張 倩，張國威，商侃侃

（上海辰山植物園，城市園藝技術(shù)研發(fā)與推廣中心，上海 201602）

0 引言

隨著工農(nóng)業(yè)的迅速進(jìn)步和發(fā)展，銅污染已成為重要的土壤環(huán)境問題，不僅導(dǎo)致土壤質(zhì)量下降，而且還干擾土壤生物體的生命代謝，并威脅農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全[1]。由于可持續(xù)、低投資、多功能等優(yōu)勢(shì)，植物修復(fù)被普遍認(rèn)為是一種的安全途徑。木本植物具有根系發(fā)達(dá)、生長(zhǎng)迅速且生物量大等特征，利用其對(duì)重金屬污染進(jìn)行修復(fù)已經(jīng)成為植物修復(fù)領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)[2-3]。添加有機(jī)廢棄物可以提高植物重金屬提取量和修復(fù)效率，同時(shí)也可以達(dá)到“以廢制污”的目的，但其對(duì)土壤重金屬生物有效性及修復(fù)效果仍存在較大分歧[4]。螯合劑能夠活化土壤中的重金屬，從而強(qiáng)化植物對(duì)土壤中重金屬的吸收[5]。因此，通過螯合劑和有機(jī)物覆蓋的聯(lián)合作用下，應(yīng)該可以有效提高植物的生物量、產(chǎn)量和重金屬利用效率。

提高植物修復(fù)效率依賴于土壤理化性質(zhì)、重金屬、土壤微生物等和植物之間的相互作用[6]。土壤微生物多樣性和豐富度已成為衡量土壤質(zhì)量高低的重要生物學(xué)指標(biāo)[7]。在整個(gè)能量轉(zhuǎn)化過程中，微生物起著積極作用，通過改善根際土壤質(zhì)量從而促進(jìn)植被的生長(zhǎng)，達(dá)到提高植物對(duì)重金屬提取量的目的。重金屬會(huì)給土壤微生物帶來較大的影響，包括種群增長(zhǎng)特征、群落結(jié)構(gòu)以及生理生化和遺傳等方面都會(huì)對(duì)脅迫做出響應(yīng)[8]。施用有機(jī)肥能夠?yàn)橥寥牢⑸锾峁I養(yǎng)物質(zhì)，利于土壤微生物建群，減弱微生物間的競(jìng)爭(zhēng)作用，進(jìn)而使微生物多樣性增加[9]?；瘜W(xué)螯合劑能夠活化土壤中存在的重金屬對(duì)土壤微生物群落產(chǎn)生影響[10]。目前針對(duì)于有機(jī)物覆蓋、螯合劑以及聯(lián)合強(qiáng)化處理措施對(duì)銅污染土壤微生物多樣性的影響對(duì)比研究較少。

本研究采用illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)，較于傳統(tǒng)分析技術(shù)能夠產(chǎn)生覆蓋深度更大的數(shù)據(jù)量[11]，旨在通過研究不同強(qiáng)化處理措施對(duì)銅污染土壤微生物多樣性的影響，以期為解釋土壤微生物影響植物吸收累積重金屬的機(jī)理以及提高植物-微生物聯(lián)合修復(fù)重金屬污染效率提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)場(chǎng)地與材料

試驗(yàn)場(chǎng)地位于上海辰山植物園土壤污染修復(fù)模擬試驗(yàn)場(chǎng)(31°4′39″N、121°11′12″E)。試驗(yàn)場(chǎng)地地區(qū)屬北亞熱帶季風(fēng)氣候，年均氣溫17.8℃，年均日照1997.1 h，年均降水量1103.2 mm，年均蒸發(fā)量1257 mm[12]。

測(cè)定銅污染樣地表層土壤(0～30 cm)的基本理化性質(zhì)為：容重1.51 g/cm3，含水量24.2%，總孔隙度41.0%，pH 8.15，電導(dǎo)率226.7 μS/cm，有機(jī)質(zhì)26.2 g/kg，水 解 氮 70.7 mg/kg，有 效 磷 8.4 mg/kg，速 效 鉀297.3 mg/kg，銅含量為452.8 mg/kg。

供試植物為雜交新美柳(Salix matsudana×alba)；EDTA購買于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；樹枝落葉類覆蓋物來自上海辰山植物園。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與處理

設(shè)置如表1共5個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，共計(jì)15個(gè)樣地，每個(gè)樣地面積3.3 m×2.3 m。2019年3月，分別用長(zhǎng)度為25 cm雜交‘新美柳’插穗，以10株/m2扦插于土壤中，T1和T3處理進(jìn)行6～8 cm樹枝落葉類覆蓋，CK、T0和T2覆蓋6～8 cm厚度的原土。生長(zhǎng)20天后，T2和T3處理樣地加入濃度為5 mmol/L EDTA，常規(guī)管理。

表1 田間小區(qū)試驗(yàn)不同強(qiáng)化處理措施情況

1.3 土壤樣品采集

于2020年9月進(jìn)行土壤采集，采用“Z”型隨機(jī)取樣法每個(gè)樣地各采集3份土樣，深度約為15 cm，將3份土樣進(jìn)行充分混合，并除去較大的石塊、雜草、根系等雜物后，過2 mm篩后將土樣裝于無菌封口袋中，共計(jì)15個(gè)樣品（5個(gè)處理×3個(gè)重復(fù)），用于土壤微生物測(cè)序分析。

1.4 土壤微生物總DNA提取和高通量測(cè)序

采用OMEGA土壤DNA試劑盒(D5625-01)提取土壤樣品DNA基因組，提取DNA的數(shù)量和質(zhì)量用Eppendorf RS232G紫外可見分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)。以 V3-V4 區(qū) 特 異 性 引 物 338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′) 和 806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)[13]進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增 ，采用illumina MiSeq對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析。土壤樣品的微生物測(cè)序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

根據(jù)PE reads之間的overlap關(guān)系，將成對(duì)的reads拼接(merge)成一條序列，同時(shí)對(duì)reads的質(zhì)量和merge的效果進(jìn)行質(zhì)控過濾，根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物序列區(qū)分樣品得到有效序列，并校正序列方向，即為有效序列。

使用QIIME軟件(V1.9.1)對(duì)有效序列進(jìn)行識(shí)別，利用USEARCH去除沒有重復(fù)的單序列后，按照97%相似性對(duì)非重復(fù)序列進(jìn)行OTU聚類，基于silva數(shù)據(jù)庫，采用RDP classifier貝葉斯算法（默認(rèn)置信度閾值為0.7）對(duì)選出的OTU代表序列進(jìn)行物種注釋后開展后續(xù)的測(cè)序數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序序列處理及優(yōu)化

經(jīng)數(shù)據(jù)前處理，15個(gè)樣品總DNA的16S rDNA V3+V4區(qū)共得到962574條有效序列數(shù)據(jù)，序列平均長(zhǎng)度為419 bp，與16S rDNA V3+V4區(qū)序列長(zhǎng)度大致吻合，對(duì)15個(gè)樣本進(jìn)行數(shù)據(jù)抽平處理，每個(gè)樣本均含56729條有效序列，為統(tǒng)計(jì)方便，此后提到的有效序列均為抽平后的數(shù)據(jù)。按照16S rDNA相似性≥97%為一個(gè)OTU分類單元，進(jìn)行聚類后共得到7501個(gè)OTUs，并可以確定為42個(gè)門，145個(gè)綱，359個(gè)目，562個(gè)科，1060個(gè)屬，2290個(gè)種。

對(duì)所有樣本序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣，構(gòu)建土壤中微生物的Shannon指數(shù)稀釋曲線，由圖1可以看出，5個(gè)處理的稀釋曲線隨著測(cè)序量的增大，OTU增加數(shù)目的速度逐漸趨于平緩，同時(shí)樣品所得到的序列的覆蓋度均高于97%，表明樣本測(cè)序深度足夠，得到的數(shù)據(jù)量合理，可反映樣品中微生物群落的種類和結(jié)構(gòu)。

圖1 不同處理土壤微生物Shannon稀釋曲線

2.2 土壤微生物群落物種組成

計(jì)算不同處理土壤樣品中微生物在門水平上的物種平均相對(duì)豐度，繪制了豐度聚類熱圖。由圖2所知，不同處理土壤微生物群落組成在門水平上較為相似，優(yōu)勢(shì)物種相同，微生物相對(duì)豐度較大的門類為酸桿菌門 (Acidobacteria，21.80% ～25.86%)、變 形 菌 門(Proteobacteria，19.21% ～23.74%)、放 線 菌 門(Actinobacteria，12.11% ～17.53%)、綠 彎 菌 門(Chloroflexi，9.69%～12.53%)和厚壁菌門(Firmicutes，5.38%～11.50%)。T0和T1處理土壤微生物群落組成較為相似，聚為一類；CK位于較遠(yuǎn)的聚類分支上，說明空白對(duì)照與不同處理下的土壤微生物群落組成差異相對(duì)較大。

圖2 不同處理土壤微生物在門水平上的豐度聚類熱圖

Venn圖展示了不同處理土壤微生物群落共有或特有的OTU數(shù)。由圖3可知，CK、T0、T1、T2和T3分別含有 4911、5217、4848、5429、5212 個(gè) OTUs，其中2622個(gè)OTUs為5個(gè)處理的共有OTU，占比在50%以上，說明這部分微生物群落對(duì)環(huán)境改變表現(xiàn)出穩(wěn)定性。5個(gè)處理土壤微生物群落特有的OTU分別為349、151、124、197、122個(gè)，CK處理特有OTU數(shù)最多。

圖3 不同處理土壤微生物Venn圖

對(duì)比CK和T0處理，共有OTU數(shù)為3679個(gè)，分別占CK和T0處理OTU總數(shù)的74.91%和70.52%；對(duì)比T0和T1處理，共有OTU數(shù)為4106個(gè)，分別占T0和T1處理OTU總數(shù)的78.70%和84.69%；對(duì)比T0和T2處理，共有OTU數(shù)為4069個(gè)，分別占T0和T2處理OTU總數(shù)的78.00%和74.95%。

2.3 土壤微生物群落多樣性比較

對(duì)不同強(qiáng)化處理措施下土壤微生物Alpha多樣性指數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，通過指數(shù)組間差異分析（WelchT檢驗(yàn)）發(fā)現(xiàn)，T2處理土壤微生物的多樣性和豐富度均最大，且群落多樣性和T1處理的差異達(dá)到了顯著水平(0.01＜P≤0.05)。與CK相比，銅脅迫（T0～T3處理）均增加了土壤微生物群落的豐富度（圖4）。

圖4 不同處理土壤微生物Alpha多樣性指數(shù)

根據(jù)樣本的OTU豐度信息對(duì)土壤微生物群落進(jìn)行主坐標(biāo)分析(PCoA)，由圖5可知，不同處理的3個(gè)重復(fù)均聚類在一起，說明OTU水平上5個(gè)處理的組間差異大于組內(nèi)差異。基于Bray-Curtis距離進(jìn)行Adonis分析，結(jié)果表明：在OTU水平上，5個(gè)不同處理土壤微生物組成具有顯著差異(R2=0.5609，P=0.001)。T0和T1處理位于同一象限，說明這2個(gè)處理微生物群落結(jié)構(gòu)較為相似；CK距離最遠(yuǎn)，說明和其他四組處理微生物群落差異性最大。

圖5 不同處理土壤微生物PCoA分析

2.4 土壤微生物群落差異物種比較

基于樣本中群落豐度數(shù)據(jù)，使用WelchT檢驗(yàn)方法對(duì)不同處理土壤微生物群落進(jìn)行門水平上的兩組間差異顯著性檢驗(yàn)分析（圖6）。

圖6 不同處理土壤微生物門水平上兩組間差異顯著性檢驗(yàn)分析

針對(duì)微生物群落的優(yōu)勢(shì)物種（相對(duì)豐度＞5%），和CK相比，T0處理增加了酸桿菌門、變形菌門和厚壁菌門的相對(duì)豐度，放線菌門和綠彎菌門的相對(duì)豐度降低。和T0相比，T1處理增加了厚壁菌門、酸桿菌門和變形菌門的相對(duì)豐度，放線菌門和綠彎菌門的相對(duì)豐度降低；T2處理增加了變形菌門和放線菌門的相對(duì)豐度，酸桿菌門、綠彎菌門和厚壁菌門的相對(duì)豐度降低；T3處理增加了酸桿菌門、綠彎菌門和變形菌門的相對(duì)豐度，厚壁菌門和放線菌門的相對(duì)豐度降低。

與CK相比，T0處理下擬桿菌門(Bacteroidota)的豐度顯著升高，Methylomirabilota、浮霉菌門(Planctomycetota)、匿 桿 菌 門 (Latescibacterota)、Entotheonellaeota和Armatimonadota的豐度顯著降低。與T0處理相比，T1處理下Entotheonellaeota和異常球菌-棲熱菌門(Deinococcota)的豐度顯著升高，匿桿菌門和Sumerlaeota的豐度顯著降低；T2處理下藍(lán)細(xì)菌(Cyanobacteria)的豐度顯著降低；T3處理下MBNT15的豐度顯著升高。

不同處理下出現(xiàn)了一些特異物種，異常球菌-棲熱菌門在T0、T1、T2和T3中發(fā)現(xiàn)，CK中并未檢測(cè)出；Deferrisomatota在CK、T1、T2和T3中發(fā)現(xiàn)，T0中并未檢測(cè)出；Calditrichota、WS2、螺旋體門(Spirochaetota)和DTB120在CK、T0、T2和T3中發(fā)現(xiàn)，T1中并未檢測(cè)出；Abditibacteriota在T1和T3中發(fā)現(xiàn)，CK、T0和T2中并未檢測(cè)出；FCPU426在T0和T3中發(fā)現(xiàn)，CK、T1和T2并未檢測(cè)出。

3 結(jié)論

在門水平上，不同處理土壤微生物群落組成較為相似，優(yōu)勢(shì)物種相同，豐度較大的門類為酸桿菌門、變形菌門、放線菌門、綠彎菌門和厚壁菌門。

在OTU水平上，不同處理土壤微生物組成具有顯著差異，對(duì)微生物群落影響排序?yàn)椋恒~脅迫＞螯合劑＞有機(jī)物覆蓋；不同處理出現(xiàn)了特異物種，空白對(duì)照和其他處理差異性最大，銅脅迫和有機(jī)物覆蓋處理微生物群落組成最為相近。

銅脅迫均增加了土壤微生物群落的豐富度；添加螯合劑處理土壤微生物群落的多樣性和豐富度均最大，且群落多樣性和有機(jī)物覆蓋處理的差異達(dá)到了顯著水平。

4 討論

在門水平上，不同處理土壤微生物群落組成較為相似，優(yōu)勢(shì)物種相同。在OTU水平上，不同處理土壤微生物群落組成具有顯著差異，但仍有部分微生物對(duì)環(huán)境改變表現(xiàn)出穩(wěn)定性以及高抗銅污染能力?？軙鹊萚14]通過研究銅、鉛、鋅以及3種復(fù)合污染土壤微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，各處理組之間的擴(kuò)增群落存在差異，但微生物群落大部分種類表現(xiàn)出對(duì)重金屬污染的耐受性，說明修復(fù)后的土壤微生物群落可以恢復(fù)或保持與未處理對(duì)照組相似的結(jié)構(gòu)。

通過對(duì)比兩組間共有OTU發(fā)現(xiàn)，占比從大到小分別為：T0和T1，T0和T2，CK和T0，由此可以得出，不同強(qiáng)化處理措施對(duì)微生物群落影響排序?yàn)椋恒~脅迫＞螯合劑＞有機(jī)物覆蓋。

Alpha多樣性是評(píng)價(jià)土壤微生物群落多樣性和物種豐富度的重要指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照相比，銅脅迫處理均增加了土壤微生物群落的豐富度，這與葛藝等[15]研究小麥非根際以及根際微生物群落豐富度的結(jié)果一致。另外，添加螯合劑處理土壤微生物的多樣性和豐富度均最大。趙金博等[16]通過梯度試驗(yàn)探究EDTA處理土壤殘留液對(duì)微生物群落的影響發(fā)現(xiàn)，在0-10 mmol/L濃度的EDTA處理下，微生物群落沒有明顯變化，在5 mmol/L濃度的EDTA處理下土壤微生物總量略有上升。羅春玲等[17]研究表明不同濃度EDDS處理對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)沒有顯著影響。

針對(duì)微生物群落的優(yōu)勢(shì)物種（相對(duì)豐度＞5%），銅處理增加了酸桿菌門、變形菌門和厚壁菌門的相對(duì)豐度，放線菌門和綠彎菌門的相對(duì)豐度降低；有機(jī)物覆蓋處理增加了厚壁菌門、酸桿菌門和變形菌門的相對(duì)豐度，放線菌門和綠彎菌門的相對(duì)豐度降低；螯合劑處理增加了變形菌門和放線菌門的相對(duì)豐度，酸桿菌門、綠彎菌門和厚壁菌門的相對(duì)豐度降低；有機(jī)覆蓋+螯合劑處理增加了酸桿菌門、綠彎菌門和變形菌門的相對(duì)豐度，厚壁菌門和放線菌門的相對(duì)豐度降低。靳曉拓等[18]研究報(bào)道有機(jī)質(zhì)與放線菌門和變形菌門相對(duì)豐度成正相關(guān)，與厚壁菌門的相對(duì)豐度呈負(fù)相關(guān)；程存剛等[19]研究表明有機(jī)物料的種類對(duì)于微生物種群結(jié)構(gòu)的影響差異顯著，因此可能由于土壤性質(zhì)、有機(jī)質(zhì)類型以及施用量差異導(dǎo)致與本研究結(jié)果不完全一致。Berg等[20]研究表明綠彎菌門對(duì)高金屬含量具有普遍不耐受性，比如銅。安夢(mèng)潔等[21]通過FTIR分析和高通量測(cè)序表明，碳?xì)滏I的形成為放線菌門和綠彎菌門提供了適宜的環(huán)境，有利于提高微生物豐度。而施用修復(fù)劑使土壤中Pb和Cd的有效性降低，破壞了碳?xì)滏I，因而使得放線菌門和綠彎菌門的豐度減少。Bonanomi等[22]研究表明酸桿菌門能夠降解纖維素和木質(zhì)素，進(jìn)而為土壤提供養(yǎng)分。本研究中，銅處理下酸桿菌門的豐度增加，表明土壤可能通過增加酸桿菌門細(xì)菌的豐度進(jìn)而促進(jìn)木質(zhì)素和纖維素的分解，以增強(qiáng)柳樹對(duì)養(yǎng)分的吸收。寇書萌等[14]研究表明銅脅迫會(huì)增加土壤中酸桿菌門和變形菌門的相對(duì)豐度，與本研究結(jié)果一致。有研究指出，外源增加土壤中酸桿菌門和厚壁菌門的豐度，可以改變微生物種群的相互作用和平衡，從而促進(jìn)作物生長(zhǎng)[23-24]。有研究表明，水稻田中變形菌門微生物具有耐重金屬性，具有固氮功能，利用光合作用儲(chǔ)存能量[25]。

不同處理下出現(xiàn)了特異物種，空白對(duì)照中未檢出異常球菌-棲熱菌門，有研究表明該軍門包括對(duì)嚴(yán)酷環(huán)境有抗性的球狀細(xì)菌[26]，可能是銅脅迫下產(chǎn)生了具有特殊選擇性優(yōu)勢(shì)的耐金屬極端微生物。單一銅脅迫下，Deferrisomatota未檢出，可能是高濃度銅脅迫造成該物種被消除。有機(jī)物覆蓋處理下，Calditrichota、WS2、螺旋體門和DTB120未檢出，可能是樹枝落葉類覆蓋單獨(dú)處理下產(chǎn)生某種脅迫導(dǎo)致這些物種被消除。有機(jī)物覆蓋和有機(jī)物覆蓋+螯合劑聯(lián)合處理中檢出Abditibacteriota，可能是樹枝落葉類覆蓋處理下產(chǎn)生的具有特殊選擇性優(yōu)勢(shì)的微生物。單一銅脅迫和有機(jī)物覆蓋+螯合劑聯(lián)合處理中檢出FCPU426，原因待進(jìn)一步分析。