劉盛盛 楊娟 查兆煜 張超 許子煒 唐神結(jié) 林文紅

【Fundprogram】 Scientific Research Project of Anhui Provincial Health Commission (AHWJ2021b072)

全球范圍內(nèi)，結(jié)核病仍是嚴(yán)重危害人類健康的傳染病。2020年，全球新發(fā)結(jié)核病患者987萬例，發(fā)病率為127/10萬[1]。HIV陰性結(jié)核病死亡數(shù)從2019年的121萬增加到128萬[1]。宿主的免疫功能在結(jié)核病的發(fā)病、轉(zhuǎn)歸及預(yù)后方面發(fā)揮重要作用[2]。淋巴細(xì)胞通過多種功能效應(yīng)在機(jī)體抵抗侵入病原菌中扮演重要角色，其中CD4+T淋巴細(xì)胞能夠分泌白細(xì)胞介素(IL)-2、γ-干擾素(IFN-γ)等細(xì)胞因子，激活巨噬細(xì)胞，提高其殺傷細(xì)菌的功能，誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)[3]。目前認(rèn)為CD4+T淋巴細(xì)胞能夠減少結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis， MTB)細(xì)胞內(nèi)增殖、防止感染播散和促進(jìn)宿主的長(zhǎng)期生存，在病程的各個(gè)階段均發(fā)揮重要作用[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，活動(dòng)性肺結(jié)核患者外周血CD4+T淋巴細(xì)胞水平下降，且經(jīng)過抗結(jié)核治療后其計(jì)數(shù)明顯上升[5-6]。因此，明確肺結(jié)核患者CD4+T淋巴細(xì)胞減少的影響因素，為臨床制定干預(yù)措施、判斷療效及預(yù)后等方面具有積極意義，但目前相關(guān)報(bào)道較少。本研究回顧性納入了213例肺結(jié)核患者的臨床資料，分析CD4+T淋巴細(xì)胞減少的發(fā)生率和影響因素，并觀察免疫干預(yù)對(duì)療效的影響，以期為臨床和科研工作提供一定的參考。

對(duì)象和方法

一、研究對(duì)象

根據(jù)電子病歷系統(tǒng)，連續(xù)納入2020年12月至2021年7月安徽省胸科醫(yī)院結(jié)核科住院的出院診斷包含肺結(jié)核的患者為研究對(duì)象。初始納入3155例，排除未行淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)者2896例、疑似患者22例、非結(jié)核分枝桿菌病16例、陳舊性肺結(jié)核3例、結(jié)核性胸膜炎(不伴有肺部病灶)2例、HIV感染者2例、合并免疫系統(tǒng)疾病1例，最終納入研究對(duì)象213例。

二、研究方法

1.診斷標(biāo)準(zhǔn)：肺結(jié)核的診斷包括確診和臨床診斷，參照《WS 288—2017肺結(jié)核診斷》[7]。本研究中僅診斷為結(jié)核性胸膜炎，未伴有肺部病灶者不納入研究。

2.相關(guān)定義：(1)耐藥結(jié)核病[8]：結(jié)核病患者感染的結(jié)核分枝桿菌在體外被證實(shí)在一種或多種抗結(jié)核藥物存在時(shí)仍能生長(zhǎng)。(2)初治結(jié)核病[8]：符合下列情況之一：①?gòu)奈匆蚪Y(jié)核病應(yīng)用過抗結(jié)核藥物治療的患者；②正進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化療方案規(guī)則用藥未滿療程的患者；③不規(guī)則化療未滿1個(gè)月的患者。(3)復(fù)治結(jié)核病[8]：符合下列情況之一：①因結(jié)核病不合理或不規(guī)則使用抗結(jié)核藥物治療≥1個(gè)月的患者；②初治失敗和復(fù)發(fā)患者。(4)肺外結(jié)核[8]：指結(jié)核病變發(fā)生在肺以外的器官和部位。(5)CD4+T淋巴細(xì)胞減少：根據(jù)本研究醫(yī)療機(jī)構(gòu)該指標(biāo)參考值范圍，定義為CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)<410個(gè)/μl。

3.分組：根據(jù)納入時(shí)患者外周血CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)分為兩組，<410個(gè)/μl為CD4+T淋巴細(xì)胞減少組，共61例；≥410個(gè)/μl為對(duì)照組，共152例。根據(jù)是否使用免疫干預(yù)治療，將CD4+T淋巴細(xì)胞減少患者分為兩組，免疫干預(yù)組(33例)和非免疫干預(yù)組(28例)。其中非免疫干預(yù)組采用常規(guī)化學(xué)治療，干預(yù)組在常規(guī)治療基礎(chǔ)上加用胸腺肽口服。

4.淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)：使用BD FACSCanto Ⅱ流式細(xì)胞儀及配套檢測(cè)試劑盒。主要步驟如下：(1)使用EDTA抗凝管采集研究對(duì)象外周靜脈血約3 ml；(2)24 h內(nèi)，20 μl的熒光單克隆抗體加入50 μl靜脈血標(biāo)本渦旋混勻，室溫避光孵育15 min；(3)向上述混合物中加入450 μl的溶血素，渦旋混勻，室溫避光孵育10 min；(4)上機(jī)自動(dòng)檢測(cè)。

5.觀察指標(biāo)：收集研究對(duì)象的人口學(xué)特征(性別、年齡、職業(yè)、文化水平)、吸煙、飲酒、癥狀數(shù)目、治療分類、合并疾病、耐藥情況、影像及實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果等臨床資料。收集CD4+T淋巴細(xì)胞減少患者治療7個(gè)月期間的復(fù)查資料，包括痰涂片、培養(yǎng)及影像資料等，評(píng)估其療效。影像評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)：(1)病灶范圍變化：①全吸，病灶全部吸收；②顯吸，原病灶吸收≥1/2；③吸收，原病灶吸收<1/2；④不變，原病灶無明顯變化；⑤惡化，原病灶擴(kuò)大或播散。(2)空洞變化：①閉合：治療后空洞閉合；②縮?。褐委熀罂斩纯s小≥1/2原空洞直徑；③增大：治療后空洞增大>1/2原空洞直徑。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、研究對(duì)象一般資料

共納入研究對(duì)象213例，其中男性139例(65.3%)，女性74例(34.7%)；年齡范圍14～89歲，年齡M(Q1,Q3)為46(29，58)歲；職業(yè)以待業(yè)/家務(wù)/退休和農(nóng)民最多，分別為60例(28.2%)和52例(24.4%)；文化水平以中學(xué)/職專最多，為85例(39.9%)；吸煙者52例(24.4%)；飲酒者21例(9.9%)；并發(fā)糖尿病者36例(16.9%)；并發(fā)惡性腫瘤者9例(4.2%)；初治肺結(jié)核134例(62.9%)，復(fù)治肺結(jié)核79例(37.1%)；合并肺外結(jié)核者53例(24.9%)；耐藥肺結(jié)核55例(25.8%)。

二、研究對(duì)象外周血T淋巴細(xì)胞亞群分析

CD3+T淋巴細(xì)胞占比M(Q1,Q3)為72.78%(66.19%，77.82%)；CD4+T淋巴細(xì)胞占比平均值為(41.78±9.34)%；CD8+T淋巴細(xì)胞占比M(Q1,Q3)為26.44%(21.52%，33.98%)；CD3+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)M(Q1,Q3)為943.21(661.00，1253.71)個(gè)/μl；CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)M(Q1,Q3)為546.08(382.44，739.69)個(gè)/μl；CD8+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)M(Q1,Q3)為350.00(228.50，489.23)個(gè)/μl；CD4/CD8比值M(Q1,Q3)為1.57(1.13，2.12)。CD4+T淋巴細(xì)胞減少患者共61例，發(fā)生率為28.6%。

三、免疫干預(yù)組與非免疫干預(yù)組治療不同階段的效果比較

免疫干預(yù)組和非免疫干預(yù)組以入院開始治療時(shí)間為基線，治療2～4個(gè)月，免疫干預(yù)組痰涂片陰性率高于非免疫干預(yù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，免疫干預(yù)組痰培養(yǎng)陰性率高于非免疫干預(yù)組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。治療5～7個(gè)月，免疫干預(yù)組痰涂片陰性率高于非免疫干預(yù)組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；免疫干預(yù)組痰培養(yǎng)陰性率低于非免疫干預(yù)組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。治療5～7個(gè)月，免疫干預(yù)組空洞縮小率高于非免疫干預(yù)組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，免疫干預(yù)組病灶吸收率優(yōu)于非免疫干預(yù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

表1 兩組患者治療不同階段的效果比較

四、CD4+T淋巴細(xì)胞減少的單因素分析

單因素分析結(jié)果：CD4+T淋巴細(xì)胞減少組男性、年齡≥60歲、農(nóng)民職業(yè)、文盲、癥狀數(shù)目≥4個(gè)、并發(fā)肺外結(jié)核、累及肺野4～6個(gè)、肺部空洞、血紅蛋白<110 g/L、血小板<125×109/L、白蛋白<35 g/L、CD8+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)<190個(gè)/μl的構(gòu)成比(77.0%、44.3%、36.1%、26.2%、36.1%、34.4%、77.0%、55.7%、45.9%、18.0%、68.9%、29.5%)明顯高于對(duì)照組(60.5%、11.2%、19.7%、10.5%、19.7%、21.1%、38.2%、40.8%、25.7%、5.3%、44.7%、7.9%)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)(表2)。

表2 肺結(jié)核患者CD4+T淋巴細(xì)胞減少的單因素分析

續(xù)表2

續(xù)表2

五、CD4+T淋巴細(xì)胞減少的多因素分析

以CD4+T淋巴細(xì)胞是否減少作為因變量，將單因素分析中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素作為自變量進(jìn)行多因素logistic回歸分析，各因素賦值見表3。結(jié)果顯示：年齡≥60歲、累及肺野4～6個(gè)、血小板<125×109/L、CD8+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)<190 個(gè)/μl是肺結(jié)核患者CD4+T淋巴細(xì)胞減少的危險(xiǎn)因素，見表4。

表3 多因素logistic回歸分析變量賦值表

表4 肺結(jié)核患者CD4+T淋巴細(xì)胞減少的多因素logistic回歸分析

討 論

CD4+T淋巴細(xì)胞在結(jié)核病的免疫保護(hù)性反應(yīng)中起著重要作用，其減少可能會(huì)導(dǎo)致感染的播散及不良預(yù)后[3]。在本研究中，我們回顧性分析了HIV陰性肺結(jié)核患者CD4+T淋巴細(xì)胞減少的發(fā)生率、影響因素及免疫干預(yù)對(duì)療效的影響。

既往關(guān)于HIV陰性結(jié)核病患者中CD4+T淋巴細(xì)胞減少發(fā)生率的報(bào)道較少，且結(jié)果不一致。Skogmar等[9]和Baluku等[10]研究發(fā)現(xiàn)CD4+T淋巴細(xì)胞減少發(fā)生率分別為24.7%和25.0%，與本研究的28.6%較為接近。Kony等[11]和Jones等[5]報(bào)道的發(fā)生率分別為14.4%和43.5%，與本研究差別較大。造成差異的原因可能與研究對(duì)象的種族、地域、樣本量及CD4+T淋巴細(xì)胞減少界值的不同有關(guān)，尚需進(jìn)行多中心、大樣本研究進(jìn)一步探討。本研究28.6%的CD4+T淋巴細(xì)胞減少發(fā)生率仍提示相當(dāng)一部分肺結(jié)核患者對(duì)抗MTB感染的免疫功能受損，這可能導(dǎo)致感染播散和療效不佳，應(yīng)予以足夠的重視。本研究61例CD4+T淋巴細(xì)胞減少患者中，28例行常規(guī)治療，33例在常規(guī)治療的基礎(chǔ)上進(jìn)行了免疫干預(yù)治療，盡管治療后痰培養(yǎng)陰性率兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但在治療2～4個(gè)月干預(yù)組患者的痰涂片陰性率更高，這說明對(duì)CD4+T淋巴細(xì)胞減少肺結(jié)核患者進(jìn)行免疫干預(yù)，能夠加快患者的痰菌陰轉(zhuǎn)，對(duì)控制疾病的傳播具有積極意義。此外，治療5～7個(gè)月時(shí)，干預(yù)組患者的肺部病灶吸收情況亦優(yōu)于對(duì)照組。因此，及時(shí)對(duì)肺結(jié)核患者進(jìn)行CD4+T淋巴細(xì)胞檢測(cè)，輔助評(píng)價(jià)其免疫狀況，合理進(jìn)行免疫干預(yù)對(duì)提高療效和改善預(yù)后具有重要價(jià)值。

我國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查發(fā)現(xiàn)，老年肺結(jié)核患者的占比高達(dá)48.8%[12]。成詩(shī)明等[13]研究發(fā)現(xiàn)，老年痰涂片陽(yáng)性(涂陽(yáng))肺結(jié)核患病率是其他年齡組平均涂陽(yáng)患病率的3.6倍，占全國(guó)涂陽(yáng)患者例數(shù)的28.6%。此外，老年肺結(jié)核患者治療有效率低，不良反應(yīng)發(fā)生率和病死率高[14]，因此對(duì)老年肺結(jié)核的診治已成為結(jié)核病防治工作的重點(diǎn)和難點(diǎn)。本研究中，60歲及以上的老年患者發(fā)生CD4+T淋巴細(xì)胞減少的幾率是其余患者的4.816倍，與鄒莉萍等[15]研究結(jié)論相似?？赡艿脑蚴请S著年齡增長(zhǎng)，人體T淋巴細(xì)胞增殖功能減退。本研究表明肺結(jié)核患者的CD4+T淋巴細(xì)胞水平與年齡相關(guān)，老年患者更易出現(xiàn)CD4+T淋巴細(xì)胞減少和免疫功能受損。這也是老年患者療效和預(yù)后欠佳的重要原因之一。因此，建議臨床上對(duì)老年肺結(jié)核患者進(jìn)行CD4+T淋巴細(xì)胞檢測(cè)，了解其免疫狀況，及時(shí)進(jìn)行干預(yù)治療，以更好地控制結(jié)核病的流行。

我們發(fā)現(xiàn)CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)與患者病變范圍相關(guān)，病變累及4～6個(gè)肺野的患者CD4+T淋巴細(xì)胞減少的幾率約為病變累及1～3個(gè)肺野的3.669倍，與其他學(xué)者的研究結(jié)論一致[6, 16]。這提示隨著肺部病變嚴(yán)重程度的增加，CD4+T淋巴細(xì)胞減少的風(fēng)險(xiǎn)增大，機(jī)體抗MTB的保護(hù)性防御機(jī)制下降。可能因?yàn)榉尾坎∽兎秶^大者外周血T淋巴細(xì)胞在肺組織嚴(yán)重感染部位積聚，而外周血中T淋巴細(xì)胞的數(shù)量相對(duì)減少[17]。具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究明確。對(duì)于肺部病變范圍較大的肺結(jié)核患者，需考慮CD4+T淋巴細(xì)胞減少和機(jī)體免疫狀態(tài)的惡化。

血小板是宿主調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞之一，參與局部和全身炎癥過程的啟動(dòng)和傳遞[18]。血小板通過分泌化學(xué)誘導(dǎo)劑趨化因子配體5(CCL5)刺激T淋巴細(xì)胞黏附，從而調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞功能[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，血小板減少是HIV陰性肺結(jié)核患者CD4+T淋巴細(xì)胞減少的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，這與Li等[6]研究結(jié)論一致。提示血小板減少的肺結(jié)核患者，臨床上需考慮CD4+T淋巴細(xì)胞減少可能。但目前鮮有肺結(jié)核患者血小板和CD4+T淋巴細(xì)胞存在相關(guān)性的報(bào)道，尚無法明確兩者之間的具體影響機(jī)制，值得進(jìn)一步探索。

早期觀點(diǎn)認(rèn)為在宿主對(duì)MTB的免疫應(yīng)答中，CD8+T淋巴細(xì)胞的作用不大，但之后研究逐漸發(fā)現(xiàn)CD8+T淋巴細(xì)胞亦發(fā)揮著重要而復(fù)雜的作用[20-21]。它可以通過分泌穿孔素、顆粒酶等物質(zhì)直接殺死MTB，并可通過Fas/FasL途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[22-23]。病情越嚴(yán)重，CD8+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)下降越明顯[16]。這表明機(jī)體調(diào)動(dòng)CD8+T淋巴細(xì)胞直接殺傷MTB而導(dǎo)致其細(xì)胞耗竭，提示機(jī)體免疫狀態(tài)的惡化。CD4+T淋巴細(xì)胞是CD8+T淋巴細(xì)胞增殖所必需的[24]，它們間的效應(yīng)機(jī)制可有助于MTB感染的控制[3]。本研究發(fā)現(xiàn)CD8+T淋巴細(xì)胞減少患者CD4+T淋巴細(xì)胞減少的風(fēng)險(xiǎn)約增大到3.908倍，這提示CD8+T淋巴細(xì)胞減少者往往伴隨CD4+T細(xì)胞的減少，該類人群的免疫功能更加紊亂，可能預(yù)示著病情加重或預(yù)后不良，需及時(shí)抗菌治療和免疫干預(yù)。

有學(xué)者發(fā)現(xiàn)其他一些因素也與肺結(jié)核患者外周血CD4+T淋巴細(xì)胞相關(guān)，如翟慧等[25]發(fā)現(xiàn)初治和復(fù)治患者之間、有無空洞及空洞占肺野數(shù)之間CD4+T淋巴細(xì)胞表達(dá)率存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。本研究中未觀察到上述結(jié)果，可能因?yàn)楸狙芯坎捎玫氖羌?xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)分析，而不是表達(dá)率。當(dāng)然，后續(xù)將擴(kuò)大樣本量全面探討外周血T淋巴細(xì)胞亞群與上述指標(biāo)的相關(guān)性。關(guān)于耐藥方面，有報(bào)道肺結(jié)核患者CD4+T淋巴細(xì)胞表達(dá)率不隨耐藥程度加重而變化[26-27]，但何綱等[27]發(fā)現(xiàn)耐多藥肺結(jié)核患者CD4+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)低于敏感患者。我們發(fā)現(xiàn)CD4+T淋巴細(xì)胞減少組和對(duì)照組耐藥患者構(gòu)成比無明顯差異，可能因?yàn)槟退幍姆秶煌?。本研究的耐藥患者是?duì)任何一種抗結(jié)核藥物耐藥者，而何綱等[27]的研究人群為耐多藥患者。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，貧血[10]、白蛋白降低[5]的結(jié)核病患者更易發(fā)生CD4+T淋巴細(xì)胞減少。我們?cè)趩我蛩胤治鲋邪l(fā)現(xiàn)貧血和白蛋白降低在CD4+T淋巴細(xì)胞減少組和對(duì)照組中確實(shí)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但多因素分析中由于其他因素的綜合影響，顯示該兩項(xiàng)指標(biāo)不是CD4+T淋巴細(xì)胞減少的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，后續(xù)仍需大樣本及分層分析進(jìn)一步探索。

本研究亦存在一定的局限性。首先，本次為回顧性研究，且對(duì)象均為住院患者，存在一定的選擇偏倚，需要前瞻性、大規(guī)模研究驗(yàn)證結(jié)論。其次，沒有動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)治療后患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群變化，后續(xù)擬根據(jù)患者治療時(shí)間動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)該指標(biāo)，以進(jìn)一步驗(yàn)證該指標(biāo)對(duì)療效和預(yù)后的判斷價(jià)值。

綜上所述，HIV陰性肺結(jié)核患者具有較高的CD4+T淋巴細(xì)胞減少發(fā)生率。免疫干預(yù)治療對(duì)提高該類人群療效具有積極意義。高齡、肺部病變累及范圍大、血小板減少和CD8+T淋巴細(xì)胞減少均是肺結(jié)核患者CD4+T淋巴細(xì)胞減少的危險(xiǎn)因素。因此，臨床上對(duì)具有上述危險(xiǎn)因素的患者進(jìn)行CD4+T淋巴細(xì)胞檢測(cè)，評(píng)估其免疫功能，有助于給予合理的免疫干預(yù)治療，以提高療效和改善預(yù)后。

志謝衷心感謝安徽省胸科醫(yī)院倪敏敏、姚婷對(duì)本研究臨床資料的錄入及校對(duì)！

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)劉盛盛：采集數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)分析、論文撰寫和修改；楊娟：采集數(shù)據(jù),論文撰寫；查兆煜、張超、許子煒：采集數(shù)據(jù); 唐神結(jié)、林文紅：研究設(shè)計(jì)，指導(dǎo)論文撰寫和修改