薛 露，降建新

(南通大學(xué)第五附屬醫(yī)院，江蘇 泰州 215300；泰州市人民醫(yī)院，江蘇 泰州 215300)

膿毒癥是由感染引起的全身炎癥反應(yīng)，多伴有器官灌注不足，最終導(dǎo)致器官功能障礙，威脅患者生命安全.10%～20%的膿毒癥患者入院48 h內(nèi)可發(fā)展為膿毒性休克，死亡率超過(guò)40%[1]，因此，探索新的治療靶點(diǎn)對(duì)改善患者預(yù)后具有重要意義.相關(guān)研究[2]顯示：免疫功能紊亂貫穿膿毒癥的整個(gè)病程，在病情發(fā)展中起到關(guān)鍵作用.免疫細(xì)胞凋亡是人體免疫功能紊亂的主要原因，膿毒癥免疫調(diào)節(jié)治療是目前研究的熱點(diǎn)之一[3].隨著近年來(lái)基因組學(xué)的快速發(fā)展，發(fā)現(xiàn)多種微小RNA(miRNA)在膿毒癥中存在異常表達(dá)，其中部分miRNA能夠介導(dǎo)膿毒癥的免疫細(xì)胞調(diào)控，進(jìn)而影響炎癥因子的分泌[4].有研究[5]顯示：miR-30a-5p基因敲除的小鼠體內(nèi)CD4+T細(xì)胞功能有明顯的增強(qiáng)，且能夠刺激T細(xì)胞向Th1亞群分化，提示miR-30a-5p基因能夠參與調(diào)控T淋巴細(xì)胞.但目前miR-30a-5p在膿毒癥患者中表達(dá)及作用的研究仍十分少見(jiàn).因此，本研究主要探討膿毒癥患者外周血淋巴細(xì)胞中miR-30a-5p表達(dá)及對(duì)淋巴細(xì)胞凋亡和血清炎癥因子分泌的影響，旨為膿毒癥患者的臨床診治提供新的思路.

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2019年3月—2020年5月南通大學(xué)第五附屬醫(yī)院收治的膿毒癥患者96例，根據(jù)患者28 d的生存情況將患者分為存活組65例、死亡組31例.存活組男36例，女29例；年齡28～56歲，平均(47.05±8.51)歲.死亡組男18例，女13例；年齡30～58歲，平均(47.84±7.90)歲.性別、年齡在兩組患者間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性.本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(LDK-2019014).

入選標(biāo)準(zhǔn)：符合歐洲危重醫(yī)學(xué)會(huì)(ESICM)頒布的膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；年齡>18歲，能夠正常溝通交流.

排除標(biāo)準(zhǔn)：合并惡性腫瘤、人乳頭瘤病毒感染、骨髓移植的患者；近3個(gè)月有免疫抑制劑治療史的患者.

1.2 主要試劑

RNA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒(天津卡梅德生物科技有限公司)；鼠抗人Caspase-3單克隆抗體、鼠抗人PARP-1單克隆抗體、鼠抗人Bax單克隆抗體、鼠抗人Bcl-2單克隆抗體、鼠抗人GAPDH單克隆抗體、山羊抗鼠IgG(北京沃卡威生物有限公司)；酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)試劑盒(山東德諾生物科技有限公司).

1.3 方 法

1.3.1 標(biāo)本采集與處理

抽取兩組患者的外周靜脈血10 mL，取其中7 mL用于分離淋巴細(xì)胞，加入淋巴細(xì)胞分離液，5 000 r/min離心20 min，收集白色淋巴細(xì)胞層，加入生理鹽水混合均勻，5 000 r/min離心10 min，棄去上清，收集離心管底細(xì)胞(淋巴細(xì)胞).取另外的3 mL外周靜脈血，3 000 r/min離心10 min，收集血清，-80 ℃保存待測(cè).

1.3.2 RT-PCR法檢測(cè)淋巴細(xì)胞中miR-30a-5p及Caspase-3、PARP-1、Bax、Bcl-2 mRNA水平

使用RNA提取試劑盒獲得兩組患者外周血淋巴細(xì)胞總RNA，應(yīng)用分光光度法測(cè)定RNA濃度，取適量RNA，反轉(zhuǎn)錄得到互補(bǔ)DNA.PCR擴(kuò)增引物由上海信帆生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成.miR-30a-5p正向引物：5′-TTTCATTATTACAGGG CAGCGGT-3′，反向引物：5′-GGCACTCATTATTACGCGGCAA-3′；Caspase-3正向引物：5′-GCGTGCCGTTGTGTAGAG TTT-3′，反向引物：5′-ACTGCTAATTCGTCCCCAAT G-3′；PARP-1正向引物：5′-GCACGTAGTAGTTCCC TTGTGG-3′，反向引物：5′-CGTAAGACCTGTATTCT GTCCTG-3′；Bax正向引物：5′-CTTAACGGCTGAGG TGCTGTG-3′，反向引物：5′-GTCGAACAGTTTATGT CGACA-3′；Bcl-2正向引物：5′-ATACACGACGGC TTCGCTCGC-3′，反向引物：5′-ATACACGACGGCTT CGCTCAA-3′.內(nèi)參U6正向引物：5′-GCAACTGAG GCTGGAAGTCGG-3′，反向引物：5′-CCAGGTAGGT ACTGTTGAAAC-3′.PCR反應(yīng)設(shè)定條件：94 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃變性50 s，57 ℃復(fù)性30 s，共40個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸1 min.循環(huán)數(shù)法計(jì)算目的基因表達(dá)水平.

1.3.3 Western blot法檢測(cè)Caspase-3、PARP-1、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平

分別提取兩組患者外周血淋巴細(xì)胞總蛋白，蛋白定量后電泳分離目標(biāo)蛋白，濕法轉(zhuǎn)膜后封閉，滴加鼠抗人Caspase-3單克隆抗體(1∶500稀釋)、鼠抗人PARP-1單克隆抗體(1∶500稀釋)、鼠抗人Bax單克隆抗體(1∶200稀釋)、鼠抗人Bcl-2單克隆抗體(1∶200稀釋)、鼠抗人GAPDH單克隆抗體(1∶1 000稀釋)，4 ℃過(guò)夜；滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(1∶1 000稀釋)，室溫反應(yīng)2 h，應(yīng)用E-Gel Imager凝膠成像系統(tǒng)掃描并分析各條帶灰度值.

1.3.4 酶聯(lián)免疫法檢測(cè)血清炎癥因子水平

采用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒檢測(cè)兩組患者血清C反應(yīng)蛋白、白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-8、白細(xì)胞介素-10、白細(xì)胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α表達(dá)水平，操作嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行.

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者外周血淋巴細(xì)胞中miR-30a-5p表達(dá)水平

死亡組患者外周血淋巴細(xì)胞中miR-30a-5p mRNA相對(duì)表達(dá)量為2.64±0.47，明顯高于存活組的1.31±0.29，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.237，P=0.011).

2.2 兩組患者外周血淋巴細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的mRNA和蛋白表達(dá)水平

死亡組患者外周血淋巴細(xì)胞中Caspase-3、PARP-1、Bax 的mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯高于存活組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；死亡組患者外周血淋巴細(xì)胞中Bcl-2的 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯低于存活組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01).見(jiàn)表1、圖1.

表1 兩組患者外周血淋巴細(xì)胞中Caspase-3、PARP-1、Bax、Bcl-2的 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量Tab.1 Relative expressions of Caspase-3，PARP-1，Bax，Bcl-2 mRNA and protein in peripheral blood lymphocytes between the two groups

圖1 Western blot法檢測(cè)兩組患者外周血淋巴細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況Fig.1 Expression of apoptosis related proteins in peripheral blood lymphocytes of the two groups detected by Western blot

2.3 兩組患者血清炎癥因子表達(dá)水平

死亡組患者血清促炎因子C反應(yīng)蛋白、白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-8、白細(xì)胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α濃度明顯高于存活組，抑制炎癥因子白細(xì)胞介素-10濃度明顯低于存活組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01).見(jiàn)表2.

表2 兩組患者血清炎癥因子表達(dá)水平Tab.2 Expression levels of serum inflammatory factor between the two groups

2.4 miR-30a-5p與凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析顯示：外周血淋巴細(xì)胞中miR-30a-5p表達(dá)水平與Caspase-3、PARP-1、Bax蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)，與Bcl-2蛋白表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān).見(jiàn)表3.

表3 外周血淋巴細(xì)胞中miR-30a-5p與凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析Tab.3 Correlation analysis between miR-30a-5p and apoptosis related protein expression in peripheral blood lymphocytes

2.5 miR-30a-5p與血清炎癥因子表達(dá)的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析顯示：外周血淋巴細(xì)胞中miR-30a-5p表達(dá)水平與血清C反應(yīng)蛋白、白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-8、白細(xì)胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α濃度呈正相關(guān)，與血清白細(xì)胞介素-10濃度呈負(fù)相關(guān).見(jiàn)表4.

表4 外周血淋巴細(xì)胞中miR-30a-5p與血清炎癥因子表達(dá)的相關(guān)性分析Tab.4 Correlation analysis between miR-30a-5p in peripheral blood lymphocytes and serum inflammatory factor expression

3 討 論

膿毒癥是臨床常見(jiàn)的嚴(yán)重感染性疾病，會(huì)引發(fā)多臟器功能障礙，死亡率高，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，包括細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)及線粒體功能障礙等[7].相關(guān)研究[8]顯示：免疫細(xì)胞凋亡通過(guò)介導(dǎo)免疫系統(tǒng)功能紊亂參與膿毒癥的發(fā)生與發(fā)展.當(dāng)細(xì)胞凋亡異常時(shí)，人體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)被破壞，通過(guò)激活Caspase-3、Bax和抑制Bcl-2而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序[9].膿毒癥患者免疫細(xì)胞損傷和免疫功能障礙的發(fā)病機(jī)制是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)之一.研究[10]顯示：膿毒癥會(huì)加速T淋巴細(xì)胞凋亡，T淋巴細(xì)胞低反應(yīng)性與其凋亡水平密切相關(guān)；膿毒癥患者免疫抑制狀態(tài)與淋巴細(xì)胞凋亡有關(guān).近年來(lái)隨著對(duì)miRNA研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)免疫細(xì)胞受多種miRNA的調(diào)控，其中下調(diào)miR-30a-5p能夠抑制急性肺損傷大鼠模型的肺泡上皮細(xì)胞凋亡[11]；上調(diào)miR-30a-5p能夠促進(jìn)脂多糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)以及線粒體損傷[12].但關(guān)于miR-30a-5p在膿毒癥患者中的表達(dá)及相關(guān)作用的研究仍十分少見(jiàn).探討miR-30a-5p表達(dá)對(duì)膿毒癥發(fā)展的影響能夠?yàn)榘l(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)、改善患者預(yù)后提供依據(jù).

本研究結(jié)果顯示：死亡組患者外周血淋巴細(xì)胞中miR-30a-5p mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于存活組，Caspase-3、PARP-1、Bax 的mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯高于存活組，Bcl-2的 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯低于存活組.近年來(lái)的研究[13]顯示：外周血淋巴細(xì)胞中miR-30a-5p表達(dá)水平與Caspase-3、PARP-1、Bax蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)，與Bcl-2蛋白表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān).Caspase家族蛋白活化是細(xì)胞凋亡的主要生物學(xué)特征，其中Caspase-3能夠破壞細(xì)胞的正常功能，激活凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路，促進(jìn)細(xì)胞凋亡.Caspase-3被活化后會(huì)增加PARP-1裂解片段的表達(dá)，相關(guān)研究[14]顯示：脊髓損傷的大鼠模型中可見(jiàn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，且合并PARP-1裂解片段高表達(dá)，與Caspase-3表達(dá)水平呈正相關(guān).Bax與抑制凋亡蛋白Bcl-2能夠結(jié)合成凋亡二聚體，大量分泌凋亡誘導(dǎo)因子，與Caspase家族蛋白發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15].結(jié)合本研究結(jié)果可推測(cè)，膿毒癥患者外周血淋巴細(xì)胞中miR-30a-5p高表達(dá)可激活Caspase-3、PARP-1裂解片段和Bax，抑制Bcl-2，進(jìn)而促進(jìn)淋巴細(xì)胞凋亡，加速病情進(jìn)展.

miR-30a-5p位于6號(hào)染色體1區(qū)，多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控其表達(dá).相關(guān)研究[15-16]顯示：miR-30a-5p參與免疫炎癥反應(yīng)、血細(xì)胞生成等過(guò)程.C反應(yīng)蛋白、白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-8、白細(xì)胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α等促炎因子能夠促進(jìn)免疫細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、歸巢至感染部位，清除細(xì)胞中的病原體；同時(shí)還能夠增強(qiáng)淋巴細(xì)胞對(duì)感染部位的浸潤(rùn)以及白細(xì)胞表達(dá)黏附因子，提升免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平[17].白細(xì)胞介素-10、白細(xì)胞介素-1Ra等抗炎因子能夠抑制腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素-8等細(xì)胞因子的促炎作用，控制炎癥反應(yīng)[18].本研究結(jié)果顯示：死亡組患者血清C反應(yīng)蛋白、白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-8、白細(xì)胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α濃度明顯高于存活組，白細(xì)胞介素-10濃度明顯低于存活組；外周血淋巴細(xì)胞中miR-30a-5p表達(dá)水平與血清C反應(yīng)蛋白、白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-8、白細(xì)胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α濃度呈正相關(guān)，與血清白細(xì)胞介素-10濃度呈負(fù)相關(guān).可推測(cè)miR-30a-5p通過(guò)靶向作用于某個(gè)信號(hào)通路，激活膿毒癥患者體內(nèi)炎癥反應(yīng)，使其病情加重，但具體信號(hào)通路仍需要進(jìn)一步深入研究.

綜上所述，膿毒癥患者外周血淋巴細(xì)胞中miR-30a-5p高表達(dá)提示不良預(yù)后；其通過(guò)加速淋巴細(xì)胞凋亡以及上調(diào)促炎因子C反應(yīng)蛋白、白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-8、白細(xì)胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α表達(dá)、抑制抗炎因子白細(xì)胞介素-10表達(dá)來(lái)影響免疫狀態(tài)，加重患者病情.