黃正洋，趙振華，黃華云，李春苗，王錢保，穆春宇，黎壽豐

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，揚(yáng)州 225009）

在表觀遺傳學(xué)研究領(lǐng)域，microRNA研究是一個(gè)越來越受到關(guān)注的研究熱點(diǎn)。microRNA是一種序列高度保守的單鏈非編碼小分子RNA，長(zhǎng)度19～25個(gè)核苷酸[1-2],主要是通過與靶基因的3′-非翻譯區(qū)結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體，從而抑制靶基因翻譯，起著負(fù)調(diào)控的作用。研究表明，miRNA參與了動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育過程中大量基因的表達(dá)調(diào)控，如細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等，進(jìn)而調(diào)控動(dòng)物的肌肉發(fā)育以及繁殖等過程[3-4]。

miR-10家族是一個(gè)非編碼RNA家族，主要包括miR-10a、miR-10b和miR-10c這3個(gè)大類，每個(gè)大類同時(shí)還會(huì)有來自前體序列5′-端臂和3′-端臂加工而來的成熟體miRNA。miR-10位于HOX（homeobox family）基因簇內(nèi)，HOX基因是一類編碼高度保守、含有同源結(jié)構(gòu)域的DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，在生物形態(tài)發(fā)育過程中起著重要作用。miR-10b-5p是來自miR-10b的5′-端臂的成熟體形式，在調(diào)控細(xì)胞增殖凋亡中起著重要的功能。目前，已經(jīng)對(duì)miR-10在小鼠[5]、山羊[6-8]、豬[9-11]和鵝[12]等物種上的功能進(jìn)行了研究，主要研究了在組織間的表達(dá)差異、肌肉生長(zhǎng)發(fā)育、對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞的影響以及對(duì)精子發(fā)生過程的調(diào)控。

鑒于miR-10b-5p與肌肉生長(zhǎng)、細(xì)胞增殖分化和顆粒細(xì)胞凋亡密切關(guān)系，以蘇禽3號(hào)肉雞為試驗(yàn)動(dòng)物，通過檢索獲得常見脊椎動(dòng)物的miR-10b-5p序列，并進(jìn)行相應(yīng)分析；利用數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)確定miR-10b-5p在基因組中的位置，根據(jù)成熟序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；使用多個(gè)在線軟件預(yù)測(cè)miR-10b-5p靶基因，并進(jìn)行GO功能和KEGG通路分析；利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)不同生長(zhǎng)時(shí)期miR-10b-5p組織表達(dá)變化，為進(jìn)一步揭示miR-10b-5p在雞肌肉生長(zhǎng)及細(xì)胞增殖分化中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)選取中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所邵伯試驗(yàn)基地選育的蘇禽3號(hào)肉雞。選取體重接近的1日齡健康個(gè)體600只，佩戴翅號(hào)，組建試驗(yàn)群體。在相同管理?xiàng)l件下飼養(yǎng)，自由采食及飲水，常規(guī)程序免疫接種。3日齡（生長(zhǎng)初期）和90日齡（上市前）時(shí)，隨機(jī)選取5只進(jìn)行放血屠宰，分別采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸肌、腿肌、卵巢、大腦、小腦、垂體和下丘腦等組織樣品，立即置于液氮中，帶回實(shí)驗(yàn)室后-70 ℃保存，用于總RNA提取。

1.2 主要試劑和儀器

miRcute miRNA提取分離試劑盒（DP501）、miRcute增強(qiáng)型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒（KR211）、增強(qiáng)型miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒（FP411）均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。Applied Biosystems 7500熒光定量PCR系統(tǒng)購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司。

1.3 miR-10b-5p序列的獲得

從miRBase 22.1（http:∥www.mirbase.org/）[13]中下載全部物種miRNA成熟序列，篩選miR-10b-5p序列，去除植物等物種的序列，只保留脊椎動(dòng)物的成熟序列及前體序列。經(jīng)過篩選，選取以下物種的miR-10b-5p序列：牛（Bostaurus，登錄號(hào)：MIMAT0003839）、家犬（Canisfamiliaris，登錄號(hào)：MIMAT0009837）、山羊（Caprahircus，登錄號(hào)：MIMAT0035913）、豚鼠（Caviaporcellus，登錄號(hào)：MIMAT0046847）、錦龜（Chrysemyspicta，登錄號(hào)：MIMAT0037627）、原鴿（Columbalivia，登錄號(hào)：MIMAT0038406）、灰倉(cāng)鼠（Cricetulusgriseus，登錄號(hào)：MIMAT0023737）、鯉魚（Cyprinuscarpio，登錄號(hào)：MIMAT0026200）、斑馬魚（Daniorerio，登錄號(hào)：MIMAT0001268）、馬（Equuscaballus，MIMAT0013090）、大西洋鱈魚（Gadusmorhua，MIMAT0044188）、紅色原雞（Gallusgallus，登錄號(hào)：MIMAT0001148）、大猩猩（Gorillagorilla，登錄號(hào)：MIMAT0002491）、人（Homosapiens，登錄號(hào)：MIMAT0000254）、獼猴（Macacamulatta，登錄號(hào)：MIMAT0006162）、小鼠（Musmusculus，登錄號(hào)：MIMAT0000208）、鴨嘴獸（Ornithorhynchusanatinus，登錄號(hào)：MIMAT0007218）、家兔（Oryctolaguscuniculus，登錄號(hào)：MIMAT0048099）、綿羊（Ovisaries，登錄號(hào)：MIMAT0030031）、黑猩猩（Pantroglodytes，登錄號(hào)：MIMAT0007945）、狐蝠（Pteropusalecto，登錄號(hào)：MIMAT0039899）、褐家鼠（Rattusnorvegicus，登錄號(hào)：MIMAT0000783）、大西洋鮭魚（Salmosalar，登錄號(hào)：MIMAT0032295）、野豬（Susscrofa，登錄號(hào)：MIMAT0013885）。

1.4 miR-10b-5p基因定位及序列分析

由于成熟序列較短,可能在基因組中有多個(gè)定位，因此，采用Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)的BLAST程序（http:∥asia.ensembl.org/index.html），以雞、山羊、家兔、野豬、牛和斑馬魚等12個(gè)物種的miR-10b-5p前體序列作為查詢序列，對(duì)其基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索，以確定miR-10b-5p在基因組染色體上中的位置。 選取24種典型物種的24條miR-10b-5p的成熟序列，使用Mega 11.0軟件[14]（https:∥www.megasoftware.net/）中Clustal W程序?qū)iR-10b-5p基因的成熟序列進(jìn)行多序列比對(duì)（multiple sequences alignment，MSA），分析序列特點(diǎn)。

1.5 系統(tǒng)發(fā)生分析

為使得構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹更加準(zhǔn)確，選取24種典型物種的24條miR-10b-5p的前體序列，使用Mega 11.0軟件中Clustal W程序進(jìn)行多序列比對(duì)分析，采用基于距離參數(shù)的鄰接法（Neighbor-joining,NJ），并自展分析（Bootstrap）1 000次，構(gòu)建miR-10b-5p基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.6 miR-10b-5p靶基因預(yù)測(cè)及功能分析

利用3個(gè)在線軟件microT[15]（http:∥diana.imis.athena-innovation.gr/DianaTools/index.php?r=microtv4/index）、miRDB[16]（http:∥www.mirdb.org）和TargetScan[17]（http:∥www.targetscan.org/vert_71/）預(yù)測(cè)gga-miR-10b-5p的靶基因，取3個(gè)軟件的交集以降低預(yù)測(cè)結(jié)果的假陽(yáng)性。對(duì)獲得的靶基因使用在線工具DAVID[18]（https:∥david.ncifcrf.gov/）進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析。

1.7 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)NCBI上紅色原雞gga-miR-10b-5p序列（登錄號(hào)：NR_031440.1），利用miRNA Design v.1.01軟件采用加尾法設(shè)計(jì)引物進(jìn)行定量分析，以U6為內(nèi)參基因，引物信息見表1。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 miR-10b-5p 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物Table 1 Sequences of the oligonucleotide primers for Real-time quantitative PCR

1.8 miRNA提取及反轉(zhuǎn)錄

采用miRcute miRNA提取分離試劑盒提取各組織樣品miRNA。每個(gè)樣品取3 μL總RNA，使用miRcute增強(qiáng)型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒，進(jìn)行miRNA第一鏈cDNA的反轉(zhuǎn)錄（采用加A法）。反應(yīng)體系：Total RNA 2 μg，2×miRNA RT Reaction Buffer 10 μL，1×miRNA RT Enzyme Mix 2 μL，RNase-free ddH2O補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)程序：42 ℃ 60 min；95 ℃ 3 min。合成的cDNA反應(yīng)液置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.9 miR-10b-5p在雞不同組織內(nèi)的定量表達(dá)檢測(cè)

采用SYBR Green Ⅰ嵌合熒光法檢測(cè)心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸肌、腿肌、卵巢、大腦、小腦、垂體和下丘腦等組織樣品中miR-10b-5p表達(dá)量，反應(yīng)條件和程序按照miRcute增強(qiáng)型miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒說明書操作。PCR反應(yīng)在Applied Biosystems 7500熒光定量PCR系統(tǒng)中進(jìn)行，U6基因作為內(nèi)參。

1.10 統(tǒng)計(jì)分析

采用2-ΔΔCt法分析miR-10b-5p在雞不同組織中的相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)樣品重復(fù)3次。試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用SPSS 26.0軟件獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 miR-10b-5p家族分析

通過文獻(xiàn)和miRBase檢索共獲得59種動(dòng)物的59條miR-10b-5p序列，即所查到的每種動(dòng)物中都只有1種miR-10b-5p形式。由于miR-10b家族基因數(shù)量的不同，導(dǎo)致miR-10b-5p呈現(xiàn)出以下2種形式：miR-10b和miR-10b-5p。在雞中miR-10b的成熟體形式為miR-10b-5p。選取了常見的紅色原雞、山羊、兔、人、斑馬魚等12個(gè)物種的miR-10b-5p前體序列作為查詢序列（query sequence），通過BLAST搜索確定各序列在基因組中的位置，如表2所示?；蚨ㄎ伙@示，與其他miRNA類似，miR-10b-5p大部分都位于基因的間隔區(qū)（intergenic region，IGR），雞miR-10b-5p定位在7號(hào)染色體上，位于HOX基因家族基因間隔區(qū)。

表2 miR-10b-5p基因家族在基因組中的定位Table 2 Genomic location of miR-10b-5p gene family

2.2 miR-10b-5p序列分析

選取24種典型物種的24條miR-10b-5p的成熟序列進(jìn)行多序列比對(duì)分析，結(jié)果如圖1所示，miR-10b-5p的成熟序列相似性很高，序列長(zhǎng)度（22～24 nt）相近，保守的堿基數(shù)19個(gè)，分別為第3-18和20-22位堿基，說明miR-10b-5p在不同物種間具有高度保守性。比對(duì)結(jié)果顯示，miR-10b-5p在部分物種在前兩位和最后兩位堿基存在不同程度缺失，在大西洋鱈魚第19位堿基出現(xiàn)了U>G的突變。

*，表示序列一致；-，表示堿基缺失*，Represent highly conserved bases；-，Indicate base deletion圖1 miR-10b-5p基因家族的成熟序列比對(duì)Fig.1 Multiple sequence alignment of mature sequence of miR-10b-5p gene family

2.3 miR-10b-5p系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

采用Mega 11.0軟件，以代表性物種的miR-10b-5p序列的前體序列miR-10b構(gòu)建基于距離參數(shù)的鄰接法系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果如圖2所示，miR-10b前體序列在哺乳類中的靈長(zhǎng)目、嚙齒目、 鳥類、 魚類中各自先聚為一支， 然后再共同聚為一類。這表明miR-10b基因在各個(gè)物種內(nèi)是保守的。

圖2 miR-10b基因家族系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of the miR-10b gene family

2.4 miR-10b-5p靶基因預(yù)測(cè)及功能分析

使用3種miRNA在線靶基因預(yù)測(cè)軟件microT、miRDB和TargetScan分別預(yù)測(cè)到67、107和228個(gè)雞miR-10b-5p靶基因，取3個(gè)軟件的并集共得到300個(gè)靶基因（圖3）。

圖3 雞miR-10b-5p靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.3 Prediction results of target genes of miR-10b-5p in chickens

對(duì)預(yù)測(cè)獲得的靶基因使用在線工具DAVID進(jìn)行GO功能分析，結(jié)果如圖4所示，在生物過程分類中，靶基因主要富集到端粒異染色質(zhì)組裝、染色體凝聚負(fù)調(diào)控、著絲粒復(fù)合體組裝的調(diào)控、心周異染色質(zhì)組裝和基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等;在細(xì)胞組分分類中，靶基因主要富集到組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)和細(xì)胞質(zhì)膜;在分子功能分類中，靶基因主要富集到電壓門控鈉通道活性，RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子活性、配體激活序列特異性DNA結(jié)合，轉(zhuǎn)錄抑制物活性、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)序列特異性結(jié)合，RNA聚合酶Ⅱ遠(yuǎn)端增強(qiáng)子序列特異性DNA結(jié)合，類固醇激素受體。

圖4 靶基因GO功能富集分析Fig.4 GO function enrichment analysis of target genes

對(duì)靶基因進(jìn)行KEGG通路富集分析，結(jié)果如表3所示，靶基因主要富集到Wnt信號(hào)通路（Wnt signaling pathway）、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)（RNA transport）和p53信號(hào)通路（p53 signaling pathway）。 多個(gè)與肌肉生長(zhǎng)及細(xì)胞增殖等相關(guān)的基因富集到相關(guān)通路之上，如細(xì)胞周期蛋白D3（Cyclin D3，CCND3）、WNT9A（wingless-type MMTV integration site family,member 9A，WNT9A）、BTRC（Beta-transducin repeat containing E3 ubiquitin protein ligase，BTRC）和S相激酶相關(guān)蛋白1（S-phase kinase-associated protein 1，SKP1）等。

表3 miR-10b-5p家族預(yù)測(cè)靶基因的KEGG信號(hào)通路數(shù)據(jù)庫(kù)富集分析結(jié)果Table 3 KEGG pathway exrichment results of miR-10b-5p predicted target genes

2.5 miR-10b-5p在雞不同日齡和不同組織中的相對(duì)表達(dá)量

對(duì)心臟、肝臟、卵巢和胸肌等不同組織miR-10b-5p進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果如圖5所示，miR-10b-5p在檢測(cè)的各個(gè)組織中均有表達(dá)；3日齡時(shí)大腦、小腦、垂體、胸肌和腿肌中miR-10b-5p表達(dá)量顯著高于心臟、下丘腦、腎臟和肺臟等組織（P<0.05）；90日齡時(shí)，垂體、胸肌、腿肌和大腦中miR-10b-5p表達(dá)量顯著高于其他組織（P<0.05）。與3日齡雛雞相比，90日齡雞垂體、胸肌和腿肌中miR-10b-5p表達(dá)量均顯著上升（P<0.05）。

①同一日齡不同組織間比較，肩標(biāo)不同字母表示差異顯著（P<0.05）；肩標(biāo)相同字母表示差異不顯著（P>0.05）。②同一組織不同日齡間比較，*，差異顯著（P<0.05）；無*，差異不顯著（P>0.05）①Comparison between different tissues at the same age,values with different letter superscripts mean significant difference （P<0.05）;While with the same letter superscripts mean no significant difference （P>0.05）.②Comparison between different ages of the same tissue，*，Significant difference （P<0.05）；No *，No significant difference （P>0.05）圖5 miR-10b-5p在不同日齡雞組織中的相對(duì)表達(dá)量Fig.5 Relative expression of miR-10b-5p in different tissues of chickens at the different age

3 討 論

miRNA作為一種內(nèi)源性調(diào)控因子，參與了畜禽多種生物調(diào)控，如細(xì)胞增殖、分化及凋亡等。miRNA要發(fā)揮其調(diào)控作用，主要是作用在靶基因3′-UTR區(qū)，形成沉默復(fù)合物，使得靶基因翻譯受到抑制，從而發(fā)揮調(diào)控功能。準(zhǔn)確找到miRNA的靶基因，對(duì)于研究miRNA功能至關(guān)重要。而目前的研究方法主要是前期通過生物信息學(xué)方法進(jìn)行預(yù)測(cè)，后期通過敲除或者干擾試驗(yàn)來驗(yàn)證其靶向關(guān)系。

miR-10b-5p是miR-10b的5′-端成熟miRNA，在人類中，miR-10b定位于2號(hào)染色體上，位于HOXD4與HOXD8基因間隔區(qū)。 而在雞中，miR-10b定位于7號(hào)染色體上，位于HOXD3與HOXD13基因間隔區(qū)。在其他物種中也發(fā)現(xiàn)miR-10b都在HOX基因簇中，這說明miR-10b和HOX基因關(guān)系密切，HOX基因在動(dòng)物發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，miR-10b和HOX基因可能共同參與調(diào)控動(dòng)物的發(fā)育過程。方芳[6]對(duì)多羔和單羔奶山羊發(fā)情期卵巢組織差異表達(dá)的miRNAs進(jìn)行篩選，對(duì)獲得的差異表達(dá)顯著的miR-10b靶基因以及在卵巢顆粒細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)行分析，通過熒光素酶報(bào)告載體和實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證BDNF是miR-10b的靶基因，miR-10b通過抑制BDNF基因的表達(dá)從而抑制卵巢顆粒細(xì)胞活性。郭樂薇等[19]將miR-10b模擬物和miRNA模擬物轉(zhuǎn)染到牛卵巢顆粒細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Bcl-2和Bax表達(dá)量顯著下降，說明miR-10b可促進(jìn)牛卵巢顆粒細(xì)胞凋亡。因此，miR-10b-5p在顆粒細(xì)胞中主要是抑制某些基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。目前在多個(gè)繁殖相關(guān)組織中都篩選出了miR-10b-5p[7,10,11,20-22]。本研究對(duì)miR-10b-5p進(jìn)行組織表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)在大腦、小腦、垂體、胸肌、腿肌和卵巢中表達(dá)量均較高。 對(duì)3和90日齡的組織器官中miR-10b-5p表達(dá)變化進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)90日齡垂體、胸肌和腿肌中miR-10b-5p表達(dá)量均顯著高于3日齡。其原因可能是在生長(zhǎng)后期miR-10b-5p同樣會(huì)抑制生長(zhǎng)相關(guān)基因的表達(dá)，使得生長(zhǎng)速度減慢，這在一定程度上說明miR-10b-5p可作為評(píng)價(jià)雞生長(zhǎng)速度的一個(gè)標(biāo)志物，進(jìn)而指導(dǎo)肉雞選育工作。

在對(duì)miR-10b-5p進(jìn)行基因定位分析發(fā)現(xiàn)，雞miR-10b-5p位于7號(hào)染色體上的基因間隔區(qū)，這與以往的研究類似[12,23-24]。推測(cè)可能是由于其位于基因間隔區(qū)，在不破壞附近基因結(jié)構(gòu)的情況下可以調(diào)控上下游基因的表達(dá)，提高了調(diào)控效率。通過對(duì)常見物種miR-10b-5p成熟序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，不同物種miR-10b-5p的成熟序列物種間較為保守。進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，miR-10b前體序列在靈長(zhǎng)類、嚙齒類、魚類和鳥類中各自先聚為一支，然后再共同聚為一類，這也證明了miR-10b基因在各個(gè)物種內(nèi)是保守的。目前，通過對(duì)以往的文獻(xiàn)[25-26]分析可知，對(duì)miRNA靶基因的預(yù)測(cè)和生物信息學(xué)分析主要是通過JASPAR、PROMO、miRanda、RNAhybrid、miRDB、miRWalk和TargetScan等生物信息學(xué)軟件進(jìn)行，本研究選取了其中3個(gè)常用的在線軟件進(jìn)行了預(yù)測(cè)。 靶基因預(yù)測(cè)和功能分析發(fā)現(xiàn)，miR-10b-5p共有300個(gè)靶基因。GO功能分析結(jié)果表明，靶基因主要富集到染色質(zhì)組裝和基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子活性和RNA聚合酶Ⅱ遠(yuǎn)端增強(qiáng)子序列特異性DNA結(jié)合等功能。KEGG通路富集分析表明，靶基因主要富集到Wnt和p53信號(hào)通路，這些信號(hào)通路與肌肉生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞增殖分化密切相關(guān)。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)研究了miR-10b-5p在蘇禽3號(hào)雞不同生長(zhǎng)階段組織中的表達(dá)規(guī)律，發(fā)現(xiàn)miR-10b-5p在雞各組織中都廣泛表達(dá)，在垂體、胸肌、腿肌中高表達(dá)；miR-10b進(jìn)化過程是保守的；其可能通過Wnt及p53信號(hào)通路調(diào)控肌肉細(xì)胞增殖分化，進(jìn)而調(diào)控雞肌肉生長(zhǎng)發(fā)育。