陳 聰，李 涵，馮彥博，林 豪，敬 舒，王春梅，李 賀，陳建光，孫靖輝

(1.北華大學(xué)藥學(xué)院，吉林 吉林 132013；2.北華大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 吉林 132011)

華中五味子是木蘭科植物華中五味子(Schis-andrasphenantheraRehd.et Wils)的成熟干燥果實(shí)，作為補(bǔ)益類(lèi)的代表藥物應(yīng)用于臨床已有2 000年之久[1].華中五味子的有效活性成分包括木脂素、揮發(fā)油、有機(jī)酸及多糖等，其中木脂素是華中五味子主要的活性成分[2-3].

安五脂素是華中五味子具有代表性的木脂素成分，也是鑒定華中五味子的標(biāo)志性成分[4].本課題組前期[5]發(fā)現(xiàn)安五脂素具有很好的抗氧化作用，能夠改善由腸缺血再灌注所導(dǎo)致的大鼠肝臟損傷，通過(guò)激活Nrf2/ARE通路和調(diào)節(jié)Caspase-3、Bcl2與Bax進(jìn)而調(diào)節(jié)D-半乳糖所致衰老小鼠的免疫功能[6]，還能夠明顯提高氧化應(yīng)激所導(dǎo)致的心臟損傷[7]和抗疲勞作用[8-9]，目前關(guān)于安五脂素的藥代動(dòng)力學(xué)研究鮮有報(bào)道.

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用高效液相色譜法對(duì)安五脂素在小鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特征和組織分布進(jìn)行分析，為其作為候選藥物的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供數(shù)據(jù)支持和參考.

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

安五脂素標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98%，成都普菲德公司)；五味子酯甲(內(nèi)標(biāo)，純度>98%，成都普菲德公司)；色譜甲醇(天津市永大化學(xué)試劑公司).

1.2 實(shí)驗(yàn)小鼠

雄性ICR小鼠(長(zhǎng)春億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：SCXK(吉)2020-0003)18～22 g，小鼠在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備

高效液相色譜(Thermo公司，美國(guó))；小型臺(tái)式冷凍離心機(jī)(Eppendorf 公司，德國(guó))；組織勻漿機(jī)(上海左樂(lè)儀器有限公司).

1.4 高效液相色譜條件

高效液相色譜的分離柱為C18柱(100 mm×30 mm，18 μm，600 bar)，柱溫設(shè)置為32 ℃，吸光度230 nm.色譜甲醇和水分別作為流動(dòng)相A和B，設(shè)置梯度的洗脫程序：0～15 min (75%～90% A)，10～15 min (90%～100% A)，15～18 min (100%～75% A).流速設(shè)置為1 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL.

1.5 安五脂素在小鼠體內(nèi)的血漿藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

1.5.1 血漿和組織標(biāo)準(zhǔn)品的制備

以甲醇為溶劑將安五脂素標(biāo)準(zhǔn)品和五味子酯甲內(nèi)標(biāo)配置濃度為100 μg/mL和4 μg/mL.將不同體積的安五脂素標(biāo)準(zhǔn)品母液和200 μL五味子酯甲加入200 μL空白小鼠血液(或組織勻漿液)中混勻.最終配置安五脂素濃度為0.01、0.05、0.2、0.5、1、2、5 μg/mL的血漿(組織)標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)樣品中五味子酯甲濃度為4 μg/mL.

1.5.2 安五脂素給藥及血漿樣品臟器組織的采集和制備

給予36只小鼠口服灌胃安五脂素，劑量為10 mg/kg(給藥前12 h禁食不禁水)，給藥后于0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24、36、48 h的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)選取3只小鼠，將小鼠置于干燥器內(nèi)，干燥器下部放入10 mL左右的乙醚，約0.5 min小鼠進(jìn)入麻醉狀態(tài)，麻醉后通過(guò)摘眼球取血200 μL，取心、肝、脾、肺、腎和腦組織，將生理鹽水勻漿(1∶9)加入200 μL五味子酯甲(4 μg/mL)中，進(jìn)行樣品前處理.

1.6 方法學(xué)考察

1.6.1 專(zhuān)屬性

通過(guò)比較6個(gè)不同批次的小鼠空白血漿(組織)、加入安五脂素和內(nèi)標(biāo)的空白血漿(組織)樣品，進(jìn)行專(zhuān)屬性考察，觀察空白血漿(組織)是否對(duì)安五脂素和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間和峰面積有干擾.

1.6.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)、定量限(LOQ)和檢出限(LOD)

選取各濃度梯度的安五脂素血漿(組織)標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過(guò)繪制安五脂素/內(nèi)標(biāo)的峰面積與安五脂素濃度的關(guān)系曲線(xiàn)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn).記錄安五脂素的色譜峰面積，以信噪比10∶1為定量限，以信噪比3∶1作為檢測(cè)限.

1.6.3 精密度和準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)

精密度和準(zhǔn)確度通過(guò)日內(nèi)(3個(gè)不同濃度QC樣本，每個(gè)濃度6個(gè)重復(fù)樣本，測(cè)定3次)和日間(連續(xù)3 d)分析的變異結(jié)果進(jìn)行評(píng)估，通過(guò)峰面積計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，以RSD小于20%為宜.

1.6.4 穩(wěn)定性考察

將3個(gè)不同濃度的QC樣本(每個(gè)濃度6個(gè)重復(fù)樣本)經(jīng)過(guò)3個(gè)凍融循環(huán)(從-20 ℃到室溫條件)進(jìn)行穩(wěn)定性考察，記錄各色譜峰的相對(duì)峰面積，以峰面積計(jì)算RSD.

2 結(jié) 果

2.1 方法學(xué)驗(yàn)證

安五脂素(100 μg/mL)和五味子酯甲內(nèi)標(biāo)(IS，4 μg/mL)的保留時(shí)間分別為11.91 min和7.42 min.在安五脂素和IS的保留時(shí)間內(nèi)未觀察到內(nèi)源性干擾.

本研究中安五脂素在各樣本中的精確度的RSD值<5.6%，準(zhǔn)確度的RSD值<6.2%，平均回收率在92.7%～98.5%之間，穩(wěn)定性<3.4%，說(shuō)明本研究的方法學(xué)考察表明結(jié)果可信.見(jiàn)圖1.

圖1 小鼠血漿中安五脂素和五味子酯甲的色譜圖Fig.1 Chromatgram of Anwulignan and Schisandrin A.in mouse plasma

2.2 安五脂素的吸收和體內(nèi)分布

給小鼠灌胃安五脂素后，將在高效液相色譜中檢測(cè)到的每個(gè)時(shí)間段的峰面積結(jié)果代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中，得到相應(yīng)的安五脂素濃度值，再將得到的數(shù)據(jù)通過(guò)DAS軟件(3.2.8版本)進(jìn)行分析，藥時(shí)濃度見(jiàn)圖2，藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表1，各組織中的安五脂素含量見(jiàn)圖3.

表1 小鼠灌胃安五脂素后的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)Tab.1 Primary pharmacokinetic parameters of Anwuli- gnan in mice after the intragastric administration

圖3 小鼠灌胃安五脂素后在不同組織中的藥時(shí)濃度Fig.3 Concentration of Anwulignan in the different tiss-ues of mice after the intragastric administration

3 討 論

在本實(shí)驗(yàn)中，我們采用非房室模型的判斷方法進(jìn)行安五脂素在小鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)的研究，發(fā)現(xiàn)安五脂素在小鼠體內(nèi)吸收較慢(tmax=3 h)，持續(xù)時(shí)間也較長(zhǎng)(t1/2=7.1 h)，直到24 h仍能在血液中測(cè)到安五脂素的原型，說(shuō)明安五脂素的消除速度較為緩慢，有可能存在肝腸循環(huán).AUC0～t、AUC0～∞分別為(9.37 ± 2.36)mg/(L·h)、(12.58 ± 3.51)mg/(L·h)，說(shuō)明安五脂素進(jìn)入體循環(huán)較多.表觀分布容積(Vd)可以用來(lái)推斷藥品在體內(nèi)分布的廣泛程度，如果藥物在體內(nèi)均勻分布，則Vd值接近于0.8～1.0 L/kg，當(dāng)Vd值大于1.0 L/kg時(shí)，則藥物的組織濃度高于血藥濃度，藥物在體內(nèi)分布廣泛，或者組織蛋白對(duì)藥物高度結(jié)合[10].本研究結(jié)果顯示：安五脂素的表觀分布容積為(32.81 ± 4.79) L/kg，說(shuō)明安五脂素具有很強(qiáng)的親脂性，比較容易進(jìn)入細(xì)胞，并通過(guò)血液廣泛分布到組織中，這一結(jié)果在安五脂素的主要器官分布數(shù)據(jù)中也有體現(xiàn).此結(jié)果與SONG等[11]的研究基本一致.

口服灌胃安五脂素后，在小鼠的各個(gè)主要器官中均檢測(cè)到安五脂素原藥，說(shuō)明安五脂素分布廣泛，藥物的組織分布與血液循環(huán)、血管的通透性、藥物蛋白結(jié)合等因素有關(guān)[12]，化合物在各臟器中的差異性分布主要取決于血液在器官中的流速、流量和化合物與臟器的親和性[13].肝臟是藥物的主要代謝器官，存在大量與代謝相關(guān)的酶和小分子化合物，因此，各化合物在肝臟中分布的比率最大；脾臟是體內(nèi)最大的免疫器官，具有抗炎作用的化合物在脾臟內(nèi)發(fā)揮藥效作用[14].肝、腎和腦都是血液循環(huán)快速的器官，因此，小鼠灌胃安五脂素后在這些組織中都很快檢測(cè)到了安五脂素，分布濃度依次為肝>心>腦>腎>肺>脾，在肝臟中的濃度最高，說(shuō)明安五脂素在肝臟中消除較慢.安五脂素可以抑制CYP450酶的活性，能夠?qū)е孪嚓P(guān)藥物酶的活性減弱，具有減緩自身或其他藥物的代謝能力，也可以很好地證明本實(shí)驗(yàn)中安五脂素在小鼠肝臟中的含量最高，并且消除較為緩慢.通過(guò)對(duì)安五脂素結(jié)構(gòu)的探究，發(fā)現(xiàn)它可能含有抑制肝臟中相關(guān)酶的結(jié)構(gòu)，可能具有保肝作用，因此，肝臟很可能是安五脂素發(fā)揮主要治療作用的靶器官，未來(lái)需要進(jìn)行系統(tǒng)的研究[11].本實(shí)驗(yàn)中，在小鼠心臟、腎臟、肺和脾臟中都檢測(cè)到了安五脂素，但是含量較少，停留時(shí)間較短，說(shuō)明安五脂素在這些臟器中可以快速消除并且作用時(shí)間較短.值得注意的是，安五脂素在腦組織中的濃度較高，要高于其他五味子木脂素在腦組織的含量[15-17]，提示安五脂素具有較強(qiáng)的透過(guò)血腦屏障能力，進(jìn)而發(fā)揮中樞藥理活性，這一結(jié)果能夠?yàn)榻窈蟮陌参逯毓πW(xué)研究提供參考.

華中五味子的主要活性物質(zhì)是五味子木脂素，而安五脂素是華中五味子木脂素的代表性成分，因此，本研究通過(guò)對(duì)安五脂素的藥代動(dòng)力學(xué)特征進(jìn)行分析，對(duì)華中五味子的后續(xù)研究具有一定參考價(jià)值.