張蒙蒙， 梁俊陽， 王清福， 都亞飛， 張潔，劉前進， 彭建斐， 付博

(1.河南農(nóng)業(yè)大學煙草學院，河南 鄭州 450002；2.河南中煙工業(yè)有限責任公司技術中心，河南 鄭州 450016；3.湖南省煙草公司懷化市公司, 湖南 懷化市 418000；4.河南省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，河南 鄭州 450002)

煙草黑脛病是由煙草寄生疫霉(Phytophthoranicotianae)引起的一種土傳性病害，又叫做“黑根病”“黑稈瘋”[1]。該病害遍布中國的各大煙區(qū)，年均經(jīng)濟損失達1億元以上[2]，是煙草農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的毀滅性病害之一[3]，生產(chǎn)上需要一種安全有效的防控方法[4]?；瘜W藥劑是防治煙草黑脛病的的常用手段，但長期大量施用化學藥劑易產(chǎn)生抗藥性、對環(huán)境以及人體健康造成嚴重危害[5-6]。隨著人們對煙葉安全性和生態(tài)安全的日益關注，煙草黑脛病的生物防治(以下簡稱“生防”)越發(fā)重要，逐步成為煙草病害綠色防控的重要措施之一[7-8]。

生防細菌具有生活周期短、繁殖力高、代謝產(chǎn)物豐富、對病原菌作用方式多樣、易于定殖等特點，是尤其重要的一類植物病害生防資源[9]。目前，已經(jīng)有一部分生防細菌應用于煙草黑脛病的生物防治中。羅玉英等[10]從煙草根際土壤中篩選到了對煙草疫霉有明顯拮抗能力的2株解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)和1株枯草芽孢桿菌菌(Bacillussubtilis)，3株生防菌灌根處理對煙草黑脛病的田間防效分別達到70.1%、63.5%和60.2%。尹堅等[11]對湖南煙區(qū)黑脛病重發(fā)田根際土壤樣品進行富集培養(yǎng)，篩選出195個對煙草黑脛病有拮抗效果的細菌菌群，其中B44R菌群對煙草黑脛病的田間防效達到51.56%。何明川等[12]從昆蟲腸道中分離到對煙草疫霉具有有較好拮抗效果的枯草芽孢桿菌MC4-2菌株，通過對峙試驗發(fā)現(xiàn)該菌對煙草疫霉菌絲的抑制率可達到64.04%。張幸博等[13]通過平板對峙試驗從煙草根際土壤中篩選到的煙草節(jié)桿菌(Arthrobacternicotianae)LG-3菌株，對煙草苗期黑脛病的防效達85.59%。前人的試驗結果表明，拮抗細菌對煙草黑脛病具有較好的應用潛力，但是目前被開發(fā)成商品制劑的菌株較少，只有枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)等被開發(fā)成產(chǎn)品并運用到煙草黑脛病的防治中，大大限制了生防菌的應用和推廣。為創(chuàng)新煙草黑脛病的生防資源，本試驗對前期分離到的2株生防菌進行種類鑒定和防治效果測定，以期為煙草黑脛病的綠色防控奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株：供試生防細菌為YCYM-04、YCYM-09，由河南農(nóng)業(yè)大學煙草工程實驗室從湖南懷化煙草黑脛病病株根際土壤中分離、篩選獲得；煙草黑脛病病原菌煙草疫霉(Phytophthoranicotianae)由河南農(nóng)業(yè)大學煙草工程實驗室分離和保存。

供試培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，蒸餾水定容至1 L，分裝121 ℃滅菌20 min；

NA培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂18 g, 蒸餾水定容至1 L，分裝121 ℃滅菌20 min。

NB培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸餾水定容至1 L，分裝121 ℃滅菌20 min。

小米培養(yǎng)基：小米煮熟晾干，裝入三角瓶中高壓滅菌30 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 生防菌株的鑒定 挑取YCYM-04和YCYM-09菌株單菌落在NA培養(yǎng)基上畫線，30 ℃培養(yǎng)16～48 h，觀察菌落特征并進行革蘭氏染色和掃描電鏡觀察，觀察其菌體大小、形狀、有無芽生孢子。根據(jù)《伯杰氏細菌鑒定手冊》[14]對2株菌株進行生理生化特征測定。利用CTAB法提取YCYM-04和YCYM-09菌株的基因組DNA，采用細菌16 S通用引物27-F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)/1492-R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)擴增其序列。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后克隆測序，將測序所得的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫進行Blast對比分析，并運用CLUSTAL X軟件進行多序列比對和系統(tǒng)進化分析軟件MEGA 6.0當中的Neighbor-Joining算法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2 生防菌株對煙草疫霉的抑制效果測定 將煙草疫霉在PDA培養(yǎng)基上活化5 d后，取煙草疫霉菌餅(直徑為5 mm)倒置接種于PDA平板中央，分別挑取YCYM-04和YCYM-09菌株單菌落對稱兩點接在距離菌餅2.5 cm處，以只接煙草疫霉的平板作為對照，3次重復，倒置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后，測算抑菌帶大小，即真菌邊緣與細菌中心點之間的距離。

測定YCYM-04和YCYM-09菌株發(fā)酵濾液對煙草疫霉的抑菌活性。分別挑取生防細菌的單菌落接種于100 mL的NB培養(yǎng)基，30 ℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)48 h得培養(yǎng)液，將培養(yǎng)液8 000 r·min-1室溫離心5 min，取上清液用0.22 μm濾膜濾除菌體，得到發(fā)酵濾液。將濾液與PDA培養(yǎng)基分別按V(濾液)∶V(培養(yǎng)基)=1∶4、1∶9和1∶99混合均勻制成平板，取直徑為5 mm的煙草疫霉餅接種于平板中央，以加無菌水的PDA平板為對照，每處理3個重復，培養(yǎng)7 d后用十字交叉法測量菌落直徑，計算菌落生長抑制率，同時顯微觀察YCYM-04和YCYM-09發(fā)酵液對煙草疫霉菌絲形態(tài)結構的影響。菌落生長抑制率=(對照菌落直徑-處理菌落直接)/對照菌落直徑×100%。

1.2.3 生防菌株對煙草疫霉的室內(nèi)防治效果 分別挑取YCYM-04和YCYM-09的單菌落接種于100 mL的NB培養(yǎng)基，30 ℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)至OD600為0.8～1.0，得生防細菌培養(yǎng)液。將活化好的煙草疫霉打成菌餅，每100 mL小米培養(yǎng)基接種4塊，于25 ℃培養(yǎng)20 d得煙草疫霉小米培養(yǎng)物。將m(土)∶m(草炭)=3∶1的比例混合均勻，在烘箱內(nèi)160 ℃滅菌2 h得無菌基質。取長勢一致的5～6片真葉煙苗移栽于無菌基質中，緩苗3 d后，將YCYM-04和YCYM-09培養(yǎng)液20 mL·株-1灌根處理，每3 d灌根1次，共灌根3次，第3次灌根24 h后接種煙草疫霉，用刀片在煙苗莖基部劃3 mm傷口，然后接種煙草疫霉小米培養(yǎng)物(3 g·株-1)，接種后立即覆土保濕，在25 ℃，12 h光照與12 h黑暗交替條件下培養(yǎng)。以等量無菌的NB培養(yǎng)基作為空白對照，另設40%三乙膦酸鋁灌根處理作為藥劑對照，緩苗3 d后每株煙苗1 g·株-1灌根處理，間隔10 d再灌根1次，共灌根2次，每處理10株煙苗，3次重復。接種20 d后調(diào)查發(fā)病情況，煙草黑脛病分級標準參照中華人民共和國國家標準(GB/T 23222—2008)，計算病情指數(shù)和防治效果。病情指數(shù)=100×∑(各病情分級×該病級的發(fā)病株數(shù))/分級標準中最高級別數(shù)×調(diào)查總株數(shù)，防治效果=(對照組病情指數(shù)-處理組病情指數(shù))/對照組病情指數(shù)×100%。

2 結果與分析

2.1 生防菌株的分類鑒定

YCYM-04菌株在NA培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后，菌落呈淡黃綠色且不透明，表面光滑，邊緣規(guī)則，有黏性；革蘭氏染色陰性，菌體呈短桿狀，大小為2.58 μm×0.28 μm(圖1)。生理生化測定結果顯示，YCYM-04菌株能夠產(chǎn)生過氧化氫酶和蛋白酶、水解吐溫80、液化明膠、胨化牛奶、還原硝酸鹽，并且能利用葡萄糖、麥芽糖、乳糖、木糖、甘露糖和蔗糖(表1)。將YCYM-04菌株的16 S rDNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫比對分析，結果顯示，YCYM-04與嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)的相似性最高。系統(tǒng)發(fā)育樹結果也顯示，YCYM-04菌株與嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(S.maltophilia)處于同一分支(圖2)，結合該菌株的形態(tài)學和生理生化特征，將YCYM-04菌株鑒定為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(S.maltophilia)。

注：A,菌落；B,革蘭氏染色特征；C,菌體。

圖2 YCYM-04菌株基于16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

表1 YCYM-04菌株的生理生化特征

YCYM-09菌株在NA培養(yǎng)基上培養(yǎng)16 h后，菌落乳白色且不透明、表面粗糙、邊緣不規(guī)則，革蘭氏染色陽性，菌體呈短桿狀，大小為3.26 μm×0.63 μm(圖3)。生理生化測定結果顯示，YCYM-09菌株能夠液化明膠、水解淀粉,利用檸檬酸鹽，并且能利用葡萄糖、麥芽糖、乳糖、木糖、蔗糖、甘露醇和山梨醇(表2)。將YCYM-09菌株的16S rDNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫比對分析，結果顯示，YCYM-09菌株與貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)相似性最高。系統(tǒng)發(fā)育樹結果也顯示，YCYM-09菌株與貝萊斯芽孢桿菌(B.velezensis)親緣關系最近(圖4)，結合該菌株的形態(tài)學和生理生化特征，將YCYM-09菌株鑒定為貝萊斯芽孢桿菌(B.velezensis)。

表2 YCYM-09菌株的生理生化特征

注：A，菌落；B，革蘭氏染色特征；C，菌體。

圖4 YCYM-09菌株基于16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 生防菌株對煙草疫霉的抑制效果測定

對峙培養(yǎng)結果顯示，YCYM-04菌株和YCYM-09菌株與煙草疫霉對峙培養(yǎng)7 d后，抑菌帶分別達13.7和8.9 mm(圖5-B、C)。另外，不同稀釋倍數(shù)的YCYM-04菌株和YCYM-09菌株發(fā)酵濾液在PDA平板中對煙草疫霉的菌絲生長均有明顯的抑制作用，其中YCYM-04菌株5倍稀釋液的菌落抑制率達到71.8%，10倍稀釋液的菌落抑制率為63.5%，100倍稀釋液的菌落抑制率為34.1%(圖5-G)。YCYM-09菌株的對煙草疫霉的菌落抑制率分別為：5倍稀釋液50.6%，10倍稀釋液36.5%，100倍稀釋液22.4%(圖5-H)。

利用顯微鏡觀察YCYM-04菌株和YCYM-09菌株發(fā)酵濾液對煙草疫霉菌絲形態(tài)的影響，與YCYM-04菌株對峙培養(yǎng)后，煙草疫霉菌絲節(jié)間縮短、斷裂、生長緩慢(圖5-E)，與YCYM-09菌株對峙培養(yǎng)后，煙草疫霉菌絲體膨大增粗、畸形、原生質體凝結等現(xiàn)象(圖5-F)，而對照菌絲表面光滑、粗細均勻、生長點正常(圖5-D)。

注：A,煙草疫霉菌落對照；B、C,YCYM-04菌株和YCYM-09菌株與煙草疫霉的對峙培養(yǎng)；D,對照平板上的煙草疫霉菌絲；E、F,YCYM-04菌株和YCYM-09菌株對煙草疫霉菌絲形態(tài)的影響；G、H,不同稀釋倍數(shù)的YCYM-04和YCYM-09發(fā)酵濾液對煙草疫霉生長的影響。

2.3 生防菌株對煙草疫霉的盆栽防效測定

室內(nèi)盆栽結果(表3)可以看出，與對照相比，YCYM-04和YCYM-09菌株灌根處理均能顯著降低煙草黑脛病的病情指數(shù)，防治效果分別達50.5%和61.5%。其中YCYM-09菌株灌根處理的病情指數(shù)為23.3，化學藥劑三乙膦酸鋁灌根處理的病情指數(shù)為19.7，二者沒有顯著性差異，此外，YCYM-04菌株灌根處理也接近三乙膦酸鋁灌根處理的防治效果。由此可見，YCYM-04菌株和YCYM-09菌株在煙草黑脛病的防治中具有潛在的應用價值。

表3 生防細菌對煙草黑脛病的室內(nèi)防治效果

3 結論與討論

隨著人們對煙葉安全性的日益關注以及農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略的提出，生物防治成為實現(xiàn)綠色防治煙草病害的重要措施[15]。為創(chuàng)新煙草黑脛病的生防資源，本研究對前期從煙草黑脛病病株根際土壤中分離的YCYM-04和YCYM-09菌株進行種類鑒定，將其分別鑒定為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)和貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)，并進行防效測定，豐富了煙草黑脛病的生防菌庫。

嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌是一類重要的根際促生菌，目前已被應用于小麥赤霉病[16]、棉花黃萎菌[17]、馬鈴薯青枯病[18]、草莓炭疽病[19]等多種植物真菌病害的生物防治中，但是目前鮮有利用嗜麥芽寡養(yǎng)單孢菌防治煙草黑脛病的報道。JIN等[20]利用平板對峙法從煙草根際土壤樣品分離到一株對煙草疫霉具有拮抗作用的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌，但其沒有進一步研究該菌株在土壤中對煙草黑脛病的防治效果。有研究表明，離體條件下生防菌抑制病原菌的能力與其在活體上抑制病原菌所致病害的能力可能存在一定差異[21]，外源生防菌株在活體或環(huán)境中有效定殖才能穩(wěn)定發(fā)揮作用效果[22]。本研究中，嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌YCYM-04菌株不僅在離體條件下具有較強的抑菌作用，細菌培養(yǎng)液灌根處理對煙草黑脛病的室內(nèi)防治效果也達50.5%。說明該菌株能夠在土壤中定植并發(fā)揮防效，具有一定的生防潛力。

貝萊斯芽孢桿菌是一種與枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、解淀粉芽胞桿菌(B.amyloliquefaciens)親緣性很高的細菌[23]，其中枯草芽孢桿菌和解淀粉芽胞桿菌已被廣泛用于煙草黑脛病的生物防治中[24-25]，但是目前利用貝萊斯芽孢桿菌防治煙草黑脛病的報道較少。李苗苗等[26]報道,將貝萊斯芽孢桿菌GY1與解淀粉芽孢桿菌GY10和枯草芽孢桿菌GY12進行復配能夠提高對煙草黑脛病的防治效果。而本研究中貝萊斯芽孢桿菌YCYM-09菌株灌根處理對煙草黑脛病的室內(nèi)防效與化學藥劑三乙膦酸鋁灌根處理的防效無顯著性差異，說明貝萊斯芽孢桿菌YCYM-09菌株具有較好的開發(fā)利用潛力。

植物病害的生防細菌通過產(chǎn)生抑菌物質、誘導植物抗性、種群競爭等多種方式發(fā)揮生防效果[27]。學者發(fā)現(xiàn)，嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌不僅能產(chǎn)生多種抑菌活性物質，如幾丁質酶、蛋白酶、脂酶和葡聚糖[28]，還能分泌抗菌素類次生代謝產(chǎn)物如Xanthobaccin及Maltophilin[29-30]。芽孢桿菌也能夠產(chǎn)生多種抑菌蛋白和脂肽類抗生素[31]，并能促進作物生長并誘導植株系統(tǒng)抗性[32-33]。但目前尚未有嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌和貝萊斯芽孢桿菌對煙草疫霉作用機制研究的報道。本研究發(fā)現(xiàn)，YCYM-04和YCYM-09發(fā)酵液對煙草疫霉具有較強的抑制作用，使煙草疫霉菌絲形態(tài)發(fā)生明顯變化，YCYM-04造成煙草疫霉菌絲節(jié)間縮短、斷裂、生長緩慢， YCYM-09造成煙草疫霉菌絲體膨大增粗、畸形、原生質體凝結。今后尚需對YCYM-04和YCYM-09菌株產(chǎn)生的抑菌物質成分進行深入研究。

室內(nèi)抑菌測定結果顯示，嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌YCYM-04菌株及其發(fā)酵液的抑菌能力優(yōu)于貝萊斯芽孢桿菌YCYM-09菌株，而盆栽試驗中貝萊斯芽孢桿菌YCYM-09灌根處理對煙草黑脛病的防治效果高于嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌YCYM-04菌株，推測其可能與芽孢桿菌具有較強的定殖能力及環(huán)境適應能力有關。下一步將驗證這兩株生防菌株對煙草黑脛病的田間防治效果，以期為煙草黑脛病的綠色防治提供依據(jù)。