徐 欣 朱緒偉 劉中文 周其明 張永君 郭 劍

(河南省蠶業(yè)科學研究院，河南鄭州 450008)

微孢子蟲是一類專性寄生的單細胞生物，廣泛寄生于脊椎和無脊椎動物，最先于家蠶體內發(fā)現(xiàn)，柞蠶微孢子蟲是引起柞蠶微粒子病的病原物[1]。微管是細胞骨架的重要組成部分，也是纖毛、鞭毛等運動性器官及中心粒的重要組分[2]，組成微管的蛋白質稱為微管蛋白，王勇[3]克隆得到了柞蠶微孢子蟲α、β、γ-微管蛋白基因并進行了進化分析，發(fā)現(xiàn)前2種是系統(tǒng)發(fā)育分析的靶基因，而γ-微管蛋白對α、β-微管的裝配、取向起著重要的調節(jié)作用。微管蛋白基因是一種持家基因(house-keeping genes)，又稱管家基因，冷赫[4]曾用β-微管蛋白基因作為蝗蟲微孢子蟲的持家基因，來檢測蝗蟲微孢子蟲孢壁蛋白的表達情況。

微孢子蟲的生命周期有感染期、裂殖增殖期和孢子增殖期3個階段[5]。孢子階段是微孢子蟲生活史中成熟的及具有侵染力的階段，也是研究微孢子蟲侵染機制、生活史及檢測診斷的關鍵[6]。微孢子蟲感染細胞途徑認為主要有2種：一是孢子發(fā)射極絲注射孢原質到宿主細胞以達到感染的目的，有的同時形成寄生空泡再次感染[7]；二是通過微孢子蟲孢壁的主要成分孢壁蛋白與宿主細胞的相互作用，來實現(xiàn)微孢子蟲對宿主的侵染，孢壁蛋白也是病原體免疫檢測的重要靶標蛋白[8]。孢壁蛋白在信號識別、細胞粘附和離子轉運等方面起著重要作用，并被證實是病原菌侵染過程中的重要蛋白[9]，同時，還有研究發(fā)現(xiàn)微孢子蟲孢壁的某些蛋白質被破壞，其孢子的感染能力顯著下降[10]。

柞蠶微孢子蟲是柞蠶病害防治中的重要檢疫對象，其傳播方式有水平傳播與垂直傳播，水平傳播即經口感染，引發(fā)柞蠶各種生理機能障礙[11]。但是關于在水平傳播關鍵時期，柞蠶微孢子蟲是如何完成對柞蠶侵染的研究尚屬空白；因此，本試驗根據(jù)前人研究進展，選取柞蠶微孢子蟲的α、β和γ-微管蛋白基因(GenBank登錄號分別是KF154086、KF023271、KF740389)，以及3條孢壁蛋白NpSWP8、NpSWP35、NpSWP1基因(GenBank登錄號分別是ABV48896.1、ABM30180.1、KJ573111)，共6條基因作為目的基因，在轉錄水平上研究微管蛋白基因、孢壁蛋白基因與柞蠶微孢子蟲侵染的關系，找到侵染初期更靈敏的持家基因和檢測基因，為后續(xù)進行柞蠶微孢子蟲侵染相關分子機理的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試柞蠶品種 豫大一號，由河南省柞蠶育種研究室培育提供。

1.1.2 供試柞蠶微孢子 在柞蠶育種室柞蠶微粒子病鏡檢過程中，收集病娥，去翅和頭部。柞蠶微孢子蟲孢子的分離純化采用姜義仁等[12]的Percoll密度梯度離心法。純化后液氮速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 主要試劑 動物組織總RNA提取試劑盒(RNAprep Pure Tissue Kit)、FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒[FastQuant RT Kit(with gDNase)]、2×Taq PCR MasterMix、熒光定量PCR試劑盒[SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)]、瓊脂糖、GeneGreen核酸染料、50×TAE Buffer(RT204)，均購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.4 主要儀器設備 超微量紫外可見分光光度計(DS-11)，美國丹諾爾Denovix公司產品；高速冷凍離心機(TGL16M)，湖南湘立科學儀器有限公司產品；PCR儀(9200型)，Applied Biosystems公司產品；實時熒光定量PCR儀(CFX96)，美國伯樂(Bio-Rad)公司產品；紫外可見分光光度計(UV2600)，島津儀器(蘇州)有限公司產品；凝膠成像儀(1600)，上海天能科技有限公司產品；熒光定量平蓋八排管(含蓋)，購自PCRLABSELECT公司；恒溫干燥箱(101-3S)，購自上海力辰儀器科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 柞蠶的微孢子蟲人工感染 將純化后的柞蠶微孢子蟲用生理鹽水稀釋至2×107個/mL的孢子懸液。將稀釋好的孢子懸液均勻噴灑到干凈的柞樹葉上，選取100頭4齡起蠶進行添毒喂養(yǎng)，保證每頭柞蠶食下的孢子數(shù)量為106個[13]，24 h后換成正常無毒柞樹葉飼育。

1.2.2 柞蠶感染微孢子蟲后中腸總RNA的提取以及cDNA的合成 在添食柞蠶微孢子蟲后的4齡2 d、4 d、6 d的3個取樣時間點，每個取樣時間點隨機選取10頭柞蠶幼蟲解剖出中腸作為樣品，并進行樣品混合，用液氮速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆?。用雙蒸水(ddH2O)把研缽、剪刀、鑷子等用具洗干凈，放在恒溫干燥箱內，160 ℃烘烤4 h備用。再使用動物組織總RNA提取試劑盒，按照其說明書的方法從感染柞蠶中腸中提取總RNA，提取的總RNA置于-80 ℃中保存?zhèn)溆谩Ｈ缓?，按照FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒說明書的步驟將RNA反轉錄為cDNA，反轉錄的cDNA置于-20 ℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物設計 以各樣品cDNA為模板進行PCR擴增，采用柞蠶肌動蛋白基因(Antheraea pernyi Actin，ApA)做陽性對照，對目的基因表達作差異性表達分析。用引物設計軟件Primer Premier 5.0設計12對目的基因特異引物和2對ApA內參基因引物(表1)。其中ApA-A為半定量RT-PCR(Sq RT-PCR)所用的內參基因引物，ApA-B為實時熒光定量PCR(RT-qPCR)所使用的內參基因引物；其余目的基因的A、B分別表示Sq RT-PCR和RT-qPCR所用的引物。

表1 6種侵染相關基因及內參ApA基因的引物序列

1.2.4 基因表達量的半定量PCR分析 PCR反應體系：2×Taq PCR Mastermix 12.5 μL，正向引物(10 μM)1 μL，反向引物(10 μM)1 μL，cDNA模板1 μL，添加焦碳酸二乙酯處理過并經高溫高壓滅菌的雙蒸水(RNase-free ddH2O)至總體積25 μL。反應采用0.2 mL管在PCR儀上進行，反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s為1個循環(huán)，循環(huán)數(shù)為35，然后72 ℃延伸7 min。

PCR產物在TAE電泳緩沖液(將50×TAE試劑稀釋成1×TAE電泳緩沖液)中，以1.2%瓊脂糖凝膠電泳0.5 h，經GeneGreen染色后在凝膠成像系統(tǒng)下觀察拍照?；虻南鄬Ρ磉_水平以其PCR產物電泳條帶和ApA基因PCR產物電泳條帶的積分光密度(integrated optical density，IOD)比值表示。

1.2.5 Real Time qPCR檢測 RT-qPCR的反應體系：2×SuperReal PreMix Plus(Probe)10 μL，正向引物(10 μM)0.6 μL，反向引物(10 μM)0.6 μL，cDNA模板1 μL，添加RNase-free ddH2O至總體積20 μL。RT-qPCR的反應程序：(1)預變性95 ℃ 15 min；(2)變性95 ℃ 10 s；(3)61 ℃ 1 min；(2)～(3)步40個循環(huán)(內參ApA基因為30個循環(huán))。溶解曲線分析：95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s；60 ℃ 15 s。

1.2.6 標準曲線的制定 將cDNA樣本稀釋1倍、10倍、100倍、1 000倍、10 000倍，制定ApA基因和6個目的基因的標準曲線。用模板的稀釋倍數(shù)的以2為底的log值對每個稀釋樣本的Ct值(即標準曲線y值)作圖，兩者呈線性遞減關系。并優(yōu)化Tm值、循環(huán)數(shù)等條件，保證qPCR反應的R2>0.98。

1.2.7 各基因表達量的熒光定量分析 以各種時期的cDNA為模板進行qPCR，ApA基因和6個目的基因均采用相同的PCR反應體系和反應程序，每個樣本3次重復。根據(jù)標準曲線的Ct值，確定樣本的稀釋倍數(shù)，用熒光定量PCR試劑盒[SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)]測出Ct值，將該值代入相應的標準曲線，求出x值，然后再求該值的power以2為底的函數(shù)，將目的基因的結果與A3基因的結果求比值，得到該基因表達量的相對定量值。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

所有的試驗均重復3次，試驗數(shù)據(jù)采用SAS 9.0數(shù)據(jù)分析軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 提取的RNA質量的鑒定

提取感染柞蠶微孢子蟲后的4齡柞蠶中腸總RNA，利用紫外可見分光光度計測定RNA的純度和濃度，A260/A280比值處于1.8～2.2之間，濃度>3 μg/μL，RNA質量滿足反轉錄的要求。如圖1所示，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢查RNA的完整性，結果核糖體RNA的幾條主帶28S、18S清晰可見。說明所抽提的RNA基本沒有降解，能夠進行反轉錄試驗。

0為RNase-free ddH2O，Maker為2 000 bp DNA Marke；圖2、圖3同。1、2、3分別為4齡柞蠶2、4、6 d中腸的RNA。圖1 甲醛變性凝膠電泳檢測提取的感染微孢子蟲后的4齡柞蠶中腸的RNA

2.2 反轉錄cDNA模板的檢測

以4齡柞蠶2 d、4 d、6 d中腸的cDNA為模板，用ApA引物進行PCR擴增，PCR產物可電泳檢測到468 bp的特異性條帶(圖2)，與PCR產物的理論分子量相符，證明合成的cDNA可以進行后續(xù)試驗。

1、2、3分別為4齡柞蠶2 d、4 d、6 d中腸的cDNA。圖2 ApA基因cDNA的PCR產物電泳圖

1為α-微管蛋白基因，2為β-微管蛋白基因，3為γ-微管蛋白基因，4為孢壁蛋白NpSWP8基因，5為孢壁蛋白NpSWP35基因，6為孢壁蛋白NpSWP1基因；圖4、圖5同。圖3 目的基因克隆的電泳圖

2.3 目的基因的克隆與測序

根據(jù)各個引物最佳擴增條件，用感染柞蠶微孢子蟲的4齡柞蠶中腸cDNA作為模板進行PCR。電泳結果顯示，可特異性擴增出柞蠶微孢子蟲α、β和γ-微管蛋白基因和孢壁蛋白NpSWP8、NpSWP35以及NpSWP1基因(圖3)。測序結果顯示，PCR產物的序列與各自已知的基因序列一致，說明設計的引物具特異性，可以進行后續(xù)的試驗。

2.4 RT-qPCR標準曲線

根據(jù)RT-qPCR標準曲線的制定方法，制定到α、β和γ-微管蛋白基因和孢壁蛋白NpSWP8、NpSWP35以及NpSWP1基因的標準曲線。其中，ApA基因的標準曲線為y=-0.934 2x+38.526，R2=0.992 4(x表示以2為底稀釋倍數(shù)的Log值，y表示Ct值，以下相同)；α-微管蛋白基因的標準曲線為y=-1.453 2x+39.928，R2=0.990 6；β-微管蛋白基因的標準曲線為y=-1.088 6x+34.956，R2=0.995 6；γ-微管蛋白基因的標準曲線為y=-1.292 3x+38.621，R2=0.983 1；孢壁蛋白NpSWP8基因的標準曲線為y=-1.246 6x+38.073，R2=0.992 5；孢壁蛋白NpSWP35基因的標準曲線為y=-1.192 7x+39.330，R2=0.982 2；孢壁蛋白NpSWP1基因的標準曲線為y=-1.240 4x+32.731，R2=0.994 6。擴增效率均大于94%，R2均大于0.97，與最優(yōu)條件相近，可以采用。

2.5 4齡柞蠶感染柞蠶微孢子蟲后不同發(fā)育時期侵染相關基因表達量的變化

在柞蠶4齡起蠶后添食柞蠶微孢子蟲，選取感染初期的3個時間點4齡2 d、4 d、6 d來檢測。由圖4的半定量RT-PCR分析結果可以看出，在添食柞蠶微孢子蟲后，與4齡2 d表達量對比，在4齡4 d的時間，3種微管蛋白基因和3種孢壁蛋白基因的表達量都先呈現(xiàn)顯著或者極顯著升高趨勢，由于微管蛋白基因是柞蠶微孢子蟲的持家基因，表達量較穩(wěn)定，其顯著升高，說明在添食后2～4 d時間內，柞蠶體內微孢子蟲的數(shù)量有增加趨勢；而孢壁蛋白基因NpSWP8顯著升高，NpSWP35、NpSWP1極顯著升高，且比微管蛋白基因的增加趨勢更加明顯，從這個結果可以看出該時間段伴隨著侵入數(shù)量的增加，柞蠶微孢子蟲侵染作用也增強，可能還存在多次侵染。然后到6 d時表達情況不一，α和γ-微管蛋白基因，孢壁蛋白NpSWP8、NpSWP35基因有持續(xù)增長，但增長幅度較4 d時降低，這符合侵染的一般規(guī)律，說明柞蠶微孢子蟲的侵染數(shù)量和效率先增加后趨于平緩；而β-微管蛋白基因、孢壁蛋白NpSWP1基因的表達量反而下降，在展示侵染過程中不合常規(guī)，這可能與這2個基因還參與其他生化反應有關，因此在研究柞蠶微孢子蟲侵染過程中不適合作為指示基因。

圖4 4齡柞蠶感染柞蠶微孢子蟲后不同發(fā)育時期侵染相關基因的Sq RT-PCR的表達量

圖5顯示，β-微管蛋白基因在添食后4 d與6 d表達量與2 d相比有極顯著的升高，α-微管蛋白基因與孢壁蛋白NpSWP35基因在添食后4 d呈現(xiàn)顯著升高，孢壁蛋白NpSWP8基因在4 d時有所升高，β-微管蛋白基因也隨著時間的延長有一定的增加趨勢，而γ-微管蛋白基因和孢壁蛋白NpSWP1基因的變化情況不明顯。但是總體上定量PCR結果不是很理想，這與定量引物設計有關，今后還將對其他柞蠶微孢子蟲的孢壁蛋白進行特異性引物的設計，尋找適合進行RT-qPCR分析的孢壁蛋白基因。

圖5 4齡柞蠶感染柞蠶微孢子蟲后不同發(fā)育時期侵染相關基因的RT-qPCR表達量

綜合Sq RT-PCR和RT-qPCR的結果，幾種目的基因在柞蠶微孢子蟲侵染后4 d都有較高的表達量差異變化，可以將添食后4 d作為侵染相關基因檢測的初始時間，而α-微管蛋白基因較其他2種微管蛋白基因更適合作為持家基因進行侵染相關過程的研究，孢壁蛋白NpSWP35基因較其他2種孢壁蛋白基因在侵染相關基因的轉錄水平上更靈敏。

3 小結與討論

以前人相關基因的研究為基礎，本試驗克隆得到柞蠶微孢子蟲侵染相關的6個基因，α-微管蛋白基因、β-微管蛋白基因、γ-微管蛋白基因和孢壁蛋白NpSWP8、孢壁蛋白NpSWP35以及孢壁蛋白NpSWP1基因，并運用半定量PCR和熒光定量PCR的方法，在柞蠶4齡起蠶添食后的2 d、4 d、6 d這3個初期階段，進行了柞蠶微孢子蟲侵染相關的6個基因的表達差異分析。在進行結果分析時，試驗中采用的是柞蠶體內的ApA基因作為內參基因進行對比，3種微管蛋白基因的相對表達量會有較大變化，沒有傳統(tǒng)意義上持家基因表達量較穩(wěn)定的情況，是由于本試驗將其作為目的基因進行分析，正是利用其在柞蠶微孢子蟲中穩(wěn)定表達的特性來體現(xiàn)柞蠶微孢子蟲侵入柞蠶體內的數(shù)量情況，并且在后續(xù)侵染機理研究中還將作為陽性對照進行相關試驗。

孢壁蛋白已經被證實與柞蠶微孢子蟲的侵染相關，本試驗半定量PCR結果中，也發(fā)現(xiàn)孢壁蛋白基因的表達變化比微管蛋白基因要靈敏，這應該與侵染初期的檢測時間有關。與柞蠶微孢子蟲侵染相關的蛋白或基因，除了本試驗選用的孢壁蛋白基因之外，還有微孢子蟲的極管蛋白，有研究證明極管蛋白在宿主細胞粘附及侵染的最后階段發(fā)揮作用[14]，但是還未在柞蠶微孢子蟲中分離和克隆到，今后將進行相關基因或蛋白的尋找，再將極管蛋白基因與孢壁蛋白基因進行對比，尋找更靈敏的柞蠶微孢子蟲侵染相關基因。