王玉文，關(guān)乃千，周 末，吳蒙嘉，孫 昆，穆懷志

(北華大學(xué)林學(xué)院，吉林 吉林 132013)

ATP合酶為多亞基復(fù)合體，廣泛分布于質(zhì)膜、線粒體內(nèi)膜和類囊體膜，是光合作用中光合磷酸化和呼吸作用氧化磷酸化反應(yīng)的關(guān)鍵酶[1].ATP合酶可分為3大類，分別為儲(chǔ)能F-型、質(zhì)膜P-型和液泡V-型，其中F-型ATP合酶(F1F0-ATP合酶)利用光合電子傳遞過程中產(chǎn)生的跨膜質(zhì)子動(dòng)力勢(shì)催化ADP與無機(jī)磷合成ATP，實(shí)現(xiàn)光能向化學(xué)能的轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生細(xì)胞生命活動(dòng)所需的ATP[2].因此，開展植物ATP合酶研究具有重要意義.

糠椴(Tiliamandshurica)又名遼椴，系椴樹科(Tiliaceae)椴樹屬(Tiliaspp.)植物，廣泛分布于我國(guó)東北、內(nèi)蒙古、河北、山東、江蘇北部，以及朝鮮、俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)[3].糠椴樹形通直、樹冠高大圓滿，不僅可以作綠化樹種，同時(shí)也是重要的蜜源植物，具有重大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[4].近年來，關(guān)于糠椴的研究主要集中在種群分布格局[5-6]、解剖結(jié)構(gòu)[7-9]、種子休眠[10-11]、無性繁殖[12-13]、光合特性[14-16]、化學(xué)成分[17-18]等方面，而關(guān)于糠椴ATP合酶的研究未見報(bào)道.本研究利用生物信息學(xué)方法分析糠椴ATP合酶基因，研究結(jié)果可為后續(xù)糠椴ATP合酶的基因克隆提供參考.

1 材料及方法

1.1 材 料

用NCBI(https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov)已有的糠椴6個(gè)ATP合酶亞基基因序列，以及紫椴(Tiliaamurensis)、少脈椴(Tiliapaucicostata)、粉椴(Tiliaoliveri)、蝴蝶樹(Heritieraparvifolia)、長(zhǎng)柄銀葉樹(Heritieraangustata)、木棉(Bombaxceiba)、美麗梧桐(Firmianapulcherrima)、陸地棉(Gossypiumhirsutum)、梭羅樹(Reevesiapubescens)、滇桐(Craigiayunnanensis)、面包樹(Artocarpuscommunis)、黃秋葵(Abelmoschusesculentus)、木槿(Hibiscussyriacus)、梧桐(Firmianasimplex)、云南梧桐(Firmianamajor)、可可樹(The-obromacacao)、朱槿(Hibiscusrosa-sinensis)、榴蓮(Duriozibethinus)、施溫迪茫棉(Gossypiumschwendim-anii)、海濱木槿(Taliparitihamabo)等ATP合酶的核苷酸序列和氨基酸序列作為試驗(yàn)材料.

1.2 方 法

分別利用ORF Finder、ProtParam、Protscale、TMHMMSERVER、PBIL、SWISS-MODE和MEGA7分析ATP合酶基因序列開放閱讀框、基本性質(zhì)、親水性/疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)域、二級(jí)結(jié)構(gòu)、同源建模、物種的同源進(jìn)化樹.

2 結(jié)果與分析

2.1 同源性

NCBI數(shù)據(jù)庫中糠椴ATP合酶的序列號(hào)為NC_028589.1.糠椴ATP合酶由CF1和CF0兩部分atpA、atpB、atpE、atpF、atpH、atpI共6個(gè)亞基組成.其中，CF1由atpA、atpB和atpE組成，CF0由atpF、atpH和atpI組成.BLAST分析結(jié)果表明：糠椴ATP合酶每個(gè)亞基基因與不同物種該基因的同源性并不相同.與糠椴atpA亞基基因相似度達(dá)到100%的物種為紫椴、少脈椴、粉椴、蝴蝶樹、長(zhǎng)柄銀葉樹、木棉、美麗梧桐、陸地棉和梭羅樹；與糠椴atpB亞基基因相似度達(dá)到100%的物種為紫椴、少脈椴、粉椴、木棉、滇桐、梭羅樹、梧桐、蝴蝶樹和面包樹；與糠椴atpE亞基基因相似度達(dá)到100%的物種為紫椴、少脈椴、粉椴、美麗梧桐、梧桐、施溫迪茫棉、蝴蝶樹、黃秋葵和木槿；與糠椴atpF亞基基因相似度達(dá)到100%的物種為紫椴、粉椴、少脈椴、梭羅樹、陸地棉、云南梧桐、蝴蝶樹、美麗梧桐和可可樹；與糠椴atpH亞基基因相似度達(dá)到100%的物種為朱槿、紫椴、粉椴、梭羅樹、木槿、施溫迪茫棉、蝴蝶樹、木棉和榴蓮；與糠椴atpI亞基基因相似度達(dá)到100%的物種為紫椴、少脈椴、粉椴、梭羅樹、蝴蝶樹、木棉、榴蓮、可可樹和海濱木槿.與糠椴ATP合酶各亞基基因序列相似度達(dá)到100%的物種見表1.

表1 與糠椴ATP合酶各亞基基因序列相似度達(dá)到100%的物種Tab.1 Species with 100% similarity of ATP synthase subunit gene sequences in Tilia mandshurica

2.2 開放閱讀框

利用ORF Finder分析糠椴ATP合酶不同亞基序列的開放閱讀框，結(jié)果見表2.由表2可見：6個(gè)亞基的序列長(zhǎng)度差異較大，其中，atpA的基因序列最長(zhǎng)，達(dá)到1 523 bp；其次為atpB(1 496 bp)和atpF(1 355 bp)；atpH的基因序列最短，僅為245 bp.

表2 糠椴ATP合酶亞基基因位置及長(zhǎng)度Tab.2 Location and length of ATP synthase subunits in Tilia mandshurica /bp

2.3 氨基酸組成

利用ProtParam分析糠椴ATP合酶各亞基的氨基酸組成、相對(duì)分子質(zhì)量和理論等電點(diǎn)，結(jié)果見圖1、表3.結(jié)果表明：atpA亞基含有19種氨基酸，其中，丙氨酸含量最高(9.86%)，半胱氨酸含量最低(0.20%)，分子式為C2442H3974N678O764S12，相對(duì)分子質(zhì)量為55 441.22，等電點(diǎn)為5.26；atpB亞基含有19種氨基酸，其中，亮氨酸含量最高(10.04%)，半胱氨酸含量最低(0.20%)，分子式為C2382H3680N648O728S16，相對(duì)分子質(zhì)量為53 737.72，等電點(diǎn)為5.29；atpE亞基含有19種氨基酸，其中，丙氨酸和異亮氨酸含量最高，均為12.03%，半胱氨酸、組氨酸、苯丙氨酸含量最低，均為0.75%，分子式為C633H1059N189O195S4，相對(duì)分子質(zhì)量為14 565.76，等電點(diǎn)為5.83；atpF亞基含有19種氨基酸，其中，亮氨酸含量最高(12.50%)，色氨酸含量最低(0.54%)，分子式為C915H1481N265O283S3，相對(duì)分子質(zhì)量為20 818.61，等電點(diǎn)為6.33；atpH亞基含有16種氨基酸，其中，丙氨酸含量最高(19.75%)，酪氨酸和賴氨酸含量最低，均為1.24%，分子式為C264H599N93O103S2，相對(duì)分子質(zhì)量為7 990.44，等電點(diǎn)為4.94；atpI亞基含有20種氨基酸，其中，亮氨酸含量最高(11.74%)，半胱氨酸含量最低(0.41%)，分子式為C1273H1947N297O339S5，相對(duì)分子質(zhì)量為26 996.95，等電點(diǎn)為5.06.

A.丙氨酸；R.精氨酸；N.天冬酰胺；D.天冬氨酸；C.半胱氨酸；Q.谷氨酰胺；E.谷氨酸；G.甘氨酸；H.組氨酸；I.異亮氨酸；L.亮氨酸；K.賴氨酸；M.甲硫氨酸；F.苯丙氨酸；P.脯氨酸；S.絲氨酸；T.蘇氨酸；W.色氨酸；Y.酪氨酸；V.纈氨酸.圖1 糠椴ATP合酶亞基的氨基酸組成Fig.1 Amino acid composition of ATP synthase subunits in Tilia mandshurica

表3 糠椴ATP合酶亞基氨基酸數(shù)量、相對(duì)分子質(zhì)量和理論等電點(diǎn)Tab.3 Amino acid quantity，molecular weight and theoretical isoelectric point of ATP synthase subunit genes in Tilia mandshurica

2.4 蛋白質(zhì)親/疏水性

糠椴ATP合酶的親/疏水性分析結(jié)果見圖2.結(jié)果表明：atpA、atpB、atpE和atpF為親水蛋白，atpH和atpI為疏水蛋白.atpA的GRAVY值為-0.102，其最大值(2.7)和最小值(-2.8)分別出現(xiàn)在190和20位點(diǎn)；atpB的GRAVY值為-0.038，最大值(2.3)出現(xiàn)在260位點(diǎn)，最小值(-2.7)出現(xiàn)在210位點(diǎn)；atpE的GRAVY值為-0.044，最大值(1.9)出現(xiàn)在40位點(diǎn)，最小值(-2.6)出現(xiàn)在107位點(diǎn)；atpF的GRAVY值為-0.352，最大值(3.3)出現(xiàn)在40位點(diǎn)，最小值(-2.5)出現(xiàn)在120位點(diǎn)；atpH的GRAVY值為1.002，最大值(3.3)出現(xiàn)在72位點(diǎn)，最小值(-2.0)出現(xiàn)在43位點(diǎn)；atpI的GRAVY值為0.668，最大值(3.6)出現(xiàn)在205位點(diǎn)，最小值(-1.8)出現(xiàn)在60位點(diǎn).

圖2 糠椴ATP合酶各亞基的親/疏水性Fig.2 Hydrophobic and hydrophilic properties of ATP synthase subunits in Tilia mandshurica

2.5 跨膜結(jié)構(gòu)域

TMHMM分析顯示，糠椴ATP合酶不同亞基的跨膜結(jié)構(gòu)不盡相同.其中，atpI的跨膜區(qū)最多，高達(dá)5個(gè)；atpH和atpF的跨膜區(qū)分別為2個(gè)和1個(gè)；atpA、atpB和atpE不存在跨膜結(jié)構(gòu)(圖3).

圖3 糠椴ATP合酶各亞基的跨膜結(jié)構(gòu)域Fig.3 Transmembrane domain of ATP synthase subunits in Tilia mandshurica

2.6 二級(jí)結(jié)構(gòu)與同源建模

利用PBIL分析糠椴ATP合酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果見表4.由表4可知：不同亞基的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成不同，其中，atpA、atpB、atpE和atpI的二級(jí)結(jié)構(gòu)由α螺旋、β折疊和無規(guī)則卷曲組成，而atpF和atpH僅由α螺旋和無規(guī)則卷曲組成，無β折疊.α螺旋比例較高的是atpH和atpF，分別達(dá)到86.42%和86.41%；其次是atpI，為71.26%；atpE最低，僅為29.32%.β折疊比例最高的是atpE，高達(dá)37.59%；其次是atpB和atpA，分別為18.27%和14.00%；atpI最低，僅為1.62%.無規(guī)則卷曲比例最高的是atpB，高達(dá)43.98%；其次是atpA，為43.40%；atpH最低，僅為13.58%.利用SWISS-MODEL對(duì)糠椴ATP合酶各亞基的氨基酸序列進(jìn)行同源建模，得到的三維結(jié)構(gòu)見圖4.

表4 糠椴ATP合酶亞基二級(jí)結(jié)構(gòu)數(shù)量及比例Tab.4 Quantity and proportion of secondary structure of ATP synthase subunits in Tilia mandshurica

圖4 糠椴ATP合酶及各亞基三維結(jié)構(gòu)Fig.4 Three-dimensional structure of ATP synthase and its subunits in Tilia mandshurica

2.7 系統(tǒng)進(jìn)化樹

利用MEGA7分別構(gòu)建糠椴ATP合酶6個(gè)亞基與紫椴、少脈椴、粉椴、美麗梧桐、梧桐、云南梧桐、蝴蝶樹、長(zhǎng)柄銀葉樹、陸地棉、木棉、梭羅樹、滇桐、面包樹、黃秋葵、施溫迪茫棉、木槿、海濱木槿、朱瑾、榴蓮和可可樹的進(jìn)化樹，10個(gè)親緣關(guān)系較近樹種構(gòu)建的進(jìn)化樹見圖5.由圖5可見：不同亞基對(duì)應(yīng)的進(jìn)化樹結(jié)構(gòu)并不相同.糠椴atpA、atpB、atpE、atpF和atpI亞基基因與粉椴、少脈椴和紫椴親緣關(guān)系較近；糠椴atpH亞基基因與木槿親緣關(guān)系較近，而與紫椴和粉椴的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn).

圖5 糠椴ATP合酶不同亞基基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree of ATP synthase subunit genes in Tilia mandshurica

3 結(jié)論與討論

ATP合酶廣泛分布于線粒體內(nèi)膜、葉綠體類囊體、異養(yǎng)菌和光合菌的質(zhì)膜上，參與氧化磷酸化和光合磷酸化，是生物能量轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵酶，影響細(xì)胞生命活動(dòng)所需ATP的產(chǎn)生[1，19].目前，已有很多有關(guān)ATP合酶基因的報(bào)道.林莉莉等[20]對(duì)ATP合酶的C1F1F0-ATP 基因進(jìn)行紅藍(lán)光不同光質(zhì)配比處理，發(fā)現(xiàn)白光促進(jìn)杉木幼苗生長(zhǎng)，說明C1F1F0-ATP 基因?qū)Π坠獾捻憫?yīng)與杉木木材生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控有著密切關(guān)系.對(duì)砂蘚ATP合酶Ⅱ亞基的基因表達(dá)研究表明，該亞基在脫水脅迫和復(fù)水過程中的表達(dá)發(fā)生了明顯變化，說明ATP合酶Ⅱ亞基可能參與了砂蘚干旱脅迫的應(yīng)答[21].MAO等[22]將水稻幼苗在低溫下處理不同時(shí)間，Northern雜交分析顯示其atpH亞基基因轉(zhuǎn)錄水平在低溫處理1 d時(shí)明顯下降，低溫處理2 d后完全被抑制.李生廣等[23]研究發(fā)現(xiàn)，乙醇對(duì)ATP合酶表現(xiàn)為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制，說明乙醇并未直接與反應(yīng)底物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)，而是作用于ATP合酶上的乙醇敏感部位，導(dǎo)致CF1構(gòu)象發(fā)生改變，從而使CF1上催化位點(diǎn)與調(diào)節(jié)位點(diǎn)解聚，進(jìn)而影響活性部位，最終造成ATP水解受到抑制.姜曉旭等[24]從蒙古沙冬青幼苗中克隆得到ATP合酶的atpD亞基基因，發(fā)現(xiàn)該基因在低溫和干旱脅迫下的表達(dá)量明顯升高，說明該基因可受低溫和干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá).

本研究表明，糠椴ATP合酶共有6個(gè)亞基，分別為atpA、atpB、atpE、atpF、atpH和atpI.糠椴ATP合酶由51.40%的α螺旋、13.10%的β折疊和35.50%的無規(guī)則卷曲組成.在6個(gè)亞基中，atpA、atpB、atpE和atpF為親水性蛋白；atpH和atpI為疏水蛋白.atpI有5個(gè)跨膜區(qū)，atpH和atpF分別有2個(gè)和1個(gè)跨膜區(qū)，atpA、atpB和atpE不存在跨膜結(jié)構(gòu).綜上所述，糠椴ATP合酶是一個(gè)鑲嵌在膜上且具有跨膜結(jié)構(gòu)的酶，既有親水性部分，又有疏水性部分，且各亞基具有明顯差異.上述結(jié)果可為深入了解糠椴ATP合酶的結(jié)構(gòu)以及通過基因克隆和轉(zhuǎn)基因技術(shù)驗(yàn)證其功能提供參考.