汪 喬，王祥鋒，郭玉峰，王 麗

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/山東省農(nóng)業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安 271018）

0 引言

肺形側(cè)耳(Pleurotus pulmonarius)又名秀珍菇、環(huán)柄側(cè)耳、環(huán)柄斗菇等[1]，隸屬于真菌門擔(dān)子菌綱傘菌目側(cè)耳科側(cè)耳屬[2]，其口感柔嫩，味道鮮美，又有“味精菇”的美譽(yù)[3]。肺形側(cè)耳肉質(zhì)肥嫩，富含豐富的蛋白質(zhì)、微量元素、氨基酸和維生素等營養(yǎng)物質(zhì)[4]，適應(yīng)性廣，且屬于中高溫型菌類，可彌補(bǔ)高溫季節(jié)市場空缺，近年來已成為國內(nèi)發(fā)展最快的食用菌品種之一[5]。

栽培規(guī)模的日益擴(kuò)大對適宜不同地區(qū)栽培的、滿足不同喜好的肺形側(cè)耳品種的需求也逐漸增加，但目前肺形側(cè)耳主栽品種主要是臺灣灰色系列，顏色較單一，且有些品種經(jīng)多年組織擴(kuò)繁后出現(xiàn)菌種退化和老化現(xiàn)象，制約了該食用菌產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，因此研究不同來源的肺形側(cè)耳菌株的遺傳多樣性及其農(nóng)藝性狀對保護(hù)優(yōu)良種質(zhì)資源及其高效利用有重要意義[6]。真菌發(fā)生拮抗反應(yīng)是體細(xì)胞不親和的直接表現(xiàn)，可以通過觀察菌絲體間拮抗反應(yīng)（如是否形成色素、菌絲是否隆起等）來判斷菌株間的親緣關(guān)系[7]。該方法操作簡單、結(jié)果直觀；但也存在一些問題，如不容易區(qū)分遺傳背景近似的菌株，而且在觀察拮抗線時(shí)存在個(gè)人主觀因素影響，因此采用拮抗反應(yīng)進(jìn)行菌株鑒定時(shí)需要結(jié)合分子標(biāo)記和農(nóng)藝性狀測定等方法[8]。內(nèi)部簡單重復(fù)序列(Internal simple repeat sequence，ISSR)分子標(biāo)記具有引物設(shè)計(jì)簡單、多態(tài)性高和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于食用菌的遺傳多樣性[9]、雜交育種[10]、品種鑒定[11]及優(yōu)良雜交子篩選中[12]。任海霞等[13]利用ISSRPCR技術(shù)對26個(gè)香菇菌株進(jìn)行DNA指紋分析，并使用NTSYS-PC軟件對其遺傳差異性進(jìn)行聚類分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相似水平在55%時(shí)出現(xiàn)種系分離，相似水平65%時(shí)26個(gè)菌株聚為5個(gè)群組；袁濱等[14]采用拮抗和ISSR分子標(biāo)記對供試的11個(gè)灰樹花菌株進(jìn)行鑒定和遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)這2種方法所得到的結(jié)果存在一致性，但還存在一定差異；馮偉林等[15]結(jié)合ISSR分子標(biāo)記和農(nóng)藝性狀評價(jià)對15個(gè)秀珍菇進(jìn)行遺傳多樣性分析，在遺傳系數(shù)為0.87時(shí)將菌株分為3個(gè)群，同時(shí)筆者還發(fā)現(xiàn)秀珍菇不同出菇溫型與ISSR分子標(biāo)記分類間存在相關(guān)性；陳雪鳳等[16]結(jié)合拮抗試驗(yàn)、現(xiàn)蕾出菇試驗(yàn)和ISSR分子標(biāo)記對18個(gè)秀珍菇菌株開展多樣性研究分析，發(fā)現(xiàn)菌株之間存在遺傳差異，且出菇溫差型、農(nóng)藝性狀都與ISSR分子標(biāo)記分類相關(guān)性較高。由此得出結(jié)合拮抗試驗(yàn)、ISSR分子標(biāo)記和農(nóng)藝性狀評價(jià)可以較全面地進(jìn)行食用菌種質(zhì)資源的鑒定評價(jià)。目前關(guān)于肺形側(cè)耳菌株間遺傳多樣性方面的研究較多，但前人比較分析的肺形側(cè)耳菌株主要為商業(yè)栽培菌株，對野生菌株和商業(yè)栽培菌株間進(jìn)行遺傳多樣性分析的報(bào)道較少?；诖?，本研究結(jié)合拮抗試驗(yàn)、ISSR分子標(biāo)記技術(shù)及農(nóng)藝性狀評價(jià)，對10個(gè)不同來源的（包括5個(gè)野生菌株和5個(gè)商業(yè)栽培菌株）肺形側(cè)耳菌株的遺傳多樣性進(jìn)行綜合分析，旨在明確不同來源菌株間的親緣關(guān)系，為優(yōu)良肺形側(cè)耳菌株選育和今后進(jìn)行雜交育種時(shí)親本的選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試肺形側(cè)耳菌株共10個(gè)，其中5個(gè)是野外采集菌株，1個(gè)（‘秀57’）為商業(yè)主栽品種，其余4個(gè)為國內(nèi)各菌種保藏中心贈予，均為產(chǎn)量較高的商業(yè)栽培菌株。目前保藏于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)菌物實(shí)驗(yàn)室，具體見表1。

表1 供試肺形側(cè)耳菌株與來源

1.2 培養(yǎng)基配制及培養(yǎng)方法

1.2.1 母種培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）馬鈴薯（去皮）200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1000 mL，pH自然。

將供試肺形側(cè)耳菌株轉(zhuǎn)接于PDA固體培養(yǎng)基中，每個(gè)菌株轉(zhuǎn)接3個(gè)培養(yǎng)皿，于25℃條件下培養(yǎng)10天后用于DNA提取。

1.2.2 麥粒原種培養(yǎng)基（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）麥粒98%，石膏粉1%，碳酸鈣1%，含水量55%～60%。

將拌勻的麥粒培養(yǎng)料裝入菌種瓶中，121℃滅菌1.5 h，完全冷卻后接種，置于25℃條件下培養(yǎng)20天左右，菌種長滿瓶即可。

1.2.3 栽培種培養(yǎng)基（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）蘋果木56%，玉米芯20%，麩皮20%，石灰2%，石膏1%，糖1%，含水量約為60%～62%。

1.3 拮抗對峙試驗(yàn)

在無菌操作環(huán)境下，取15個(gè)裝有PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿（直徑9 cm），用記號筆在培養(yǎng)皿底上標(biāo)記邊長3 cm正六邊形的頂點(diǎn)和中心。將供試菌株長滿菌絲體的培養(yǎng)皿用直徑0.6 cm打孔器打孔，取相同大小的菌種塊按圖1所示接種于培養(yǎng)皿相應(yīng)位置，25℃下培養(yǎng)，觀察菌種塊菌絲間是否存在拮抗現(xiàn)象[17]。試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，為了便于書寫，將菌種PL1～PL10在培養(yǎng)皿上簡記為1～10。

圖1 供試菌株接種點(diǎn)示意圖

1.4 ISSR引物設(shè)計(jì)與合成

ISSR引物參考哥倫比亞大學(xué)公布的序列和Wolfe相關(guān)設(shè)計(jì)[18]，從中挑選出10條合適引物，引物由青島擎科生物技術(shù)有限公司合成，具體序列見表2。

表2 10條ISSR引物序列及退火溫度

1.5 遺傳差異分析

1.5.1 肺形側(cè)耳菌株DNA的提取 供試菌株基因組DNA參照真菌基因組DNA提取試劑盒（BioTeke，北京）的說明提取。提取的DNA經(jīng)Nanodrop 2000c定量和瓊脂糖凝膠電泳檢測純度后，保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 ISSR多態(tài)性分析 ISSR-PCR擴(kuò)增體系為：12.5 μL 2×PCR Master Mix，1 μL 引物，1 μL DNA 模板，用ddH2O補(bǔ)齊到25 μL。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，適宜溫度退火（具體見表2）15 s，72℃延伸 40 s，35 個(gè)循環(huán)；72℃終延伸 7 min，4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，對擴(kuò)增的圖譜進(jìn)行拍照。

1.6 農(nóng)藝性狀測試

采用常規(guī)方法攪拌、裝袋，用規(guī)格12 cm×24 cm×0.05 mm聚乙烯栽培袋裝袋，每袋裝干料110 g，每個(gè)菌株接15袋，接種后置于25℃條件下培養(yǎng)，待菌絲滿袋后按常規(guī)方法進(jìn)行出菇管理。試驗(yàn)于2020年6—10月在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)菌物實(shí)訓(xùn)基地進(jìn)行。

記錄不同菌株菌絲生長速度、菌絲顏色、菌絲長勢，菌蓋大小、顏色，菌柄形態(tài)顏色，以采收2潮菇的產(chǎn)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.7 數(shù)據(jù)處理

將ISSR擴(kuò)增片段進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，有ISSR譜帶標(biāo)記為1，無ISSR譜帶標(biāo)記為0，構(gòu)建初始數(shù)據(jù)矩陣，用NTSYS-pc 2.10軟件計(jì)算菌株間遺傳相似系數(shù)，并通過非加權(quán)配對算數(shù)平均法(UPGMA)進(jìn)行聚類分析，得到聚類圖譜。

菌絲長速及產(chǎn)量測定采用SPSS21.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌絲拮抗對峙試驗(yàn)結(jié)果

在拮抗對峙試驗(yàn)中，來自不同遺傳背景的菌株其菌絲的交匯區(qū)會形成明顯的分界線，發(fā)生菌絲隆起以及在平板背面有褐色色素沉淀[19]。親緣關(guān)系較近的菌株菌絲之間無拮抗或拮抗不明顯，親緣關(guān)系較為疏遠(yuǎn)的菌株之間拮抗作用十分明顯[20]。本試驗(yàn)中10個(gè)供試菌株間的拮抗試驗(yàn)結(jié)果如圖2和表3所示，從中可以看出，菌株P(guān)L3和PL8及PL6和PL9組間菌株拮抗反應(yīng)不明顯，表明2組菌株間親緣關(guān)系較為相近；其余菌株間均能發(fā)生明顯拮抗反應(yīng)，從平板背面圖可見明顯的拮抗線及褐色色素沉淀，表明各菌株間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

表3 肺形側(cè)耳菌株間拮抗對峙試驗(yàn)結(jié)果

圖2 10個(gè)菌株間拮抗圖譜

2.2 10個(gè)肺形側(cè)耳菌株的ISSR多態(tài)性分析

利用10條ISSR引物對供試的10個(gè)肺形側(cè)耳菌株DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從中篩選出條帶清晰、多態(tài)性豐富的ISSR引物。通過引物擴(kuò)增圖譜篩選，得到4條ISSR引物在供試菌株間擴(kuò)增出75條清晰易辨的多態(tài)性片段，大小在100～2500 bp之間，擴(kuò)增結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明不同肺形側(cè)耳菌株間存在豐富的遺傳多樣性，且遺傳的變異水平較高。

圖3 4條引物對肺形側(cè)耳供試菌株擴(kuò)增的ISSR電泳圖譜

2.3 10個(gè)肺形側(cè)耳菌株的聚類分析

依據(jù)上述4條ISSR引物的多態(tài)性數(shù)據(jù)，利用NTSYS-pc 2.10軟件，構(gòu)建了10個(gè)供試菌株的UPGMA聚類分析圖。結(jié)果（圖4）表明，10個(gè)供試肺形側(cè)耳菌株遺傳相似水平為0.63～0.92。在0.63水平上菌株P(guān)L4單獨(dú)聚為一類，其余9個(gè)菌株聚為一類，說明10個(gè)菌株中，PL4與其他菌株雜交遺傳差異較大。當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.69時(shí)，供試菌株可以分為3個(gè)類群，類群Ⅰ包含4株野生菌株，類群Ⅱ包含5株商業(yè)栽培菌株，類群Ⅲ包含1株野生菌株。遺傳相似水平最高為0.92，即菌株P(guān)L7和PL8，說明兩者親緣關(guān)系最為相近。

圖4 10個(gè)肺形側(cè)耳菌株的聚類分析結(jié)果

2.4 10個(gè)肺形側(cè)耳菌株菌絲生長情況

供試菌株在PDA培養(yǎng)基上接種7天后的菌絲生長情況如圖5和表4所示。從中可以得出，各菌株之間菌絲長勢差異較為顯著，菌株P(guān)L4、PL1、PL5和PL10菌絲生長較快，平均日生長速度分別為0.61、0.61、0.58、0.57 cm/d，菌株P(guān)L7、PL8菌絲長速較慢，分別為0.45、0.47 cm/d；菌絲色澤分別為雪白色、白色以及灰白色，PL1和PL4后期會產(chǎn)生色素；除菌株P(guān)L7、PL8和PL9外，各菌株菌落邊緣都較為整齊；10個(gè)供試菌株整體長勢較好，菌絲較為濃密，抗雜菌能力較強(qiáng)，無污染情況發(fā)生。

圖5 10個(gè)肺形側(cè)耳菌株接種7天后平板菌絲圖

表4 10個(gè)肺形側(cè)耳菌株菌絲生長情況

2.5 10個(gè)肺形側(cè)耳菌株農(nóng)藝性狀和生物學(xué)轉(zhuǎn)化率

對10個(gè)肺形側(cè)耳菌株進(jìn)行出菇試驗(yàn)，并測定主要農(nóng)藝性狀，結(jié)果如表5、圖6。各供試菌株滿袋天數(shù)為22～28天，其中野外采集菌株現(xiàn)原基數(shù)量較多，菌絲長速普遍較快，菌株P(guān)L1和PL4菌絲生長速度最快，平均滿袋時(shí)間為22天，比菌株P(guān)L7和PL8快6天；供試菌株的子實(shí)體顏色包括黃白、灰色、白+褐、淡黃、褐色、深灰色6種，野外采集菌株除了PL2外，其他4株子實(shí)體顏色均較淺；菌柄形態(tài)分為細(xì)長、中粗、粗長3類；菌株P(guān)L1的產(chǎn)量和生物學(xué)轉(zhuǎn)化率最高，前2潮菇平均產(chǎn)量為96.94 g，生物學(xué)轉(zhuǎn)化率為88.21%，菌株P(guān)L9和PL2次之，菌株P(guān)L3產(chǎn)量和生物學(xué)轉(zhuǎn)化率最低，產(chǎn)量僅為83.20 g，生物學(xué)轉(zhuǎn)化率為75.64%。

圖6 10個(gè)肺形側(cè)耳菌株出菇照片

表5 10個(gè)肺形側(cè)耳菌株農(nóng)藝性狀分析

3 結(jié)論與討論

拮抗反應(yīng)是體細(xì)胞不親和性的具體表現(xiàn)，作為鑒定菌株遺傳差異的傳統(tǒng)方法，目前已廣泛用于絲狀真菌種內(nèi)菌株的鑒定和分類中[21]。本研究通過拮抗試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，10個(gè)供試菌株間有43組發(fā)生拮抗反應(yīng)，僅2組未發(fā)生拮抗反應(yīng)，其中野生菌株兩兩間接觸時(shí)均出現(xiàn)拮抗線且在平板背面有褐色色素沉淀，說明野生菌株間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)菌株P(guān)L3與PL8、PL6與PL9并無拮抗線，平板背面也沒有色素沉淀，初步推測其可能為體細(xì)胞親和、親緣關(guān)系相近的菌株。

ISSR分子標(biāo)記可從DNA水平反映菌株間的遺傳變異，常用于揭示食用菌遺傳多態(tài)性和區(qū)分種內(nèi)菌株間親緣關(guān)系[22]。本研究基于ISSR引物擴(kuò)增出結(jié)果，采用UPGMA對肺形側(cè)耳菌株進(jìn)行聚類分析，結(jié)果表明10個(gè)供試菌株間遺傳相似系數(shù)為0.63～0.92，具有一定的遺傳多樣性與遺傳豐富度。當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.69時(shí)，供試菌株可分為3個(gè)類群，類群Ⅰ包含4株野生菌株，類群Ⅱ包含5株商業(yè)栽培菌株，類群Ⅲ包含1株野生菌株。本研究篩選獲得的ISSR引物可以很好地將野生菌株與商業(yè)栽培菌株進(jìn)行區(qū)分，5個(gè)商業(yè)栽培菌株的親緣關(guān)系較近，推測可能是同類菌株起源相似或基于商業(yè)需求選育，導(dǎo)致進(jìn)化差異小。陸歡等[23]和楊和川等[24]研究金針菇的農(nóng)戶栽培菌株和工廠化栽培菌株的遺傳多樣性時(shí)發(fā)現(xiàn)，生產(chǎn)性質(zhì)相同的菌株親緣關(guān)系較近，推測是由品種選育和生產(chǎn)環(huán)境接近所造成，與本研究結(jié)果相似。

本研究綜合拮抗試驗(yàn)和ISSR分子標(biāo)記技術(shù)2種方法對供試的10個(gè)肺形側(cè)耳菌株進(jìn)行鑒定分析，結(jié)果表明2種方法得出的大部分結(jié)果較為一致，如野生菌株P(guān)L4與其他供試菌株均存在明顯拮抗線，ISSR分子標(biāo)記聚類結(jié)果也顯示PL4與其他菌株平均相似系數(shù)僅為0.63，單獨(dú)聚為一類；菌株P(guān)L6與PL9兩者之間不存在拮抗反應(yīng)，而與其他供試菌株均存在不同程度的拮抗反應(yīng)，聚類分析結(jié)果顯示兩者相似系數(shù)較高，為0.89，表明這2個(gè)菌株間的遺傳背景相近，親緣關(guān)系較近。本試驗(yàn)中少部分拮抗試驗(yàn)結(jié)果和ISSR分子標(biāo)記分析存在差異，如菌株P(guān)L3與PL8拮抗反應(yīng)不明顯，但在聚類分析中兩者親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；菌株P(guān)L7與PL8間具有明顯的拮抗線，但聚類分析時(shí)兩者單獨(dú)聚為一支，且菌株間的相似系數(shù)高達(dá)0.92。在金針菇[23]、灰樹花[14]和糙皮側(cè)耳[25]等食用菌的研究中，也發(fā)現(xiàn)拮抗結(jié)果與親緣關(guān)系分析結(jié)果存在差異的情況，推測主要是因?yàn)檗卓乖囼?yàn)結(jié)果易受試驗(yàn)者主觀因素、菌種繼代次數(shù)和培養(yǎng)基等多方面的影響，不能有效區(qū)分遺傳背景相似或親緣關(guān)系很近的菌株，也進(jìn)一步表明，拮抗試驗(yàn)在鑒別親和菌株的遺傳關(guān)系存在著不確定性，只能作為菌種鑒定的一個(gè)輔助方法。

進(jìn)一步對供試菌株進(jìn)行出菇試驗(yàn)和農(nóng)藝性狀評價(jià)得出，拮抗試驗(yàn)結(jié)果與聚類分析結(jié)果不一致的2組菌株中，PL3與PL8農(nóng)藝性狀差異較大，菌株P(guān)L7與PL8農(nóng)藝性狀差異較小，與聚類分析結(jié)果一致。供試菌株間農(nóng)藝性狀均具存在差異，其中野生菌株與商業(yè)栽培菌株間差異顯著：野生菌株菌絲體生長速度普遍較快，且不經(jīng)低溫刺激就能形成原基，原基數(shù)量較多，子實(shí)體顏色豐富（黃白、灰色、白+褐、淡黃色），但商品性狀較差（菌柄較細(xì)、軟），且菌株個(gè)體間差異較大；商業(yè)栽培菌株產(chǎn)量較高，商品性狀好，但子實(shí)體顏色較為單一，菌株間遺傳多樣性較差。隨著肺形側(cè)耳工廠化栽培的發(fā)展和多元化的消費(fèi)需求，出菇潮次集中、抗逆性強(qiáng)、無需低溫刺激且顏色豐富的野生菌株將會是育種的優(yōu)良親本材料。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)合拮抗試驗(yàn)、ISSR分子標(biāo)記技術(shù)和農(nóng)藝性狀評價(jià)等方法，綜合分析了10個(gè)不同來源的肺形側(cè)耳菌株的遺傳多樣性，認(rèn)為供試肺形側(cè)耳菌株間遺傳多樣性較為豐富，其中商業(yè)栽培菌株間親緣關(guān)系較近，野生菌株具有更豐富的遺傳多樣性。但本研究中并未發(fā)現(xiàn)與野生菌株中優(yōu)良性狀（如顏色、出菇溫型、出菇潮次集中等）相關(guān)的特異分子標(biāo)記，今后可以進(jìn)一步加大引物篩選，以獲得一些特異的分子標(biāo)記，為發(fā)掘優(yōu)異的肺形側(cè)耳種質(zhì)資源和分子標(biāo)記輔助育種提供依據(jù)。