紀(jì)帥帥, 閆潔, 王子吟, 楊夢(mèng)婷, 胡嫚, 霍強(qiáng), 程秀

(蚌埠醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院藥物化學(xué)教研室,安徽 蚌埠 233030)

骨關(guān)節(jié)炎是一種常見的慢性疾病,據(jù)統(tǒng)計(jì),我國(guó)約有50%的中老年人患有骨關(guān)節(jié)炎,這對(duì)于一個(gè)擁有2.6億中老年人的國(guó)家而言,對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的治療刻不容緩[1]。目前還沒有較好的骨關(guān)節(jié)炎的治療手段,主要是以對(duì)癥治療為主,表現(xiàn)為緩解患者的疼痛、延緩關(guān)節(jié)軟骨退變、提高患者的生活質(zhì)量等[2]。因此,開發(fā)有效的治療方法尤為重要。在目前的骨關(guān)節(jié)炎治療方法中,局部關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射給藥比口服給藥更有效,因?yàn)槠浣档土巳矶拘訹3]。但是,關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射給藥也有缺點(diǎn),包括藥物停留時(shí)間短,藥物在關(guān)節(jié)腔中的濃度過(guò)高等[4]。因此,為了提高關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射給藥的治療效果,將抗炎藥物納入載體,實(shí)現(xiàn)藥物的長(zhǎng)期持續(xù)釋放是一個(gè)可行的策略[5]。脂質(zhì)體是一種優(yōu)良的藥物載體,具有毒性低和生物相容性高等優(yōu)點(diǎn)[6]。作為一種成熟的納米技術(shù),已有多種相關(guān)制劑上市用于治療各類疾病[7]。硫酸氨基葡萄糖(glucosamine sulfate,GAS)作為一種廣泛用于骨關(guān)節(jié)炎的抗炎和軟骨保護(hù)的藥物,具有刺激軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白多糖和膠原合成,抑制促炎因子分泌的作用[8]。通常,GAS作為口服藥物使用,口服生物利用度僅為10%左右,治療效果不顯著。直接用于關(guān)節(jié)腔給藥,也存在局部濃度過(guò)高和停留時(shí)間短等問(wèn)題[9]。本研究利用氫化磷脂酰膽堿構(gòu)建包載GAS的脂質(zhì)體(GAS-Lips),避免了口服利用度低與局部注射滯留時(shí)間短等缺點(diǎn)。GAS-Lips在關(guān)節(jié)腔內(nèi)緩慢而持續(xù)地釋放GAS,并具有一定的潤(rùn)滑性,能夠延緩關(guān)節(jié)磨損,發(fā)揮治療作用,為骨關(guān)節(jié)炎納米制劑的開發(fā)提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

氫化磷脂酰膽堿、膽固醇、十八胺、GAS、Cy3熒光染料(上海阿拉丁試劑有限公司)；三氯乙醛水合物(上海麥克林生化科技有限公司)；注射用青霉素鈉(江西省科達(dá)動(dòng)物藥業(yè)有限公司)；肝素鈉(辰欣藥業(yè)股份有限公司)；大鼠TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

馬爾文粒度分析儀(英國(guó)馬爾文儀器有限公司)；UV-2700紫外可見分光光度計(jì)(島津儀器蘇州有限公司)；WS-900恒溫?fù)u床(北京維根技術(shù)有限公司)；Tanon ABL X6動(dòng)物活體成像分析儀(上海天能科技有限公司)。

1.2 動(dòng)物培養(yǎng)

SPF級(jí)4周齡雄性SD大鼠,體重140～160 g,由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供,飼養(yǎng)于蚌埠醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,并獲得蚌埠醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心倫理批準(zhǔn)。

1.3 制備GAS-Lips

精密稱取處方量的氫化磷脂酰膽堿30 mg,稱取膽固醇2 mg,分別溶于適量無(wú)水乙醇中,將其加入到50 mL的茄形瓶中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜后,置真空干燥器中放置2 h,分別加入0.3 mL(1 mg/mL)十八胺和含有1 mg GAS的 pH 7.4 磷酸鹽緩沖液6 mL于茄形瓶中,充入氮?dú)饷芊獠⒅糜趽u床中水化15 min,探頭超聲水浴10 min制備得到脂質(zhì)體。

1.4 GAS-Lips的表征

1.4.1 脂質(zhì)體和GAS-Lips粒徑分布及Zeta電位考察 取制備好的脂質(zhì)體和GAS-Lips溶液,適度稀釋后,置于馬爾文四通石英樣品池中,采用DLS Zetasizer Nano-90測(cè)量樣品的粒徑和Zeta電勢(shì),每次測(cè)量重復(fù)3次。

1.4.2 脂質(zhì)體和GAS-Lips形態(tài)學(xué)考察 制備適宜濃度的脂質(zhì)體和GAS-Lips溶液,分別取10 μL滴加在200目有碳支持膜的銅網(wǎng)上,常溫放置2 h,干燥后用透射電子顯微鏡觀察樣品的形態(tài)。

1.5 GAS-Lips的制劑學(xué)評(píng)價(jià)

1.5.1 GAS檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 稱取一定質(zhì)量的GAS,去離子水稀釋至適宜濃度,紫外分光光度計(jì)檢測(cè)波長(zhǎng)在200～600 nm時(shí)的最大紫外吸收峰。

1.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取2.5 g GAS,去離子水溶解后轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中定容,配制成濃度為100 mg/mL的GAS儲(chǔ)備液。用移液管精密量取0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL儲(chǔ)備液置于25 mL容量瓶中,稀釋定容得到濃度為10、20、40、60、80、100 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。以去離子水溶液作為空白對(duì)照,測(cè)定各標(biāo)準(zhǔn)溶液275 nm處光密度(D)值。以GAS的濃度為橫坐標(biāo),D值為縱坐標(biāo),繪制GAS標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.3 包封率與載藥量的測(cè)定 包封率和載藥量是評(píng)價(jià)納米遞藥系統(tǒng)處方及制備工藝的兩個(gè)重要指標(biāo)。通過(guò)薄膜分散法用不同濃度GAS制備GAS-Lips,在4 ℃條件下以12 000 r/min離心20 min,收集上清液,通過(guò)紫外分光光度計(jì)在275 nm處測(cè)定相對(duì)應(yīng)的D值,按下列公式計(jì)算包封率和載藥量:

包封率/%=(Wtotal-Wfree)/Wtotal×100%

載藥量/%=(Wtotal-Wfree)/Ntotal×100%

其中,Wtotal是系統(tǒng)中的藥物總質(zhì)量；Wfree是溶液中游離的藥物總質(zhì)量,Ntotal是總納米粒的質(zhì)量。

1.5.4 釋藥性分析 采用動(dòng)態(tài)膜透析法研究GAS-Lips的體外釋放行為。精密吸取一定量的GAS和GAS-Lips,加到截留分子量為3 500 Da透析袋中,再將透析袋放入含有100 mL pH 7.4的磷酸鹽緩沖液的燒杯中,并在37 ℃恒溫?fù)u床中以100 r/min進(jìn)行體外釋放實(shí)驗(yàn)。于0.5、1、2、4、6、8、10、12 h分別取樣2 mL并補(bǔ)充相同體積的磷酸鹽緩沖液,4 ℃條件下8 000 r/min離心10 min收集上清液。所取樣品用紫外分光光度計(jì)在275 nm處測(cè)定D值,并帶入“1.5.2”標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算累積釋放量。

1.6 體內(nèi)滯留性考察

將Cy3與Cy3-Lips注射到膝關(guān)節(jié)腔后,分別在1、6、12 h時(shí)使用動(dòng)物活體成像分析儀觀察Cy3與Cy3-Lips在大鼠膝關(guān)節(jié)部位的熒光信號(hào)分布,并進(jìn)行半定量分析。

1.7 GAS-Lips的體內(nèi)藥效評(píng)價(jià)

對(duì)飼養(yǎng)1周后的大鼠進(jìn)行前交叉韌帶橫斷術(shù)(anterior cruciate ligament transection,ACLT),構(gòu)建大鼠骨關(guān)節(jié)炎模型。通過(guò)水合氯醛麻醉大鼠,并對(duì)其腿部進(jìn)行剃毛。找到髕韌帶與副韌帶中間的位置,切開關(guān)節(jié)囊,找到關(guān)節(jié)腔所在部位,將脛骨向內(nèi)側(cè)進(jìn)行錯(cuò)位。用剪刀將前交叉韌帶剪斷,后將髕韌帶復(fù)位并縫合,最后肌肉注射青霉素抗菌,連續(xù)3 d。實(shí)驗(yàn)分為4組,分別為假手術(shù)組、ACLT+未給藥組、ACLT+GAS組、ACLT+GAS-Lips組,每組6只,共24只。實(shí)驗(yàn)周期為8周,手術(shù)后第3周的第1天開始關(guān)節(jié)腔注射給藥,每周給藥1次,1次100 μL(5 mg/kg),共給藥6次。

1.7.1 治療過(guò)程中大鼠體重稱定 從第1次給藥開始稱量各組大鼠體重并記錄,之后每周測(cè)定大鼠體重變化,持續(xù)6周,以時(shí)間為橫坐標(biāo),體重為縱坐標(biāo),繪制大鼠體重變化曲線。

1.7.2 關(guān)節(jié)炎大鼠膝關(guān)節(jié)部位離體形態(tài)觀察 給藥6周后,處死骨關(guān)節(jié)炎大鼠,觀察膝關(guān)節(jié)部位形態(tài)變化,并剪除周圍肌肉與筋膜組織,用磷酸鹽緩沖液清洗干凈,拍照記錄。

1.7.3 Micro-CT觀察膝關(guān)節(jié)軟骨損傷變化 給藥6周后,處死并切取骨關(guān)節(jié)炎大鼠的后肢,磷酸鹽緩沖液沖洗干凈后立即用4%多聚甲醛固定,用Micro-CT對(duì)樣品進(jìn)行成像。

1.7.4 ELISA法檢測(cè)大鼠血清中炎癥因子的表達(dá)差異 給藥6周后,通過(guò)大鼠眼眶取血。每只大鼠眼眶取血1～2 mL。將裝有血樣的EP管于4 ℃條件下5 000 r/min離心20 min,收集上清液。按照ELISA試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn),在450 nm處測(cè)定D值,計(jì)算血清中TNF-α、IL-6的含量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 GAS-Lips的表征

2.1.1 脂質(zhì)體和GAS-Lips粒徑分布及Zeta電位檢測(cè) 粒徑和Zeta電位結(jié)果如圖1所示。脂質(zhì)體和GAS-Lips粒徑分別為(220.24±2.82)nm和(255.02±3.64)nm,隨著GAS加入,粒徑增大,表明藥物成功載入脂質(zhì)體中。由于氫化磷脂酰膽堿與膽固醇形成的脂質(zhì)體表面攜帶少量負(fù)電荷,而GAS是一種帶正電荷的單糖,與所形成的脂質(zhì)體結(jié)合,逆轉(zhuǎn)脂質(zhì)體表面的負(fù)電荷,因此GAS-Lips脂質(zhì)體Zeta電勢(shì)為正電荷。

圖1 空脂質(zhì)體與載藥脂質(zhì)體粒徑分布與Zeta電勢(shì)

2.1.2 脂質(zhì)體和GAS-Lips形態(tài)學(xué)考察 透射電鏡結(jié)果如圖2所示,脂質(zhì)體呈球形或類球形,無(wú)粘連,分散均一。空白脂質(zhì)體粒徑為(163.25±2.91)nm,GAS-Lips粒徑為(214.56±3.76)nm。在脂質(zhì)體制備過(guò)程中,粒徑增大,說(shuō)明GAS載入脂質(zhì)體中。

圖2 脂質(zhì)體和GAS-Lips透射電鏡結(jié)果

2.2 GAS-Lips的制劑學(xué)評(píng)價(jià)

2.2.1 GAS檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 紫外可見分光光度計(jì)掃描200～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)紫外吸收,結(jié)果如圖3所示,確定其紫外吸收峰在275 nm處。

圖3 GAS紫外吸收峰

2.2.2 GAS標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 以GAS的濃度為橫坐標(biāo),D值為縱坐標(biāo),對(duì)測(cè)定結(jié)果做線性回歸曲線,得到GAS的標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖4所示,GAS的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.003 6x-0.003 1,R2=0.999 6,GAS濃度在0～100 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖4 GAS標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.3 GAS-Lips載藥量和包封率的測(cè)定 如圖5所示,在GAS低濃度時(shí),具有較高的包封率和較低的載藥量。隨著GAS濃度的增加,GAS-Lips的載藥量逐漸增加,包封率下降明顯,但載藥量增加到一定程度后幾乎不變,說(shuō)明脂質(zhì)體載藥量有限。在不改變配方的前提下,比較不同濃度GAS對(duì)載藥量和包封率的影響,GAS濃度為4 mg/mL時(shí),具有較高的包封率和載藥量,分別為(78.62±1.01)%和(9.90±0.75)%,所以選擇GAS濃度為4 mg/mL用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖5 GAS-Lips載藥量和包封率的測(cè)定

2.2.4 釋藥性分析 采用動(dòng)態(tài)膜透析法研究制劑的體外釋放行為,結(jié)果如圖6所示,GAS在pH 7.4的磷酸鹽緩沖液中,以快速方式進(jìn)行釋放,2 h累計(jì)釋放量達(dá)到(99.61±0.63)%,基本全部釋放。相比于GAS,GAS-Lips在溶液中釋放速率緩慢,2 h累計(jì)釋放量為(48.57±2.01)%,12 h累計(jì)釋放量為(88.62±1.06)%,表明脂質(zhì)體作為藥物載體具有一定的緩釋作用。

圖6 GAS-Lips體外釋放曲線

2.3 體內(nèi)滯留性考察

熒光信號(hào)圖以及半定量結(jié)果如圖7所示,Cy3與Cy3標(biāo)記的脂質(zhì)體在1 h均在大鼠膝關(guān)節(jié)部位呈現(xiàn)較強(qiáng)的熒光強(qiáng)度,隨著時(shí)間的延長(zhǎng)熒光強(qiáng)度逐漸減弱。與Cy3組相比,Cy3-Lips組在6 h和12 h時(shí)平均熒光強(qiáng)度增加,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。表明脂質(zhì)體可以增加藥物在關(guān)節(jié)腔部位的黏附和滯留性。

圖7 大鼠膝關(guān)節(jié)熒光信號(hào)以及半定量結(jié)果

2.4 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

2.4.1 治療過(guò)程中大鼠體重變化 各組大鼠體重變化曲線如圖8所示,各組大鼠生長(zhǎng)狀況良好,體重穩(wěn)定上升,給藥組大鼠與假手術(shù)組相比沒有明顯差異。

圖8 給藥過(guò)程中大鼠體重變化

2.4.2 大鼠膝關(guān)節(jié)離體形態(tài)考察 如圖9所示,假手術(shù)組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨損壞較輕,表面相對(duì)光滑,周圍無(wú)骨贅形成；與假手術(shù)組比較,其余各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨出現(xiàn)損壞,表面出現(xiàn)不光滑現(xiàn)象。其中ACLT+未給藥組周圍骨贅生成明顯、軟骨損壞程度最高、表面更粗糙；與ACLT+未給藥相比,ACLT+GAS組與ACLT+GAS-Lips組軟骨損壞程度輕。與ACLT+GAS組相比,ACLT+GAS-Lips組軟骨表面損傷程度較輕,表面更光滑,表明GAS-Lips具有治療骨關(guān)節(jié)炎的作用,效果比游離藥物好。

圖9 大鼠膝關(guān)節(jié)形態(tài)圖

2.4.3 關(guān)節(jié)Micro-CT成像 如圖10所示,與其他各組相比,假手術(shù)組大鼠關(guān)節(jié)面軟骨表面較完整,表層基質(zhì)塌陷區(qū)域最少,關(guān)節(jié)表面相對(duì)光滑。與假手術(shù)相比,ACLT+未給藥組表層基質(zhì)塌陷區(qū)域最多,軟骨結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重,ACLT+GAS-Lips組和ACLT+GAS組軟骨表面表層基質(zhì)塌陷區(qū)域較少,軟骨結(jié)構(gòu)破壞較輕。與ACLT+GAS組相比,ACLT+GAS-Lips組軟骨表面更光滑,表明GAS-Lips具有良好的治療骨關(guān)節(jié)炎的作用。

圖10 關(guān)節(jié)Micro-CT成像

2.4.4 大鼠血清中炎癥因子的表達(dá)差異 ELISA法檢測(cè)大鼠血清中TNF-α、IL-6表達(dá)水平,見圖11。與ACLT+GAS-Lips組相比,ACLT+未給藥組和ACLT+GAS組炎癥因子TNF-α、IL-6表達(dá)均增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)。表明GAS-Lips具有良好的抗炎作用,利于骨關(guān)節(jié)炎的治療。

圖11 大鼠血清中TNF-α、IL-6的含量

3 討論

骨關(guān)節(jié)炎是一種嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量的關(guān)節(jié)退行性疾病,伴有關(guān)節(jié)軟骨侵蝕、硬化、滑膜炎癥、骨贅(骨刺)和顯著的骨質(zhì)改變[10]。目前構(gòu)建骨關(guān)節(jié)炎模型的方法主要有關(guān)節(jié)腔注射藥物(Ⅱ型膠原酶、木瓜蛋白酶、完全弗氏佐劑等)和手術(shù)(前交叉韌帶切除術(shù)、半月板切除術(shù)等)兩種,由于藥物注射成功率低,不穩(wěn)定[11],因此本研究采用前交叉韌帶剪斷的方法構(gòu)建大鼠骨關(guān)節(jié)炎模型。

炎癥因子過(guò)表達(dá)會(huì)加劇軟骨的退變,關(guān)節(jié)腔內(nèi)炎癥反應(yīng)產(chǎn)生的TNF-α、IL-6會(huì)加劇組織的損傷,因此,抑制TNF-α、IL-6等炎癥因子的過(guò)表達(dá)有利于骨關(guān)節(jié)炎的修復(fù)。GAS是一種帶電荷的氨基單糖,通過(guò)抑制疼痛相關(guān)基因和基質(zhì)金屬蛋白酶的活性,降低促炎因子的分泌水平,廣泛用于骨關(guān)節(jié)炎的治療[12]。在退行性關(guān)節(jié)疾病中,含有脂質(zhì)體納米顆粒的藥物在骨關(guān)節(jié)炎治療中的作用已被廣泛研究。脂質(zhì)體是一種優(yōu)良的藥物載體,具有穩(wěn)定藥物物理化學(xué)性質(zhì)、增加藥物攝取、延長(zhǎng)藥物釋放等多種優(yōu)勢(shì)[13-14]。但是部分脂質(zhì)體由于載藥量低,限制了其在骨關(guān)節(jié)炎方面的臨床治療,因此,制備更有效的載藥脂質(zhì)體納米粒子可以為臨床治療骨關(guān)節(jié)炎提供良好的基礎(chǔ)。本文所制備的GAS-Lips與其他脂質(zhì)體相比,具有較高的載藥量以及良好的緩釋效果。局部注射脂質(zhì)體,可以更好地增加游離藥物的靶向性和滯留性,減少藥物體內(nèi)代謝,達(dá)到更好的治療效果。

本研究選取氫化磷脂酰膽堿與膽固醇作為制備脂質(zhì)體的材料,其具有一定的潤(rùn)滑和延緩關(guān)節(jié)磨損的作用,同時(shí)采用常規(guī)骨關(guān)節(jié)炎治療藥物GAS,通過(guò)降低促炎因子分泌的作用,達(dá)到保護(hù)軟骨和抗炎的作用。

總之,本研究通過(guò)薄膜分散法制備脂質(zhì)體,制備工藝較為簡(jiǎn)單。負(fù)載游離藥物GAS,增加藥物在骨關(guān)節(jié)炎部位的緩釋作用,增強(qiáng)藥效,為骨關(guān)節(jié)炎藥物的開發(fā)提供研究基礎(chǔ)。