邱琪琪，王聰珂，張陽，王夢珂，趙特，周琳，汪梅子

(河南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院/河南省新型農(nóng)藥創(chuàng)制與應用重點實驗室/河南省綠色農(nóng)藥創(chuàng)制工程技術研究中心，河南 鄭州 450002)

液泡型ATP酶(vacuolar-type proton ATPase，V-ATP酶)定位在不同的膜中，能與離子通道和轉運體結合維持適合所有真核細胞內膜隔室生化功能的pH環(huán)境，并激活許多不同的傳輸過程[1]。維持pH穩(wěn)態(tài)對許多生理生化過程至關重要，包括細胞內的膜運輸、激素原處理和神經(jīng)遞質運輸，以及許多病毒進入細胞等。V-ATP酶是多亞基復合酶，由胞質內介導ATP水解的V1結構域和結合在膜上介導質子轉移的V0結構域組成[2]。外周V1結構域包含至少8種分子質量為13～70 kD的不同亞基(亞基A～H)，V0結構域包含6個分子質量17～100 kD的不同亞基(亞基a、c、c’、c”、d和e)[3]。V-ATP酶具有高度保守性，在真核細胞中通常位于質膜或酸性細胞器的膜中[4]。在許多昆蟲的上皮細胞中，V-ATP酶分子大量存在于頂膜中產(chǎn)生一個電化學質子梯度，用于細胞外空間的酸化或堿化、離子和液體的分泌或重吸收、營養(yǎng)物質的輸入、以及各種其他細胞活動[5]。

昆蟲中活躍的跨上皮陽離子轉運最初是在馬氏管中被發(fā)現(xiàn)的，隨后也在其他上皮中發(fā)現(xiàn)，如唾液腺、唇腺、中腸和感覺器，參與調節(jié)pH穩(wěn)態(tài)[6]。昆蟲的馬氏管是排泄器官，作為運輸組織當受到刺激時可以用比任何其他已知組織都要高的速度運輸水和離子，這是由位于管腔細胞膜上的V-ATP酶驅動的[7]。V-ATP酶在昆蟲其它組織中可能還發(fā)揮著其它重要作用。在黑腹果蠅Drosophilamelanogaster體內，位于復眼光感受器的V-ATP酶對兩類板間神經(jīng)元L1和L2的大小和形狀進行了晝夜節(jié)律的周期性調節(jié)[8]。除此之外，V-ATP酶很可能參與了一部分信號通路的運行。在果蠅中，V-ATP酶不僅可以促進溶酶體中Notch配體的降解，而且促進核內體中Notch信號的激活[9]。在經(jīng)過siRNAs靶向V-ATP酶的2個亞基(ATP6V1C2和ATP6V0C)處理的細胞中，Wnt信號通路的受體LRP6的磷酸化被抑制，這些結果表明Wnt信號通路的激活需要V-ATP酶的活性[10]。因其重要性，V-ATP酶被看作害蟲防治的潛在分子靶標。

草地貪夜蛾屬于世界性重大農(nóng)業(yè)害蟲，目前已有100多個國家受到了嚴重危害。草地貪夜蛾具有寄主范圍廣泛、多蟲態(tài)共存、遷飛速度快、繁殖能力強和抗藥性強等特點[11-12]。中國玉米種植廣泛，草地貪夜蛾可能隨著氣候變遷及玉米播種時期不同進行遷移危害[13]。為探索草地貪夜蛾V-ATP酶V1結構域E、F、G和H亞基對草地貪夜蛾生長發(fā)育的影響，本研究采用PCR技術克隆了草地貪夜蛾V-ATP酶V1結構域的4個亞基(E～H)基因序列，通過實時熒光定量PCR技術測定了其在草地貪夜蛾不同發(fā)育階段的表達動態(tài)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試昆蟲：草地貪夜蛾在溫度(26 ± 1)℃、光照周期L/D=14 h/10 h、相對濕度60%～85%的室內條件下人工飼養(yǎng)。幼蟲飼料的主要成分為玉米粉及玉米葉粉，成蟲用10%蜂蜜水補充營養(yǎng)。

試劑：TRIzol試劑，美國Invitrogen公司；2×Es Taq Master Mix、大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細胞，北京莊盟國際生物基因科技有限公司；質粒DNA提取試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；DNA凝膠回收試劑盒、PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit，日本TaKaRa公司；PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix，賽默飛世爾科技(中國)有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

儀器：DYY-6C電泳儀，北京六一儀器廠；In-GeniusLHR凝膠成像系統(tǒng)，美國Syngene公司；QuantStudio 3 Real-Time PCR System，美國ABI公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取與cDNA合成 收集草地貪夜蛾卵、1～6齡整頭幼蟲、雌蛹、雄蛹、雌成蟲、雄成蟲備用，每個時期1個生物學重復,所用的草地貪夜蛾數(shù)量分別為卵100粒，1齡40頭，2齡30頭，3齡15頭，4齡、5齡各5頭，6齡、雌雄蛹和雌雄成蟲各3頭。所有樣品均設3次生物學重復。采用Trirol法提取各個齡期的RNA，取用適量RNA分別檢測濃度，并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測是否降解，剩余放置在-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。cDNA模板的合成參考PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit說明書進行。

1.2.2 RT-PCR反應 從草地貪夜蛾轉錄組中獲得V-ATP酶亞基的核苷酸序列，利用Primer Pre-mier 6.0軟件設計出V-ATP酶V1結構域E、F、G和H亞基基因的4對引物(表1)。PCR采用50 μL體系：1.1×T3 Super PCR Mix 44 μL，10 μmol·L-1正向引物和反向引物各2 μL，cDNA模板2 μL。反應條件為：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸20 s，30個循環(huán)； 72 ℃延伸2 min；4 ℃保存。根據(jù)凝膠回收試劑盒說明書回收純化PCR產(chǎn)物，將收集得到的PCR產(chǎn)物按照pClone007 Versatile Simple Vector Kit說明書進行目的片段連接，隨后將連接產(chǎn)物轉化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆并提取質粒DNA測序。引物合成及測序工作均委托鄭州擎科生物有限公司完成。

表1 RT-PCR及qRT-PCR反應所用引物序列

1.2.3 序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構建 對測序結果進行分析拼接后獲得全長序列。使用NCBI的BLAST程序對V-ATP酶E～H亞基基因在不同物種間的同源性進行對比分析；用DNAMAN軟件分析各個亞基基因的一致性；用MEGA X軟件分析各個亞基與其他物種之間的進化關系；利用在線軟件ExPASy-ProtParam tool進行各個亞基分子量、等電點等理化性質的分析；利用在線軟件ExPASy-ProtScale tool進行各個亞基蛋白質的親水性和疏水性分析。利用Pfam在線預測軟件(http://pfam.janelia.org/search)對各個亞基蛋白結構域進行分析。

1.2.4 熒光定量RT-PCR分析 根據(jù)河南省新型農(nóng)藥創(chuàng)制與應用重點實驗室已克隆出的草地貪夜蛾V-ATP酶E～H 4個亞基基因的序列全長設計出符合要求的4對特異性引物(表1)。為了消除樣本量差異，以GAPDH基因作為內參基因[14]。

熒光定量PCR采用20 μL體系，各反應成分的含量為：PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix (2X) 10 μL，10 μmoL·L-1的正向和反向引物各2 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 5 μL。反應條件為：50 ℃ 2 min，95 ℃2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)；溶解曲線95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，0.15 ℃·s-1升溫至95 ℃持續(xù)15 s。每個樣品設置3個技術重復，反應結束后收集Ct值。采用2-△△Ct法計算相對表達量，以表達量最低的樣品為基準進行定量分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，應用HSD法進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 核苷酸序列分析

通過特異性引物PCR擴增出編碼草地貪夜蛾V-ATP酶V1結構域E～H 4個亞基的開放閱讀框。E亞基的開放閱讀框長度為681 bp，編碼226個氨基酸，預測分子質量和等電點分別為55.5 kD和5.11，GenBank登錄號為MT707618。E亞基基因編碼的蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為40.97，屬不穩(wěn)定蛋白，蛋白親疏水性預測顯示為親水性。該蛋白僅有一個保守結構域，即位于18～216的V-ATP酶E亞基結構域(圖1)。

注：黑色表示高度保守的氨基酸，圖2～4同。序列上方橫線標注的是保守結構域：V-ATP酶E亞基結構域(FIE至ALF)。草地貪夜蛾：MT707618；斜紋夜蛾：XP_022815239.1；棉鈴蟲：XP_021191658.1；粉紋夜蛾：XP_026735678.1；家蠶：NP_001040451.1；夏威夷紅蛺蝶：XP_026497418.1；野桑蠶：XP_028025362.1；煙草天蛾：XP_030031453.1；亞洲玉米螟：XP_028179329.1。

F亞基開放閱讀框序列長375 bp，編碼124個氨基酸，預測分子質量和等電點分別為30.8 kD和5.24，GenBank登錄號為MT707619。F亞基基因編碼的蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為53.33，屬不穩(wěn)定蛋白，蛋白親疏水性預測顯示為親水性。該蛋白僅有一個位于12～113的V-ATP酶F亞基的保守結構域(圖2)。

注：序列上方橫線標注的是保守結構域：V-ATP酶F亞基結構域(ISV至LRR)。草地貪夜蛾：MT707619；斜紋夜蛾：XP_022825205.1；偏瞳蔽眼蝶：XP_023948003.1；夏威夷紅蛺蝶：XP_026496172.1；家蠶：NP_001040448.1；臍橙螟：XP_013184521.1；粉紋夜蛾：XP_026737139.1；玉帶鳳蝶：NP_001298649.1；亞洲玉米螟：XP_028157779.1。

G亞基基因開放閱讀框序列長354 bp，編碼117個氨基酸，預測分子質量和等電點分別為27.7 kD和5.26，GenBank登錄號為MT707620。G亞基基因編碼的蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為44.68，屬不穩(wěn)定蛋白，蛋白親疏水性預測顯示為親水性。該蛋白僅有一個保守結構域，即位于3～107的V-ATP酶G亞基結構域(圖3)。

注：序列上方橫線標注的是保守結構域：V-ATP酶G亞基結構域(SQT至DIK)。草地貪夜蛾：MT707620；斜紋夜蛾：XP_022818379.1；棉鈴蟲：XP_021188551.1；亞洲玉米螟：XP_028164911.1；夏威夷紅蛺蝶：XP_026494470.1；柑橘鳳蝶：NP_001299749.1；家蠶：NP_001040287.1；阿芬眼蝶：XP_034825880.1；野桑蠶：XP_023934297.1。

H亞基基因開放閱讀框序列長1 452 bp，編碼483個氨基酸，預測分子質量和等電點分別為118.2 kD和4.96，GenBank登錄號為MT707621。H亞基基因編碼的蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為41.01，屬不穩(wěn)定蛋白，蛋白親疏水性預測顯示為親水性。H亞基蛋白具有2個保守結構域，分別是位于28～328和334～450的V-ATP酶F亞基N端結構域和C端結構域(圖4)。

注：序列上方橫線標注的是保守結構域：N端結構域(VLQ至ERL)和C端結構域(LSS至RNW)。草地貪夜蛾：MT707621；斜紋夜蛾：XP_022822595.1；粉紋夜蛾：XP_026726220.1；煙草天蛾：XP_030040379.1；大蠟螟：XP_026756478.1；家蠶NP_001040488.1；亞洲玉米螟：XP_028168669.1；夏威夷紅蛺蝶：XP_026497418.1；柑橘鳳蝶：XP_013180033.1；菜粉蝶：XP_022129728.1。

2.2 氨基酸序列同源性分析

草地貪夜蛾V-ATP酶E亞基與其他8種昆蟲E亞基的氨基酸序列同源性分析結果顯示，草地貪夜蛾V-ATP酶E亞基與斜紋夜蛾S.litura和棉鈴蟲H.armigera的V-ATP酶E亞基氨基酸同源性分別為97.8%和91.6%。通過多重序列比對發(fā)現(xiàn)不同物種間該基因編碼氨基酸序列的差異少且分散。系統(tǒng)發(fā)育樹結果顯示(圖5)，草地貪夜蛾與斜紋夜蛾、棉鈴蟲聚集在同一進化分支上，有較高同源性。

圖5 不同物種間V-ATP酶E亞基系統(tǒng)發(fā)育進化樹

草地貪夜蛾V-ATP酶F亞基與其他8種昆蟲F亞基的氨基酸序列同源性分析結果顯示，草地貪夜蛾V-ATP酶F亞基與斜紋夜蛾的V-ATP酶F亞基氨基酸源性高達98.4%。通過多重序列比對發(fā)現(xiàn)不同物種間該基因編碼氨基酸序列的差異不明顯。系統(tǒng)發(fā)育樹結果顯示(圖6)，草地貪夜蛾與斜紋夜蛾聚集在同一進化分支上，有較高同源性。

圖6 不同物種間V-ATP酶F亞基系統(tǒng)發(fā)育進化樹

草地貪夜蛾V-ATP酶G亞基與其他8種昆蟲G亞基的氨基酸序列同源性分析結果顯示，草地貪夜蛾V-ATP酶G亞基與斜紋夜蛾、棉鈴蟲的V-ATP酶G亞基氨基酸同源性高達99.1%、96.6%。通過多重序列比對發(fā)現(xiàn)不同物種間該基因編碼氨基酸序列前70位完全保守，差異主要存在于中間80～100位。系統(tǒng)發(fā)育樹結果顯示(圖7)，草地貪夜蛾與斜紋夜蛾、棉鈴蟲聚集在同一進化分支上，有較高同源性。

圖7 不同物種間V-ATP酶G亞基系統(tǒng)發(fā)育進化樹

草地貪夜蛾V-ATP酶H亞基與其他8種昆蟲H亞基的氨基酸序列同源性分析結果顯示，草地貪夜蛾V-ATP酶H亞基與斜紋夜蛾的V-ATP酶H亞基氨基酸同源性高達96.8%。通過多重序列比對發(fā)現(xiàn)不同物種間該基因編碼氨基酸序列的差異少且分散。系統(tǒng)發(fā)育樹結果顯示(圖8)，草地貪夜蛾與斜紋夜蛾聚集在同一進化分支上，有較高同源性。

圖8 不同物種間V-ATP酶H亞基系統(tǒng)發(fā)育進化樹

2.3 草地貪夜蛾不同發(fā)育階段V-ATP酶E～H亞基表達量分析

V-ATP酶E亞基基因在草地貪夜蛾整個發(fā)育階段均有表達(圖9)。其中在雄蛹中表達量最低，在雄成蟲中高量表達，為雄蛹的12.44倍。另外，在1齡幼蟲、4齡幼蟲和雌性成蟲中都有較高量的表達，這三者之間無顯著差異。在雌蛹中表達量為雄蛹的1.27倍，兩者無顯著差異，均處于低水平。不同發(fā)育階段中的相對表達量由高到低依次為雄成蟲>1齡幼蟲>6齡幼蟲>4齡幼蟲>2齡幼蟲>雌成蟲>3齡幼蟲>5齡幼蟲>卵>雌蛹>雄蛹。

注：數(shù)據(jù)為平均值±標準差。不同字母表示經(jīng)HSD法檢驗在P<0.05水平差異顯著。下同。

以表達量最低的雌蛹作為對照，草地貪夜蛾體內V-ATP酶F亞基基因的表達量在不同齡期存在差異(圖10)。V-ATP酶F亞基基因在卵至3齡幼蟲的表達量為雌蛹表達量的2.46～3.01倍之間，上下浮動不明顯，無顯著差異。從5齡開始表達量逐漸升高，直至6齡時期達到頂峰，為雌蛹表達量的6.82倍。雄蛹表達量明顯高于雌蛹，兩者之間差異顯著。不同發(fā)育階段中的相對表達量由高到低依次為6齡幼蟲>雄成蟲>雄蛹>5齡幼蟲>雌成蟲>卵>1齡幼蟲>3齡幼蟲>2齡幼蟲>4齡幼蟲>雌蛹。

圖10 V-ATP酶F亞基基因在草地貪夜蛾不同發(fā)育階段的相對表達量

以表達量最低的雌蛹作為對照，對草地貪夜蛾不同發(fā)育階段V-ATP酶G亞基基因的表達量進行分析(圖11)。其中,在雄成蟲中的表達量顯著高于其他齡期，為雌蛹的18.28倍；在6齡幼蟲中表達量也較高，為雌蛹的9.42倍。不同發(fā)育階段中的相對表達量由高到低依次為雄成蟲>6齡幼蟲>1齡幼蟲>雌成蟲>3齡幼蟲>2齡幼蟲>5齡幼蟲>4齡幼蟲>卵>雄蛹>雌蛹。以表達量最低的雌蛹作為對照，草地貪夜蛾體內V-ATP酶H亞基基因的表達量在不同發(fā)育階段存在差異(圖12)。H亞基基因在卵和雄蛹中的表達量低于與其他齡期中的表達量，分別為雌蛹的2.22和2.26倍。雄成蟲中H亞基基因的表達量明顯高于其他齡期，為雌蛹表達量21.77倍，且與其他齡期表達量相比差異顯著。幼蟲期1齡至6齡的表達量之間均無顯著差異。不同發(fā)育階段中的相對表達量由高到低依次為雄成蟲>6齡幼蟲>雌成蟲>3齡幼蟲>1齡幼蟲>4齡幼蟲>2齡幼蟲>5齡幼蟲>雄蛹>卵>雌蛹。

圖11 V-ATP酶G亞基基因在草地貪夜蛾不同發(fā)育階段的相對表達量

圖12 V-ATP酶H亞基基因在草地貪夜蛾不同發(fā)育階段的相對表達量

3 討論

V-ATP酶的V1結構域被劃分為幾個子域：A3B3柱體、中心莖和外圍莖，該結構域主要功能是水解ATP[15]。單一拷貝的F亞基通過其C端與D亞基結合從而組成中心莖，并且起到連接V1和V0結構域的作用[16]。外圍莖由C、E、G、H亞基在中心莖外包裹形成。研究表明，H亞基可以在V-ATP酶V1和V0結構域的可逆解離過程中抑制V1結構域的催化活性[17]。昆蟲的V-ATP酶亞基功能的研究主要依靠RNAi的方式進行，V-ATP酶的敲除對多種物種均有致死作用[18-20]。除此之外，V-ATP酶亞基的RNAi還會導致多種發(fā)育異常，如玉米蠟蟬(Peregrinusmaidis)的繁殖力降低和卵母細胞形成異常以及西方蜜蜂(Apismellifera)化蛹失敗[21-22]。因此，V-ATP酶V1結構域的各個亞基很可能在昆蟲的各種生理生化過程中承擔著各不相同的重要責任。

本研究從草地貪夜蛾中成功克隆獲得了V-ATP酶的E、F、G和H亞基基因。多序列比對和系統(tǒng)進化樹的分析表明草地貪夜蛾中的V-ATP酶E～H亞基與其他物種的V-ATP酶E～H亞基具有極高的同源性。不同發(fā)育階段V-ATP酶E～H亞基表達量分析結果表明，V-ATP酶E～H 4個亞基在草地貪夜蛾整個生長發(fā)育期均有表達，且都表現(xiàn)出在雄成蟲中高量表達的特點。有研究表明，V-ATP酶在雄性灰翅夜蛾Spodopteramauritia輸精管上皮細胞中參與調節(jié)管腔酸堿環(huán)境以維持精子正常發(fā)育[23]。V-ATP酶維持精子健康發(fā)育環(huán)境的功能不僅在昆蟲中被發(fā)現(xiàn)，在哺乳動物、線蟲中也得到了證實[24-25]。研究發(fā)現(xiàn)，桔小實蠅雄蟲生殖節(jié)中的G亞基mRNA含量是雌蟲生殖節(jié)中的6.04倍[26]，也可以為此結果提供論據(jù)。E～H亞基在卵期和蛹期均表現(xiàn)為低量的表達，其原因在于處于這2個時期的個體飛行、進食等生命活動均不再進行，V-ATP酶只需維持低量運轉就可以為孵化和羽化積蓄力量[27]。除此之外，個別亞基在6齡幼蟲中也表現(xiàn)出較高的表達量，其中F和G亞基最為明顯。6齡時期處于幼蟲階段末期，此時即將進入預蛹期各項生命活動都會降低，而F和G亞基卻表現(xiàn)出較高的表達量，表明這2個亞基可能與化蛹相關。綜上所述，V-ATP酶E、F、G和H均在昆蟲的各種生理生化過程中承擔著不可或缺的責任。

目前，V-ATP酶在昆蟲的研究方向上還有許多空白，其與昆蟲生長、發(fā)育和繁殖相關的調控機制尚需進一步明確。下一步擬將該V-ATP酶作為新型農(nóng)藥研發(fā)的候選靶標，通過深入了解V-ATP酶的作用方式，篩選出合理的作用靶點或開發(fā)相應的抑制劑，從而建立創(chuàng)新型農(nóng)業(yè)害蟲研究和防治手段。