黃正洋，趙振華，黃華云，李春苗，王錢保，穆春宇，黎壽豐

（中國農(nóng)業(yè)科學院家禽研究所，揚州 225009）

在表觀遺傳學研究領(lǐng)域，microRNA研究是一個越來越受到關(guān)注的研究熱點。microRNA是一種序列高度保守的單鏈非編碼小分子RNA，長度19～25個核苷酸[1-2],主要是通過與靶基因的3′-非翻譯區(qū)結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體，從而抑制靶基因翻譯，起著負調(diào)控的作用。研究表明，miRNA參與了動物生長發(fā)育過程中大量基因的表達調(diào)控，如細胞的增殖、分化、凋亡等，進而調(diào)控動物的肌肉發(fā)育以及繁殖等過程[3-4]。

miR-10家族是一個非編碼RNA家族，主要包括miR-10a、miR-10b和miR-10c這3個大類，每個大類同時還會有來自前體序列5′-端臂和3′-端臂加工而來的成熟體miRNA。miR-10位于HOX（homeobox family）基因簇內(nèi)，HOX基因是一類編碼高度保守、含有同源結(jié)構(gòu)域的DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，在生物形態(tài)發(fā)育過程中起著重要作用。miR-10b-5p是來自miR-10b的5′-端臂的成熟體形式，在調(diào)控細胞增殖凋亡中起著重要的功能。目前，已經(jīng)對miR-10在小鼠[5]、山羊[6-8]、豬[9-11]和鵝[12]等物種上的功能進行了研究，主要研究了在組織間的表達差異、肌肉生長發(fā)育、對卵巢顆粒細胞的影響以及對精子發(fā)生過程的調(diào)控。

鑒于miR-10b-5p與肌肉生長、細胞增殖分化和顆粒細胞凋亡密切關(guān)系，以蘇禽3號肉雞為試驗動物，通過檢索獲得常見脊椎動物的miR-10b-5p序列，并進行相應(yīng)分析；利用數(shù)據(jù)庫比對確定miR-10b-5p在基因組中的位置，根據(jù)成熟序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹；使用多個在線軟件預(yù)測miR-10b-5p靶基因，并進行GO功能和KEGG通路分析；利用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測不同生長時期miR-10b-5p組織表達變化，為進一步揭示miR-10b-5p在雞肌肉生長及細胞增殖分化中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗選取中國農(nóng)業(yè)科學院家禽研究所邵伯試驗基地選育的蘇禽3號肉雞。選取體重接近的1日齡健康個體600只，佩戴翅號，組建試驗群體。在相同管理條件下飼養(yǎng)，自由采食及飲水，常規(guī)程序免疫接種。3日齡（生長初期）和90日齡（上市前）時，隨機選取5只進行放血屠宰，分別采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸肌、腿肌、卵巢、大腦、小腦、垂體和下丘腦等組織樣品，立即置于液氮中，帶回實驗室后-70 ℃保存，用于總RNA提取。

1.2 主要試劑和儀器

miRcute miRNA提取分離試劑盒（DP501）、miRcute增強型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒（KR211）、增強型miRNA熒光定量檢測試劑盒（FP411）均購自天根生化科技（北京）有限公司。Applied Biosystems 7500熒光定量PCR系統(tǒng)購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3 miR-10b-5p序列的獲得

從miRBase 22.1（http:∥www.mirbase.org/）[13]中下載全部物種miRNA成熟序列，篩選miR-10b-5p序列，去除植物等物種的序列，只保留脊椎動物的成熟序列及前體序列。經(jīng)過篩選，選取以下物種的miR-10b-5p序列：牛（Bostaurus，登錄號：MIMAT0003839）、家犬（Canisfamiliaris，登錄號：MIMAT0009837）、山羊（Caprahircus，登錄號：MIMAT0035913）、豚鼠（Caviaporcellus，登錄號：MIMAT0046847）、錦龜（Chrysemyspicta，登錄號：MIMAT0037627）、原鴿（Columbalivia，登錄號：MIMAT0038406）、灰倉鼠（Cricetulusgriseus，登錄號：MIMAT0023737）、鯉魚（Cyprinuscarpio，登錄號：MIMAT0026200）、斑馬魚（Daniorerio，登錄號：MIMAT0001268）、馬（Equuscaballus，MIMAT0013090）、大西洋鱈魚（Gadusmorhua，MIMAT0044188）、紅色原雞（Gallusgallus，登錄號：MIMAT0001148）、大猩猩（Gorillagorilla，登錄號：MIMAT0002491）、人（Homosapiens，登錄號：MIMAT0000254）、獼猴（Macacamulatta，登錄號：MIMAT0006162）、小鼠（Musmusculus，登錄號：MIMAT0000208）、鴨嘴獸（Ornithorhynchusanatinus，登錄號：MIMAT0007218）、家兔（Oryctolaguscuniculus，登錄號：MIMAT0048099）、綿羊（Ovisaries，登錄號：MIMAT0030031）、黑猩猩（Pantroglodytes，登錄號：MIMAT0007945）、狐蝠（Pteropusalecto，登錄號：MIMAT0039899）、褐家鼠（Rattusnorvegicus，登錄號：MIMAT0000783）、大西洋鮭魚（Salmosalar，登錄號：MIMAT0032295）、野豬（Susscrofa，登錄號：MIMAT0013885）。

1.4 miR-10b-5p基因定位及序列分析

由于成熟序列較短,可能在基因組中有多個定位，因此，采用Ensembl數(shù)據(jù)庫的BLAST程序（http:∥asia.ensembl.org/index.html），以雞、山羊、家兔、野豬、牛和斑馬魚等12個物種的miR-10b-5p前體序列作為查詢序列，對其基因組數(shù)據(jù)庫進行搜索，以確定miR-10b-5p在基因組染色體上中的位置。 選取24種典型物種的24條miR-10b-5p的成熟序列，使用Mega 11.0軟件[14]（https:∥www.megasoftware.net/）中Clustal W程序?qū)iR-10b-5p基因的成熟序列進行多序列比對（multiple sequences alignment，MSA），分析序列特點。

1.5 系統(tǒng)發(fā)生分析

為使得構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹更加準確，選取24種典型物種的24條miR-10b-5p的前體序列，使用Mega 11.0軟件中Clustal W程序進行多序列比對分析，采用基于距離參數(shù)的鄰接法（Neighbor-joining,NJ），并自展分析（Bootstrap）1 000次，構(gòu)建miR-10b-5p基因的系統(tǒng)進化樹。

1.6 miR-10b-5p靶基因預(yù)測及功能分析

利用3個在線軟件microT[15]（http:∥diana.imis.athena-innovation.gr/DianaTools/index.php?r=microtv4/index）、miRDB[16]（http:∥www.mirdb.org）和TargetScan[17]（http:∥www.targetscan.org/vert_71/）預(yù)測gga-miR-10b-5p的靶基因，取3個軟件的交集以降低預(yù)測結(jié)果的假陽性。對獲得的靶基因使用在線工具DAVID[18]（https:∥david.ncifcrf.gov/）進行GO功能和KEGG通路富集分析。

1.7 引物設(shè)計與合成

根據(jù)NCBI上紅色原雞gga-miR-10b-5p序列（登錄號：NR_031440.1），利用miRNA Design v.1.01軟件采用加尾法設(shè)計引物進行定量分析，以U6為內(nèi)參基因，引物信息見表1。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 miR-10b-5p 實時熒光定量PCR引物Table 1 Sequences of the oligonucleotide primers for Real-time quantitative PCR

1.8 miRNA提取及反轉(zhuǎn)錄

采用miRcute miRNA提取分離試劑盒提取各組織樣品miRNA。每個樣品取3 μL總RNA，使用miRcute增強型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒，進行miRNA第一鏈cDNA的反轉(zhuǎn)錄（采用加A法）。反應(yīng)體系：Total RNA 2 μg，2×miRNA RT Reaction Buffer 10 μL，1×miRNA RT Enzyme Mix 2 μL，RNase-free ddH2O補至20 μL。反應(yīng)程序：42 ℃ 60 min；95 ℃ 3 min。合成的cDNA反應(yīng)液置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.9 miR-10b-5p在雞不同組織內(nèi)的定量表達檢測

采用SYBR Green Ⅰ嵌合熒光法檢測心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸肌、腿肌、卵巢、大腦、小腦、垂體和下丘腦等組織樣品中miR-10b-5p表達量，反應(yīng)條件和程序按照miRcute增強型miRNA熒光定量檢測試劑盒說明書操作。PCR反應(yīng)在Applied Biosystems 7500熒光定量PCR系統(tǒng)中進行，U6基因作為內(nèi)參。

1.10 統(tǒng)計分析

采用2-ΔΔCt法分析miR-10b-5p在雞不同組織中的相對表達量，每個樣品重復(fù)3次。試驗結(jié)果以平均值±標準差表示。用SPSS 26.0軟件獨立樣本t檢驗進行統(tǒng)計分析，以P<0.05作為差異顯著性判斷標準。

2 結(jié) 果

2.1 miR-10b-5p家族分析

通過文獻和miRBase檢索共獲得59種動物的59條miR-10b-5p序列，即所查到的每種動物中都只有1種miR-10b-5p形式。由于miR-10b家族基因數(shù)量的不同，導(dǎo)致miR-10b-5p呈現(xiàn)出以下2種形式：miR-10b和miR-10b-5p。在雞中miR-10b的成熟體形式為miR-10b-5p。選取了常見的紅色原雞、山羊、兔、人、斑馬魚等12個物種的miR-10b-5p前體序列作為查詢序列（query sequence），通過BLAST搜索確定各序列在基因組中的位置，如表2所示。基因定位顯示，與其他miRNA類似，miR-10b-5p大部分都位于基因的間隔區(qū)（intergenic region，IGR），雞miR-10b-5p定位在7號染色體上，位于HOX基因家族基因間隔區(qū)。

表2 miR-10b-5p基因家族在基因組中的定位Table 2 Genomic location of miR-10b-5p gene family

2.2 miR-10b-5p序列分析

選取24種典型物種的24條miR-10b-5p的成熟序列進行多序列比對分析，結(jié)果如圖1所示，miR-10b-5p的成熟序列相似性很高，序列長度（22～24 nt）相近，保守的堿基數(shù)19個，分別為第3-18和20-22位堿基，說明miR-10b-5p在不同物種間具有高度保守性。比對結(jié)果顯示，miR-10b-5p在部分物種在前兩位和最后兩位堿基存在不同程度缺失，在大西洋鱈魚第19位堿基出現(xiàn)了U>G的突變。

*，表示序列一致；-，表示堿基缺失*，Represent highly conserved bases；-，Indicate base deletion圖1 miR-10b-5p基因家族的成熟序列比對Fig.1 Multiple sequence alignment of mature sequence of miR-10b-5p gene family

2.3 miR-10b-5p系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建

采用Mega 11.0軟件，以代表性物種的miR-10b-5p序列的前體序列miR-10b構(gòu)建基于距離參數(shù)的鄰接法系統(tǒng)發(fā)育進化樹，結(jié)果如圖2所示，miR-10b前體序列在哺乳類中的靈長目、嚙齒目、 鳥類、 魚類中各自先聚為一支， 然后再共同聚為一類。這表明miR-10b基因在各個物種內(nèi)是保守的。

圖2 miR-10b基因家族系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of the miR-10b gene family

2.4 miR-10b-5p靶基因預(yù)測及功能分析

使用3種miRNA在線靶基因預(yù)測軟件microT、miRDB和TargetScan分別預(yù)測到67、107和228個雞miR-10b-5p靶基因，取3個軟件的并集共得到300個靶基因（圖3）。

圖3 雞miR-10b-5p靶基因預(yù)測結(jié)果Fig.3 Prediction results of target genes of miR-10b-5p in chickens

對預(yù)測獲得的靶基因使用在線工具DAVID進行GO功能分析，結(jié)果如圖4所示，在生物過程分類中，靶基因主要富集到端粒異染色質(zhì)組裝、染色體凝聚負調(diào)控、著絲粒復(fù)合體組裝的調(diào)控、心周異染色質(zhì)組裝和基因表達的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等;在細胞組分分類中，靶基因主要富集到組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、細胞質(zhì)核周區(qū)和細胞質(zhì)膜;在分子功能分類中，靶基因主要富集到電壓門控鈉通道活性，RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子活性、配體激活序列特異性DNA結(jié)合，轉(zhuǎn)錄抑制物活性、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)序列特異性結(jié)合，RNA聚合酶Ⅱ遠端增強子序列特異性DNA結(jié)合，類固醇激素受體。

圖4 靶基因GO功能富集分析Fig.4 GO function enrichment analysis of target genes

對靶基因進行KEGG通路富集分析，結(jié)果如表3所示，靶基因主要富集到Wnt信號通路（Wnt signaling pathway）、RNA轉(zhuǎn)運（RNA transport）和p53信號通路（p53 signaling pathway）。 多個與肌肉生長及細胞增殖等相關(guān)的基因富集到相關(guān)通路之上，如細胞周期蛋白D3（Cyclin D3，CCND3）、WNT9A（wingless-type MMTV integration site family,member 9A，WNT9A）、BTRC（Beta-transducin repeat containing E3 ubiquitin protein ligase，BTRC）和S相激酶相關(guān)蛋白1（S-phase kinase-associated protein 1，SKP1）等。

表3 miR-10b-5p家族預(yù)測靶基因的KEGG信號通路數(shù)據(jù)庫富集分析結(jié)果Table 3 KEGG pathway exrichment results of miR-10b-5p predicted target genes

2.5 miR-10b-5p在雞不同日齡和不同組織中的相對表達量

對心臟、肝臟、卵巢和胸肌等不同組織miR-10b-5p進行了檢測，結(jié)果如圖5所示，miR-10b-5p在檢測的各個組織中均有表達；3日齡時大腦、小腦、垂體、胸肌和腿肌中miR-10b-5p表達量顯著高于心臟、下丘腦、腎臟和肺臟等組織（P<0.05）；90日齡時，垂體、胸肌、腿肌和大腦中miR-10b-5p表達量顯著高于其他組織（P<0.05）。與3日齡雛雞相比，90日齡雞垂體、胸肌和腿肌中miR-10b-5p表達量均顯著上升（P<0.05）。

①同一日齡不同組織間比較，肩標不同字母表示差異顯著（P<0.05）；肩標相同字母表示差異不顯著（P>0.05）。②同一組織不同日齡間比較，*，差異顯著（P<0.05）；無*，差異不顯著（P>0.05）①Comparison between different tissues at the same age,values with different letter superscripts mean significant difference （P<0.05）;While with the same letter superscripts mean no significant difference （P>0.05）.②Comparison between different ages of the same tissue，*，Significant difference （P<0.05）；No *，No significant difference （P>0.05）圖5 miR-10b-5p在不同日齡雞組織中的相對表達量Fig.5 Relative expression of miR-10b-5p in different tissues of chickens at the different age

3 討 論

miRNA作為一種內(nèi)源性調(diào)控因子，參與了畜禽多種生物調(diào)控，如細胞增殖、分化及凋亡等。miRNA要發(fā)揮其調(diào)控作用，主要是作用在靶基因3′-UTR區(qū)，形成沉默復(fù)合物，使得靶基因翻譯受到抑制，從而發(fā)揮調(diào)控功能。準確找到miRNA的靶基因，對于研究miRNA功能至關(guān)重要。而目前的研究方法主要是前期通過生物信息學方法進行預(yù)測，后期通過敲除或者干擾試驗來驗證其靶向關(guān)系。

miR-10b-5p是miR-10b的5′-端成熟miRNA，在人類中，miR-10b定位于2號染色體上，位于HOXD4與HOXD8基因間隔區(qū)。 而在雞中，miR-10b定位于7號染色體上，位于HOXD3與HOXD13基因間隔區(qū)。在其他物種中也發(fā)現(xiàn)miR-10b都在HOX基因簇中，這說明miR-10b和HOX基因關(guān)系密切，HOX基因在動物發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，miR-10b和HOX基因可能共同參與調(diào)控動物的發(fā)育過程。方芳[6]對多羔和單羔奶山羊發(fā)情期卵巢組織差異表達的miRNAs進行篩選，對獲得的差異表達顯著的miR-10b靶基因以及在卵巢顆粒細胞中的表達進行分析，通過熒光素酶報告載體和實時熒光定量PCR驗證BDNF是miR-10b的靶基因，miR-10b通過抑制BDNF基因的表達從而抑制卵巢顆粒細胞活性。郭樂薇等[19]將miR-10b模擬物和miRNA模擬物轉(zhuǎn)染到牛卵巢顆粒細胞中發(fā)現(xiàn)，凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Bcl-2和Bax表達量顯著下降，說明miR-10b可促進牛卵巢顆粒細胞凋亡。因此，miR-10b-5p在顆粒細胞中主要是抑制某些基因的表達，促進細胞凋亡。目前在多個繁殖相關(guān)組織中都篩選出了miR-10b-5p[7,10,11,20-22]。本研究對miR-10b-5p進行組織表達分析，發(fā)現(xiàn)在大腦、小腦、垂體、胸肌、腿肌和卵巢中表達量均較高。 對3和90日齡的組織器官中miR-10b-5p表達變化進行檢測，發(fā)現(xiàn)90日齡垂體、胸肌和腿肌中miR-10b-5p表達量均顯著高于3日齡。其原因可能是在生長后期miR-10b-5p同樣會抑制生長相關(guān)基因的表達，使得生長速度減慢，這在一定程度上說明miR-10b-5p可作為評價雞生長速度的一個標志物，進而指導(dǎo)肉雞選育工作。

在對miR-10b-5p進行基因定位分析發(fā)現(xiàn)，雞miR-10b-5p位于7號染色體上的基因間隔區(qū)，這與以往的研究類似[12,23-24]。推測可能是由于其位于基因間隔區(qū)，在不破壞附近基因結(jié)構(gòu)的情況下可以調(diào)控上下游基因的表達，提高了調(diào)控效率。通過對常見物種miR-10b-5p成熟序列比對分析發(fā)現(xiàn)，不同物種miR-10b-5p的成熟序列物種間較為保守。進化樹分析發(fā)現(xiàn)，miR-10b前體序列在靈長類、嚙齒類、魚類和鳥類中各自先聚為一支，然后再共同聚為一類，這也證明了miR-10b基因在各個物種內(nèi)是保守的。目前，通過對以往的文獻[25-26]分析可知，對miRNA靶基因的預(yù)測和生物信息學分析主要是通過JASPAR、PROMO、miRanda、RNAhybrid、miRDB、miRWalk和TargetScan等生物信息學軟件進行，本研究選取了其中3個常用的在線軟件進行了預(yù)測。 靶基因預(yù)測和功能分析發(fā)現(xiàn)，miR-10b-5p共有300個靶基因。GO功能分析結(jié)果表明，靶基因主要富集到染色質(zhì)組裝和基因表達的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子活性和RNA聚合酶Ⅱ遠端增強子序列特異性DNA結(jié)合等功能。KEGG通路富集分析表明，靶基因主要富集到Wnt和p53信號通路，這些信號通路與肌肉生長發(fā)育、細胞增殖分化密切相關(guān)。

4 結(jié) 論

本試驗研究了miR-10b-5p在蘇禽3號雞不同生長階段組織中的表達規(guī)律，發(fā)現(xiàn)miR-10b-5p在雞各組織中都廣泛表達，在垂體、胸肌、腿肌中高表達；miR-10b進化過程是保守的；其可能通過Wnt及p53信號通路調(diào)控肌肉細胞增殖分化，進而調(diào)控雞肌肉生長發(fā)育。