蔣一玲，余洪金，張寧波，陳承

杭州師范大學(xué)附屬蕭山醫(yī)院，浙江 杭州 311201，1.腫瘤內(nèi)科；2.放射治療科

肺癌已成為當(dāng)今世界惡性腫瘤死亡的首要原因，是一種具有較強侵襲和轉(zhuǎn)移能力的惡性腫 瘤[1]。非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）的發(fā)病率約占肺癌的85%，是一種對放療中度敏感的惡性腫瘤[2]。放療已逐漸成為NSCLC的有效治療手段之一，但由于NSCLC患者在治療的中晚期出現(xiàn)抗輻射作用，放療的效果并不理想，因此，提高NSCLC患者的放射敏感性是臨床亟待解決的重要問題。大蒜素是一種從大蒜鱗莖中提取的含硫化合物的復(fù)合體，其對腫瘤細胞有抑制作用[3]。重要的是，大蒜素可顯著抑制肺癌A549細胞增殖、侵襲和遷移能力[4]。近期也有研究證實，大蒜素能夠增強肺癌細胞對5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil, 5-FU）的敏感性[5]。然而，大蒜素對NSCLC細胞放射敏感性的調(diào)控作用鮮見報道。本研究擬探討大蒜素對NSCLC細胞放射敏感性的調(diào)控作用以及其分子機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系：NSCLC細胞系A(chǔ)549和正常肺上皮細胞株BEAS-2B購自美國模式培養(yǎng)物集存庫（ATCC）細胞庫。

1.1.2 試劑與儀器：本研究中所使用的試劑和儀器及其來源見表1。

表1 試劑和儀器及來源

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：將A549細胞于含有10%胎牛血清、100 μg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素的F-12K培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件均為37 ℃，5% CO2。隨后取對數(shù)生長期的A549細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染：將處于對數(shù)生長期的A549細胞接種于6孔板中，將miR-486-5p inhibitor（I）和陰性對照物（inhibitor control, IC）采用 LipofectamineTM3000試劑按照產(chǎn)品說明書進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染24 h后用于后續(xù)實驗。

1.2.3 MTT檢測細胞增殖活力：將處理對數(shù)生長期的A549細胞經(jīng)胰酶消化后，制備單細胞懸液。將A549細胞（5×104個/孔）接種在96孔板中于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。更換培養(yǎng)基，加入細胞培養(yǎng)液配制濃度為0、10、20、40、60 μg/mL大蒜素進行干預(yù)72 h，每孔200 μL。培養(yǎng)結(jié)束后，向每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，繼續(xù)孵育2 h。棄去上清液，加入200 μL的DMSO，混勻后采用酶標(biāo)儀測量490 nm處的吸光度值（OD）。并計算細胞增殖活 力。細胞增殖活力（%）=（實驗組OD值-空白對照組OD值）/（陰性對照組OD值-空白對照組OD值）×100%。

1.2.4 Transwell實驗檢測細胞侵襲能力：取對數(shù)生長期的A549細胞，消化后加入無血清的培養(yǎng)基將細胞配置成5×104個/μL。向每孔加入50 μL無血清 Allicin藥物（40 μg/mL）和50 μL經(jīng)轉(zhuǎn)染（miR-486-5p inhibitor）或X射線（4 Gy）處理的細胞懸液。然后，將Transwell小室置于6孔板中，Transwell小室上室需采用Matrigel（培養(yǎng)基：Matrigel=3∶1）膠包被，下室加入100 μL含血清的培養(yǎng)基，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后，棄去下室培養(yǎng)基，采用1%結(jié)晶紫染色20 min，并于光學(xué)顯微鏡下隨機選擇5個視野計算侵襲細胞數(shù)，實驗重復(fù) 3次。

1.2.5 克隆形成實驗分析細胞存活分?jǐn)?shù)：取對數(shù)生長期的A549細胞，胰酶消化后，將細胞密度為500個/mL加入6孔板中，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，向每孔40 μg/mL大蒜素作用24 h后再與0、2、4、6、8 Gy的X射線輻照處 理，并繼續(xù)培養(yǎng)2周。處理結(jié)束后棄去舊培養(yǎng)基，向每孔加入1 mL甲醇固定15 min后棄去甲醇，再加入2 mL結(jié)晶紫避光固定30 min，結(jié)晶紫回收后PBS清洗孔板2次后晾干拍照。細胞存活分?jǐn)?shù)（%）=某劑量照射實驗組細胞克隆數(shù)/（實驗組細胞數(shù)×空白對照組克隆數(shù)/空白對照組種植數(shù)）×100%，其中克隆細胞數(shù)＞50個作為一個有效克隆。

1.2.6 彗星實驗分析細胞DNA損傷情況：將A549細胞制備成單細胞懸液，然后在37 ℃下與低熔點瓊脂糖（LM瓊脂糖）混合。接下來，將瓊脂糖和細胞混合物鋪在預(yù)處理過的玻璃片上，再用裂解液在4 ℃處理30 min。隨后，將玻片浸入電泳液中進行凝膠電泳，電泳完畢后用熒光染料SYBR Green I對玻片進行染色，在熒光顯微鏡下觀察DNA損傷情況。其中熒光拖尾越長，DNA受損越嚴(yán)重。

1.2.7 qRT-PCR檢測基因的表達：將收集的細胞采用TRIzol試劑提取總RNA，并利用紫外分光光度計檢測RNA的濃度和純度。然后，通過反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用SYBR Green PCR進行qRT-PCR實驗檢測miR-486-5p、SP5、SMOC1、DOCK3、KDM5B和CELSR3 mRNA的表達水平。以U6和β-actin作為內(nèi)參。通過2-ΔΔCt方法計算miR-486-5p、SP5、SMOC1、DOCK3、KDM5B和CELSR3 mRNA的相對表達量。其中引物序列見表2。

表2 引物序列

1.2.8 雙熒光素酶報告基因驗證miR-486-5p和 KDM5B的靶向關(guān)系：構(gòu)建KDM5B 3’UTR野生型（WTKDM5B）和突變型（MUT-KDM5B）熒光素酶報告質(zhì)粒。隨后，將生長對數(shù)期的A549細胞接種于12孔板中，并使用LipofectamineTM3000將miR-486-5p inhibitor和WT-KDM5B或MUT-KDM5B質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至A549細胞中，常規(guī)培養(yǎng)48 h后，加入細胞裂解液裂解細胞，并于4 ℃、10 000×g離心10 min，取上清液，嚴(yán)格按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒進行熒光素酶活性檢測。

1.2.9 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測蛋白表達：將收集的細胞加入裂解液后進行超聲裂解，提取細胞中總蛋白，并用BCA蛋白檢測試劑盒評估蛋白濃度。裂解物通過SDS-PAGE分離，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，加入5%的脫脂牛奶封閉2 h。隨后，將一抗γ-H2AX（1∶1 000）、KDM5B（1∶1 000）、Vimentin（1∶1 000）、Snail（1∶1 000）和β-actin（1∶1 000）于4 ℃孵育過夜，PBS漂洗后，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶5 000）在室溫下孵育1 h。最后，電化學(xué)發(fā)光顯 示，Image J軟件分析目的蛋白的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，并采用GraphPad Prism 8對實驗數(shù)據(jù)進行繪圖。計量資料以±s表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大蒜素抑制A549細胞增殖和侵襲能力 相較于未處理組（0 μg/mL），A549細胞在不同濃度的大蒜素處理下增殖活力受到抑制，且20～60 μg/mL的大蒜素可顯著抑制A549細胞增殖活力（P＜0.001，見圖1A）。同時，相較于未處理組，20和40 μg/mL的大蒜素可顯著抑制A549細胞侵襲能力（P＜0.05，見圖1B）?；诖?，選擇劑量為40 μg/mL的大蒜素進行后續(xù)實驗。

圖1 大蒜素對A549細胞增殖和侵襲能力的影響

2.2 大蒜素增加A549細胞放射敏感性 相較于對照組，大蒜素（40 μg/mL）可顯著促進不同劑量（0、2、4、6、8 Gy）X射線對A549細胞存活的抑制作用（見圖2A）。同時，經(jīng)X射線（4 Gy）或大蒜素 （40 μg/mL）處理的A549細胞侵襲能力明顯低于對照組（P＜0.001，見圖2B），且A549細胞侵襲能力在X射線+大蒜素組中明顯低于大蒜素組（P＜0.001）。此外，彗星實驗結(jié)果表明，大蒜素聯(lián)合X射線可顯著誘導(dǎo)A549細胞出現(xiàn)彗星尾征，即發(fā)生DNA損傷（見圖2C）。由此可知，大蒜素可增強X射線對A549細胞的殺傷作用。

圖2 大蒜素對X射線處理的A549細胞增殖、侵襲和DNA損傷的影響

2.3 敲低miR-486-5p逆轉(zhuǎn)了大蒜素對A549細胞放射增敏的促進作用 以往研究證實，miRNA在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展進程中扮演重要角，且miR-486-5p被證實在NSCLC中作為抑癌基因[6]。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，miR-486-5p在A549細胞中的表達量顯著低于正常肺上皮細胞株BEAS-2B（P＜0.001），且miR-486-5p在A549細胞中的表達量隨大蒜素處理劑量的增加而逐漸增加，見圖3A、圖3B。同時，相較于IC組，向A549細胞中轉(zhuǎn)染miR-486-5p敲低載體（I）可顯著下調(diào)miR-486-5p的表達量（P＜0.001），見圖3C。Transwell實驗檢測結(jié)果顯示，相比于X射線+大蒜素組，敲低miR-486-5p可顯著上調(diào)A549細胞侵襲能力（P＜0.001），且敲低miR-486-5p也能逆轉(zhuǎn)X射線 （4 Gy）對A549細胞侵襲能力的抑制作用（P＜0.001），見圖3D。Western blot檢測結(jié)果表明，相較于X射線組或X射線+I組，大蒜素可顯著上調(diào)DNA損傷相關(guān)蛋白γ-H2AX的表達水平（P＜0.001），并下調(diào)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白（Snail和Vimentin）的表達水平（P＜0.001）。同時，相較于X射線+大蒜素+ IC組，敲低miR-486-5O可下調(diào)γ-H2AX蛋白的表達量（P＜0.001，），上調(diào)Snail和Vimentin蛋白的表達量（P＜0.001），見圖3E。由此可知，大蒜素通過上調(diào)miR-486-5p增強A549細胞對X射線的敏感性。

圖3 大蒜素通過miR-486-5p對A549細胞放療敏感性的影響

2.4 KDM5B是miR-486-5p的直接靶基因 在線生物學(xué)數(shù)據(jù)庫（TargetScan、Starbase、TCGA和miRDB）預(yù)測結(jié)果顯示，SP5、SMOC1、DOCK3、KDM5B和CELSR3為miR-486-5p的潛在候選靶基因（見圖4A）。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，相比于IC組，敲低miR-486-5p可明顯上調(diào)以上候選靶基因（P＜0.05），尤其顯著上調(diào)KDM5B的表達水平（P＜0.001），見圖4B。TargetScan預(yù)測顯示，miR-486-5p與KDM5B的3’UTR存在結(jié)合位點（見圖4C）。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果表明，敲低miR-486-5p后KDM5B-WT載體的熒光素酶活性明顯高于IC組（P＜0.001），而不影響KDM5B-MUT載體的熒光素酶活性，見圖4D。Western blot檢測結(jié)果顯示，相較于X射線（4 Gy）組，X射線+大蒜素處理可顯著下調(diào)A549細胞中KDM5B蛋白的表達水平（P＜0.001），且X射線+大蒜素+I組中KDM5B蛋白的表達量低于X射線+I組（P＜0.001），但敲低miR-486-5p可顯著上調(diào)X射線+大蒜素+IC組中KDM5B蛋白的表達水平（P＜0.001），見圖4E。由此可知，KDM5B是miR-486-5p的靶基因，且大蒜素可通過上調(diào)miR-486-5p靶向下調(diào)KDM5B的表達。

圖4 KDM5B是miR-486-5p的靶基因

3 討論

臨床研究表明，放射治療用于癌癥患者的治療易產(chǎn)生不良反應(yīng)，且有部分中晚期癌癥患者產(chǎn)生放療耐受，嚴(yán)重降低了放療療效。本研究結(jié)果顯示，大蒜素對A549細胞的惡性生物表型（增殖、侵襲）有很好的抑制作用，并且能夠增強X射線對A549細胞增殖和侵襲的抑制作用，以及誘導(dǎo)細胞DNA損傷。這表明，大蒜素在NSCLC放療中可能發(fā)揮潛在的協(xié)同作用。

大蒜素被證實具有多種生物活性，包括抗炎、降血壓、降血脂和抗腫瘤等[7]。近年來有研究表明，大蒜素在多種實體惡性腫瘤中發(fā)揮抗癌作用，其可顯著抑制癌細胞惡性生物學(xué)行為，例如，GUO等[8]研究表明，大蒜素可顯著抑制口腔舌鱗狀細胞癌細胞增殖活力并誘導(dǎo)細胞凋亡。重要的是，大蒜素可增強腫瘤細胞對化療藥物和放療的敏感性，例如，大蒜素聯(lián)合X射線可顯著抑制結(jié)直腸癌腫瘤生長、癌細胞增殖及誘導(dǎo)細胞凋亡[9]。ZOU等[10]研究證實，大蒜素通過誘導(dǎo)線粒體氧化應(yīng)激增強化療藥物5-FU對肝細胞肝癌細胞增殖的抑制作用。本研究結(jié)果顯示，大蒜素可明顯增強X射線對A549細胞增殖和侵襲的抑制作用，以及誘導(dǎo)A549細胞DNA損傷。以上研究提示，大蒜素可明顯增強A549細胞對X射線的敏感性。

近年來有大量研究證實，天然活性物可通過調(diào)控非編碼RNA（長鏈非編碼RNA、環(huán)狀RNA和微小RNA）在多種惡性腫瘤中起抗癌作用[11]。例如，LV等[12]研究證實，大蒜素通過下調(diào)miR-383-5p對其靶基因ERBB4表達的抑制作用，進而抑制胃癌細胞增殖、侵襲和遷移能力。WU等[13]證實，大蒜素通過上調(diào)miR-486-5p增強神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞對替莫唑胺的敏感性。本研究也發(fā)現(xiàn)，大蒜素通過上調(diào)miR-486-5p抑制A549細胞增殖和侵襲能力，且敲低miR-486-5p可顯著逆轉(zhuǎn)大蒜素對A549放射增敏的促進作用。重要的是，miR-486-5p作為肺癌發(fā)生發(fā)展的重要診斷標(biāo)志物，在多種惡性腫瘤組織和細胞系中低表 達[14]。也有研究證實，過表達miR-486-5p可通過靶向負調(diào)控其下游靶基因抑制癌細胞惡性生物學(xué)行為和腫瘤干細胞的形成[15]。此外，過表達miR-486-5p可增強癌細胞對放療和化療的敏感性，例如過表達miR-486-5p可通過抑制細胞侵襲和遷移能力，進而增強NSCLC細胞對順鉑的敏感性[16]。然而，目前尚未見研究證實miR-486-5p在NSCLC放療增敏中的調(diào)控作用。本研究證實，KDM5B作為miR-486-5p的直接靶基因，大蒜素處理可明顯抑制KDM5B的表達，但敲低miR-486-5p則可明顯緩解大蒜素對KDM5B的抑制作用。這提示，miR-486-5p/KDM5B分子軸可能是大蒜素促進NSCLC細胞對X射線增敏的有效靶點。

綜上所述，本研究證實大蒜素通過抑制A549細胞增殖和侵襲，并誘導(dǎo)細胞DNA損傷，進而實現(xiàn)放療增敏作用。其機制可能是通過上調(diào)miR-486-5p對KDM5B表達的抑制作用來阻滯癌細胞惡性生物學(xué)行為而實現(xiàn)的。本研究為臨床上NSCLC患者放療增敏提供了有效的干預(yù)藥物以及治療新靶點。