成藥物蓄積影響用藥安全性。

炎性細(xì)胞因子對于藥物代謝酶的表達(dá)和代謝活性的影響多有報道[6-7]。YANG等[8]研究發(fā)現(xiàn)，炎性因子白細(xì)胞介素(IL)-6可顯著抑制人原代肝細(xì)胞以及HepG2細(xì)胞中CES1和CES2的表達(dá)水平和代謝活性。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，免疫性肝損傷中多種炎癥因子的升高伴隨肝臟羧酸酯酶的下降，從而對藥物代謝造成潛在的影響[4]。同時還發(fā)現(xiàn)潰瘍性結(jié)腸炎中結(jié)腸部位IL-6等炎性因子可以經(jīng)過門靜脈入肝，下調(diào)肝細(xì)胞的CESs表達(dá)和活性[9]。巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞也表達(dá)CESs，并在藥物代謝、膽固醇及脂肪酸代謝和運(yùn)輸過程中發(fā)揮重要作用[2，10-11]。巨噬細(xì)胞作為幾乎遍布機(jī)體全身的重要免疫細(xì)胞，不僅在免疫方面起著關(guān)鍵作用，還可以維持膽固醇的攝取、酯化和外排的動態(tài)平衡[12]。巨噬細(xì)胞具有異質(zhì)性和可塑性，其表型和功能受不同環(huán)境影響可極化為M1和M2型巨噬細(xì)胞。然而，目前有關(guān)炎性因子是否可以調(diào)控巨噬細(xì)胞CESs筆者尚未見報道。因此，本研究選擇前炎癥因子IL-33，通過體外處理RAW264.7細(xì)胞，探究其對巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)的影響和CESs的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1材料 RAW264.7巨噬細(xì)胞由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科惠贈；IL-33(PeproTech公司，批號：1106398)；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS，Gibco公司，批號：16140063)；總膽固醇(TC，批號：A111-1-1)、三酰甘油(TG，批號：A110-1-1)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C，批號：A112-1-1)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C，批號：A113-1-1)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；CCK8細(xì)胞試劑盒(MCE公司，批號：68084)；小鼠抗CD206抗體(批號：abs141228)、小鼠抗誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS，批號：abs131793)、小鼠抗β肌動蛋白(β-actin)單克隆抗體(批號：abs132184)和小鼠抗受體生長刺激表達(dá)基因2蛋白(ST2)抗體(批號：abs132912)購自Absin公司；小鼠抗CES1(Abcam公司，批號：EP1375Y)，CES2抗體(RD公司，批號：AF5280)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 將RAW264.7細(xì)胞按合適比例分別接種于6孔板和96孔板中，置于含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃、5% 二氧化碳(CO2)，95%濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。按照實驗設(shè)計，給予5，10，20 ng·mL-1的IL-33刺激細(xì)胞，干預(yù)24 h后，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白和RNA，用于后續(xù)實驗測定。

1.3免疫熒光實驗 將圓形蓋玻片預(yù)先置于6孔板底，取對數(shù)生長期細(xì)胞，按合適的密度接種，并在12 h后給予5，10，20 ng·mL-1的IL-33進(jìn)行干預(yù)，培養(yǎng)24 h后取出蓋玻片，加入4%多聚甲醛固定15 min，Triton-100通透10 min；1%BSA孵育30 min，加入小鼠抗CD206、小鼠抗iNOS抗體，4 ℃孵育過夜；磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，加入熒光二抗室溫孵育2 h，PBS洗滌后加入DAPI染色劑，37 ℃避光孵育2 h，PBS洗去染料，鏡下觀察并攝像。

1.4Western blotting檢測實驗 取對數(shù)生長期的細(xì)胞以適當(dāng)密度接種于6孔板中，使用不同濃度IL-33處理細(xì)胞。培養(yǎng)24 h后棄上清液，PBS洗滌2次，用Western及IP裂解液提取細(xì)胞總蛋白，并測定蛋白濃度。蛋白加入5×上樣緩沖液后，于95 ℃加熱3 min，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)凝膠電泳。

1.5反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)的檢測 將細(xì)胞以適當(dāng)密度接種于6孔板中，加入不同濃度IL-33培養(yǎng)24 h后，棄上清液，PBS清洗2次，收集細(xì)胞，按照TRIzol說明書提取細(xì)胞的總RNA，RT-PCR檢測細(xì)胞M1型標(biāo)志物IL-1β、TNF-α、iNOS和M2型標(biāo)志物IL-10、TGF-β、Arg1的表達(dá)，各引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系如下：2 μL cDNA、10 μL SYBR Green PCR Master Mix、上下游引物各1 μL、6 μL ddH2O。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；(94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s)×30個循環(huán)；72 ℃延伸45 s，72 ℃，7 min。

表1 RT-PCR引物序列

1.6CCK-8檢測細(xì)胞毒性 將RAW264.7細(xì)胞接種于96孔板，給予IL-33干預(yù)24 h后，分別加入30 μmol·L-1氯吡格雷和伊立替康，置于培養(yǎng)箱中孵育24 h，棄上清液，每孔加入10% CCK-8液100 μL繼續(xù)培養(yǎng)2 h，每組設(shè)置復(fù)孔3個。30 min后在波長450 nm處測吸光度(A值)，計算細(xì)胞存活率，評價細(xì)胞CES1和CES2的代謝活性。

1.7油紅O染色鑒定細(xì)胞脂質(zhì)沉積情況 以異丙醇溶解并配置質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的油紅O母液，使用時以油紅O母液與去離子水按3∶2混勻即可。制作RAW264.7細(xì)胞爬片，以20 ng·mL-1的IL-33干預(yù)24 h后，無菌PBS清洗干凈后，4%多聚甲醛固定10 min，無菌PBS清洗干凈，用60%異丙醇浸洗15 s，油紅O染色10 min，體積分?jǐn)?shù)為60%異丙醇分化10 s，去離子水洗凈，蘇木精染色液染色2 min，洗凈甘油封片，于倒置顯微鏡鏡下觀察并攝像。

1.8巨噬細(xì)胞TC、TG、HDL-C及LDL-C含量測定 將制備的細(xì)胞懸液離心，棄上清液，留細(xì)胞沉淀，加入PBS進(jìn)行勻漿。制備勻漿液，按照相應(yīng)試劑盒說明書分別測定TC、TG、HDL-C和LDL-C的含量。

2 結(jié)果

2.1IL-33顯著抑制巨噬細(xì)胞中CES1蛋白表達(dá)水平和代謝活性 不同濃度IL-33干預(yù)后，與對照組比較，細(xì)胞CES1的蛋白表達(dá)水平呈現(xiàn)濃度依賴性下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而CES2在巨噬細(xì)胞中表達(dá)微弱，即使經(jīng)過IL-33處理，其蛋白表達(dá)水平無明顯變化(P>0.05)，見圖1。ST2作為IL-33的特異性受體，在多數(shù)免疫細(xì)胞中都具有一定的表達(dá)。通過檢測巨噬細(xì)胞中ST2蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)，與空白對照組比較，10及20 ng·mL-1IL-33處理后表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，提示IL-33可能通過其受體ST2發(fā)揮下調(diào)CES1的作用。

CCK-8結(jié)果也表明IL-33刺激RAW264.7巨噬細(xì)胞后顯著下調(diào)CES1和CES2的代謝活性(P<0.05)，見圖2。

2.2IL-33刺激后RAW264.7細(xì)胞脂質(zhì)沉積增多 油紅O染色顯示，IL-33干預(yù)后細(xì)胞脂質(zhì)沉積增多，其中20 ng·mL-1的IL-33處理細(xì)胞脂滴顯著多于空白對照組，結(jié)果見圖3(紅框標(biāo)記的為巨噬細(xì)胞中脂滴數(shù)量)。進(jìn)一步檢測細(xì)胞TG、TC、HDL-C和LDL-C發(fā)現(xiàn)，IL-33導(dǎo)致巨噬細(xì)胞TC、TG及LDL-C增多(P<0.05)，而HDL-C顯著下降(P<0.01)，見圖4。

①與空白對照組比較，t=2.88，P<0.05；②與空白對照組比較，t=-13.15～-3.07，P<0.01。

2.3IL-33誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型極化 20 ng·mL-1IL-33干預(yù)24 h后，其對M1型標(biāo)志物的mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而M2型標(biāo)志物Arg1、IL-10和TGF-β表達(dá)顯著增多(P<0.05)，見圖5。進(jìn)一步進(jìn)行免疫熒光檢測iNOS和CD206(M2型標(biāo)志物)的蛋白表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)20 ng·mL-1IL-33刺激后，與空白對照組比較，CD206蛋白表達(dá)明顯增多，而iNOS蛋白表達(dá)無顯著變化，見圖6。結(jié)果表明IL-33干預(yù)后誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞向M2型極化。

①與空白對照組比較，t=3.52～3.89，P<0.05。

圖3 IL-33對于巨噬細(xì)胞脂質(zhì)沉積的影響(n=3)

①與空白對照組比較，t=-3.50～-2.36，P<0.05；②與空白對照組比較，t=11.43～12.06，P<0.01。

3 討論

炎性因子IL-33屬于IL-1家族成員，在細(xì)胞或組織初受損時可作為警報素釋放[13]。其可通過與免疫細(xì)胞表面ST2受體結(jié)合誘導(dǎo)免疫細(xì)胞釋放炎性因子[14]，在哮喘、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、免疫性肝損傷等疾病中發(fā)揮重要作用[15-16]。本研究通過IL-33干預(yù)小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)IL-33主要促使細(xì)胞分化為M2型巨噬細(xì)胞，且下調(diào)CES1蛋白表達(dá)水平以及代謝活性，抑制膽固醇酯的代謝，造成細(xì)胞脂質(zhì)累積。

巨噬細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，廣泛存在于身體各組織與器官中，參與體內(nèi)多種生理功能，如維持機(jī)體平衡、促進(jìn)傷口愈合，殺滅外來病原體等。此外，巨噬細(xì)胞在維持機(jī)體代謝平衡的過程中也起到重要作用。巨噬細(xì)胞極化不僅發(fā)生在正常生理條件下，還可貫穿疾病的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)歸的全過程[17-18]。巨噬細(xì)胞極化為M1炎性細(xì)胞或M2抗炎細(xì)胞不僅在炎癥性疾病中發(fā)揮重要作用，也參與了許多代謝性疾病、感染、動脈粥樣硬化、膿毒癥以及癌癥等疾病的病理過程[18]。通過免疫熒光以及RT-PCR檢測巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)，M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD206、IL-10等的表達(dá)顯著升高，而M1型標(biāo)志物iNOS、IL-1β和TNF-α的表達(dá)無顯著變化，表明IL-33刺激使巨噬細(xì)胞向M2型極化，這一結(jié)果與楊笑瑞等[19]研究結(jié)果一致。KUROWSKA-STOLARSKA等[20]研究也發(fā)現(xiàn)在氣管炎中，IL-33協(xié)同IL-13促使巨噬細(xì)胞向M2型極化，誘導(dǎo)Th2型免疫反應(yīng)，加速疾病進(jìn)展。

①與空白對照組比較，t=-4.34～-2.89，P<0.05。

CES1和CES2是研究較為廣泛的Ι相代謝酶，CES1在巨噬細(xì)胞中有較高的表達(dá)。CES1可以調(diào)控巨噬細(xì)胞中膽固醇的攝取及外排，從而減少細(xì)胞中脂質(zhì)堆積。膽固醇的過量累積不僅是動脈粥樣硬化的一大誘因，還將導(dǎo)致肝臟脂肪性病變，而CESs的存在可有效水解膽固醇，緩解疾病[21-22]。氯吡格雷和伊立替康作為CES1和CES2的特異性底物，經(jīng)過水解后其代謝產(chǎn)物的細(xì)胞毒性分別減少和增加，常被用來評價兩種CESs的代謝活性[23]。體外細(xì)胞毒性實驗發(fā)現(xiàn)，不同濃度IL-33處理后，氯吡格雷的細(xì)胞毒性逐步增加，而伊立替康的細(xì)胞毒性依次減少。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)給予IL-33顯著抑制CES1的蛋白表達(dá)和代謝水平。CES2在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)水平較低，IL-33不影響CES2的蛋白表達(dá)水平，卻顯著下調(diào)CES2的代謝活性，這一結(jié)果提示可能存在其他的蛋白相互作用調(diào)控機(jī)制。在明確IL-33下調(diào)巨噬細(xì)胞中CES1的蛋白表達(dá)和代謝活性后，通過檢測巨噬細(xì)胞脂質(zhì)沉積情況發(fā)現(xiàn)，IL-33處理組脂質(zhì)沉積及脂滴面積顯著多于空白對照組。CES1可有效催化水解巨噬細(xì)胞中膽固醇酯，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞中膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)過程，減少細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯的累積。因此，在給予IL-33干預(yù)巨噬細(xì)胞，觀察到CES1的表達(dá)和活性下降后進(jìn)而檢測細(xì)胞中脂質(zhì)累積情況。經(jīng)IL-33處理后的巨噬細(xì)胞中TC、TG以及LDL-C水平均顯著高于空白對照組，結(jié)果表明IL-33下調(diào)CES1的表達(dá)和代謝活性后抑制了CES1水解膽固醇的功能，造成細(xì)胞中膽固醇堆積。巨噬細(xì)胞中CES1的表達(dá)和代謝活性下降直接影響到脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)，以及藥物和毒物的代謝過程，從而影響動脈粥樣硬化患者和其他患者的用藥安全。

圖6 IL-33對RAW264.7細(xì)胞CD206和iNOS蛋白表達(dá)的影響(免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色，n=3)

IL-33作為細(xì)胞因子主要與其受體ST2結(jié)合發(fā)揮作用[24]。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)IL-33處理后巨噬細(xì)胞中ST2表達(dá)顯著增多，因此推測IL-33可能通過ST2受體作用抑制了巨噬細(xì)胞CESs的表達(dá)和代謝活性，但是具體的作用通路還有待未來的深入研究來證實。

本研究表明IL-33顯著抑制巨噬細(xì)胞中CESs的表達(dá)和代謝活性，從而影響細(xì)胞中TC、TG等脂質(zhì)的水解，造成脂質(zhì)累積，因此可能導(dǎo)致脂質(zhì)代謝紊亂和藥物代謝障礙。本研究結(jié)果可為在IL-33大量釋放的炎癥狀態(tài)下，對經(jīng)CESs代謝的藥物的療效和安全性評估，以及動脈粥樣硬化和肥胖患者機(jī)體脂質(zhì)代謝評價具有參考價值。