劉凱雙，閆 研，殷 果，王鐵杰*

（1. 深圳市藥品檢驗(yàn)研究院，廣東 深圳 518057；2. 深圳藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518057）

復(fù)方氨酚葡鋅片是由對(duì)乙酰氨基酚、葡萄糖酸鋅、鹽酸二氧丙嗪和板藍(lán)根浸膏粉組成的中西藥結(jié)合的復(fù)方制劑，具有解熱、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘和抗病毒作用[1]。目前國(guó)內(nèi)共有3家生產(chǎn)企業(yè)，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為3個(gè)國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)[2-4]，國(guó)內(nèi)外藥典均未收載。經(jīng)查詢《中國(guó)藥典》2020年版二部[5]對(duì)乙酰氨基酚及其相關(guān)制劑標(biāo)準(zhǔn)，均有對(duì)氨基酚的檢查項(xiàng)。本品含有對(duì)乙酰氨基酚，但現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)均未對(duì)其特征物質(zhì)對(duì)氨基酚進(jìn)行控制。查詢文獻(xiàn)[6-8]發(fā)現(xiàn)目前缺少中西藥復(fù)方制劑中西藥有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)的相關(guān)研究。復(fù)方氨酚葡鋅片為典型的中西藥結(jié)合復(fù)方制劑，由1個(gè)中藥浸膏成分和3個(gè)西藥成分組成，為了更好控制復(fù)方氨酚葡鋅片質(zhì)量，徹底去除中藥浸膏成分對(duì)對(duì)氨基酚檢測(cè)結(jié)果的干擾，前處理采用乙醇提取、流動(dòng)相稀釋的方法，檢測(cè)采用HPLC檢測(cè)對(duì)氨基酚。本方法經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，回收率、準(zhǔn)確度良好，且專屬性強(qiáng)，靈敏度高，為復(fù)方氨酚葡鋅片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高提供依據(jù)，也為中西藥復(fù)方制劑中有關(guān)物質(zhì)研究提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Ultimate 3000高效液相色譜儀（DAD3000檢測(cè)器，德國(guó)賽默飛）；XS105DU型電子天平。

1.2 試藥

復(fù)方氨酚葡鋅片（成人規(guī)格處方為對(duì)乙酰氨基酚100.0 mg，葡萄糖酸鋅70.0 mg，鹽酸二氧丙嗪1.0 mg，板藍(lán)根浸膏粉250 mg；兒童規(guī)格處方為對(duì)乙酰氨基酚30.0 mg，葡萄糖酸鋅21.0 mg，鹽酸二氧丙嗪0.3 mg，板藍(lán)根浸膏粉75 mg，均由河北恒利集團(tuán)制藥股份有限公司提供），原輔料（由河北恒利集團(tuán)制藥股份有限公司提供），對(duì)氨基酚對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100802-201604，含量：100 %），對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100018-201610，含量：99.9 %）。乙醇、甲醇（色譜純，Merck公司），超純水，醋酸銨為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Waters XBridge C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為0.05 mol/L醋酸銨溶液-甲醇（97:3）；流速1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μl，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算。理論板數(shù)按對(duì)乙酰氨基酚峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000，對(duì)氨基酚和對(duì)乙酰氨基酚峰的分離度應(yīng)符合要求。

2.2 溶液的配制

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 取對(duì)氨基酚對(duì)照品10 mg和對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品25 mg，精密稱定，置入100 ml量瓶，加無(wú)水乙醇適量，振搖使對(duì)氨基酚和對(duì)乙酰氨基酚溶解，加無(wú)水乙醇稀釋至刻度，搖勻。精密量取上述溶液1 ml，置入5 ml量瓶，加無(wú)水乙醇稀釋至刻度，再精密量取上述溶液1 ml，置入10 ml量瓶，加流動(dòng)相稀釋制成每1 ml中分別約含對(duì)氨基酚2 μg和對(duì)乙酰氨基酚5 μg的混合溶液。

2.2.2 供試品溶液 取復(fù)方氨酚葡鋅片20片（兒童規(guī)格30片），精密稱定，研細(xì)，取本品細(xì)粉適量（約相當(dāng)于對(duì)乙酰氨基酚100 mg），精密稱定，置入5 ml量瓶，加無(wú)水乙醇適量，振搖使對(duì)乙酰氨基酚溶解，加無(wú)水乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液。精密量取上述續(xù)濾液1 ml，置入10 ml量瓶，加流動(dòng)相稀釋制成每1 ml中約含對(duì)乙酰氨基酚2 mg的溶液。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 分別按成人規(guī)格和兒童規(guī)格處方和說明書，稱取除對(duì)乙酰氨基酚外的其他主藥、輔料和包衣劑，置入5 ml量瓶，按2.2.2項(xiàng)方法，分別配制陰性對(duì)照溶液（1）和陰性對(duì)照溶液（2）。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 系統(tǒng)適用性與專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取2.2項(xiàng)下制得的混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各10 μl，按上述方法和色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

混合對(duì)照品溶液色譜圖中各色譜峰峰形良好，對(duì)氨基酚和對(duì)乙酰氨基酚之間的分離度為33.39，理論板數(shù)按照對(duì)乙酰氨基酚峰計(jì)算為19304，均符合要求（圖1，B）。

供試品溶液色譜圖中在與對(duì)照品溶液色譜圖中相應(yīng)位置，未檢測(cè)出對(duì)氨基酚峰，只檢測(cè)出對(duì)乙酰氨基酚峰。提取方法和檢測(cè)方法可完全去除中藥成分板藍(lán)根浸膏峰的干擾，基線較平，對(duì)氨基酚峰的保留時(shí)間可延長(zhǎng)至6 min，不受溶劑峰干擾，且與對(duì)乙酰氨基酚峰之間分離度較好（圖1，C～D）。陰性對(duì)照溶液（1）和陰性對(duì)照溶液（2）在兩種主成分相應(yīng)位置處均無(wú)色譜峰出現(xiàn)，表明空白輔料和其他主成分對(duì)主峰無(wú)干擾（圖1，E～F）。

2.3.2 線性試驗(yàn) 精密量取對(duì)氨基酚對(duì)照品的無(wú)水乙醇溶液（20 μg/ml）0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 ml，分別置入10 ml量瓶，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，制成每1 ml含對(duì)氨基酚0.8，1.2，1.6，2.0，2.4，2.8 μg的對(duì)照品溶液。

分別精密吸取上述各濃度對(duì)照品溶液10 μl，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，以對(duì)氨基酚濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得到的線性回歸方程（n=6）為：A=0.5852C+0.0020，r=0.9998。結(jié)果表明，對(duì)氨基酚在0.8～2.8 μg/ml濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 精密量取線性試驗(yàn)項(xiàng)下對(duì)氨基酚對(duì)照品溶液（2.0 μg/ml）10 μl，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄對(duì)氨基酚峰峰面積，對(duì)氨基酚峰峰面積RSD為0.87 %（n=6），結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.3.4 檢測(cè)限和定量限 取2.3.2項(xiàng)中2.0 μg/ml的對(duì)氨基酚對(duì)照品溶液，用流動(dòng)相逐級(jí)稀釋，按上述色譜條件進(jìn)樣10 μl，以信噪比為3:1時(shí)測(cè)得對(duì)氨基酚的最低檢測(cè)濃度為0.05 μg/ml，即最低檢測(cè)限為0.05 μg；以信噪比為10:1時(shí)測(cè)得對(duì)氨基酚的定量檢測(cè)濃度為0.20 μg/ml，即定量限為0.20 μg。

2.3.5 回收率試驗(yàn) 精密稱取樣品細(xì)粉適量（成人規(guī)格、兒童規(guī)格）（相當(dāng)于對(duì)乙酰氨基酚100 mg）共9份，分為3組，分別置入5 ml量瓶，每組加入0.1 mg/ml的對(duì)氨基酚對(duì)照品溶液0.8，1，1.2 ml（各3份），用無(wú)水乙醇稀釋至刻度，搖勻，過濾。分別精密量取上述溶液各1 ml，置入10 ml量瓶，用流動(dòng)相稀釋至刻度，分別制得對(duì)氨基酚濃度為1.6，2.0，2.4 μg/ml的3組加標(biāo)溶液。取上述加標(biāo)溶液，按2.2項(xiàng)色譜條件測(cè)定含量，記錄色譜，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1～2。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）（成人規(guī)格）

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）（兒童規(guī)格）

2.3.6 耐用性試驗(yàn) 取含對(duì)氨基酚2.0 μg/ml成人規(guī)格的和兒童規(guī)格的供試品加標(biāo)溶液，另取兩根250 mm（4.6 mm×250 mm，5 μm）的色譜柱（Phenomenex Kinetex C18、Agilent ZORBAX SBAq C18）和兩根150 mm（4.6 mm×250 mm，5 μm）的色譜柱（Phenomenex Luna C18、Waters SunFire C18），分別精密吸取供試品加標(biāo)溶液和對(duì)照品溶液各10 μl按2.2項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。

在更換色譜柱后，對(duì)氨基酚峰的保留時(shí)間變化范圍較大，約4.763～7.817 min。在不同色譜柱上，僅對(duì)流動(dòng)相組成比例（分別考察95:5和98:2兩個(gè)比例）與柱溫（分別考察25和35 ℃）稍作調(diào)整，對(duì)氨基酚峰均可與其他峰分離良好（分離度＞1.5），分離效果、理論板數(shù)均符合要求，表明系統(tǒng)耐用性較好。供試品加標(biāo)溶液色譜圖見圖2～3。

圖2 供試品加標(biāo)溶液色譜圖（成人規(guī)格）

圖3 供試品加標(biāo)溶液色譜圖（兒童規(guī)格）

2.4 樣品含量測(cè)定

取成人規(guī)格2批和兒童規(guī)格1批的的復(fù)方氨酚葡鋅片，依法制備供試品溶液。精密量取各溶液10 μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算對(duì)氨基酚的含量。結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=2）

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇和干擾峰溯源

本研究分別考察了《中國(guó)藥典》2020年版二部[5]對(duì)乙酰氨基酚有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)項(xiàng)及其相關(guān)制劑標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)氨基酚檢查項(xiàng)下的色譜條件，經(jīng)調(diào)整流動(dòng)相比例發(fā)現(xiàn)，以0.05 mol/ml醋酸銨溶液-甲醇（97:3）為流動(dòng)相和溶劑時(shí)對(duì)氨基酚色譜峰分離較好，對(duì)氨基酚峰的出峰時(shí)間可延長(zhǎng)至6 min（圖4），但對(duì)氨基酚峰受其他峰干擾嚴(yán)重，達(dá)不到基線分離，經(jīng)干擾峰溯源發(fā)現(xiàn)，干擾峰均來(lái)自復(fù)方氨酚葡鋅片處方成分之一板藍(lán)根浸膏粉（圖5）。

圖4 對(duì)氨基酚對(duì)照品（A）和供試品溶液（B）色譜圖（以流動(dòng)相為溶劑）

圖5 板藍(lán)根浸膏溶液色譜圖（以流動(dòng)相為溶劑）

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

本研究使用紫外分光光度法對(duì)對(duì)氨基酚對(duì)照品溶液在190～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。結(jié)果表明，對(duì)氨基酚在230nm處有較好的吸收，故選擇230 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 提取溶劑的選擇

復(fù)方氨酚葡鋅片是由1個(gè)中藥浸膏成分和3種西藥成分共同組成的復(fù)方制劑，由于中藥成分的復(fù)雜性，且處方中板藍(lán)根浸膏占比較大，對(duì)氨基酚是對(duì)乙酰氨基酚的特殊雜質(zhì)，含量較低，上述問題給對(duì)氨基酚的檢出帶來(lái)較大困難。實(shí)驗(yàn)表明，主要干擾來(lái)源于板藍(lán)根浸膏（圖5），為了去除板藍(lán)根浸膏的干擾，查詢板藍(lán)根浸膏的制備工藝可知，板藍(lán)根浸膏是采用“水提醇沉（60 %乙醇）”法制備。本研究嘗試用60 %乙醇和無(wú)水乙醇作為提取溶劑，結(jié)果表明，以無(wú)水乙醇為提取溶劑時(shí)，可完全去除板藍(lán)根浸膏的干擾（圖1，C～D）。

3.4 樣品制備方法和進(jìn)樣體積的選擇[9-10]

以無(wú)水乙醇作為提取溶劑，可完全去除板藍(lán)根浸膏的干擾，但對(duì)氨基酚對(duì)照品峰由于溶劑作用，出現(xiàn)肩縫。當(dāng)以流動(dòng)相作為對(duì)氨基酚對(duì)照品的溶劑時(shí)，對(duì)氨基酚峰峰形良好，故采用先用無(wú)水乙醇提取以去除其他峰的干擾，再用流動(dòng)相稀釋的方法制備對(duì)照品溶液和供試品溶液。經(jīng)考察，用無(wú)水乙醇提取后，再用流動(dòng)相稀釋時(shí)，將對(duì)照品溶液和供試品溶液中的乙醇濃度控制在10 %以下，進(jìn)樣量為10 μl時(shí)，不僅可以去除供試品中板藍(lán)根浸膏峰的干擾（圖1，C～D），同時(shí)也可使對(duì)氨基酚峰峰形良好（圖6A，圖7A）。

圖6 不同乙醇終濃度對(duì)氨基酚對(duì)照品溶液色譜圖（A：10 %，B：20 %）

圖7 不同進(jìn)樣體積對(duì)氨基酚對(duì)照品溶液色譜圖（A：10 μl，B：20 μl）

4 小結(jié)

綜上所述，本研究建立的復(fù)方氨酚葡鋅片中有關(guān)物質(zhì)對(duì)氨基酚的HPLC檢查法，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，本法具有前處理簡(jiǎn)便、快捷、方法準(zhǔn)確的特點(diǎn)，且靈敏度高，適用于復(fù)方氨酚葡鋅片中對(duì)氨基酚檢測(cè)，有利于復(fù)方氨酚葡鋅片的質(zhì)量控制。