程 晶，劉文曉，王曉玥,2，王麗萍，江 波，李永清

(1.北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100097；2.北京農(nóng)學(xué)院，北京 102206；3.青島易邦生物工程有限公司，青島 266032)

非洲豬瘟(African swine fever,ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的一種豬的急性、烈性傳染病[1-2]。由于其接近100%的致死率，ASF給世界上許多國(guó)家的養(yǎng)豬業(yè)造成了毀滅性打擊，因此ASF被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(World Organization for Animal Health，OIE)列為法定報(bào)告動(dòng)物疫病，中國(guó)將其劃分為一類(lèi)動(dòng)物疫病。2018年8月初，該病在中國(guó)遼寧沈陽(yáng)首次發(fā)現(xiàn)，之后半年多的時(shí)間迅速蔓延至中國(guó)31個(gè)省份[3-4]。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，2019年中國(guó)的總體生豬產(chǎn)能與2018年相比降低了40%，生豬出欄量及豬肉產(chǎn)量下降幅度超過(guò)20%，給中國(guó)生豬產(chǎn)業(yè)的發(fā)展帶來(lái)了巨大的沖擊[5]。

由于目前尚無(wú)有效疫苗和藥物用于預(yù)防和治療ASF，因此必須在早期發(fā)現(xiàn)和嚴(yán)格的生物安全措施的基礎(chǔ)上消除已存在的病毒，并有效切斷病毒再次進(jìn)入養(yǎng)殖場(chǎng)的途徑達(dá)到預(yù)防和控制的目的[6]。為控制ASF疫情的擴(kuò)散，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部制定并出臺(tái)了一系列政策，包括《非洲豬瘟等重大動(dòng)物疫病分區(qū)防控工作方案(試行)》、《非洲豬瘟疫情應(yīng)急實(shí)施方案(第5版)》等。這些政策要求養(yǎng)殖者對(duì)ASF疫情做到盡早發(fā)現(xiàn)、及時(shí)確診、果斷處理。早期發(fā)現(xiàn)應(yīng)以現(xiàn)場(chǎng)快速識(shí)別疾病為基礎(chǔ)，然而ASF的臨床癥狀易與經(jīng)典豬瘟和高致病力豬繁殖與呼吸綜合征等敗血性疾病混淆，因此,進(jìn)行病原檢測(cè)對(duì)該病的控制至關(guān)重要。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外科研人員在ASF診斷監(jiān)測(cè)技術(shù)的研究與開(kāi)發(fā)工作取得了重大成效,不僅有能檢測(cè)潛伏期感染的病毒病原檢測(cè)技術(shù)，也有能檢測(cè)早期抗體的血清學(xué)監(jiān)測(cè)技術(shù)。筆者介紹了當(dāng)前ASF診斷技術(shù)的新特點(diǎn)，并對(duì)未來(lái)改進(jìn)診斷策略前景進(jìn)行了展望，以期為制定ASF的防控策略提供借鑒。

1 ASF的診斷標(biāo)識(shí)

ASFV是非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬的唯一成員，是具有雙層膜結(jié)構(gòu)的200 nm的大型DNA病毒。 ASFV基因組為線性雙鏈DNA，大小為170～193 kb，包括151～167個(gè)開(kāi)放性閱讀框，可編碼近200種病毒蛋白，其中至少有54個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白[7]。研究發(fā)現(xiàn)，50余種病毒蛋白可在感染豬體內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答[8-9]，如pp220、pp62、p72、p54、p30、CD2v、p10、p12、p14.5、p17、pA104R、pB602L和pK205R等。目前已知具備診斷標(biāo)識(shí)的蛋白有p30、p54、p72、pK205R、pB602L、p104R和pK145R等。ASFV重要的結(jié)構(gòu)蛋白p54、p30、p73和p72可用作血清學(xué)診斷的抗原。

p54蛋白由基因E183L編碼，分子質(zhì)量為25 ku,該蛋白位于病毒粒子脂質(zhì)外膜上，參與病毒吸附、侵入、復(fù)制及誘導(dǎo)特異性抗體的產(chǎn)生,其抗原性良好，針對(duì)p54蛋白的抗體可在豬感染ASFV 8 d后出現(xiàn)，并可持續(xù)數(shù)周[10-11]。

p30蛋白由CP204L基因編碼，分子質(zhì)量為30 ku，該蛋白也在病毒感染早期合成，與病毒入侵宿主細(xì)胞有關(guān)，抗原性強(qiáng)[12]。ASFV感染后2～4 h 即可表達(dá)p30蛋白，并持續(xù)表達(dá)整個(gè)感染過(guò)程，該蛋白的表達(dá)可指示病毒已侵入細(xì)胞并開(kāi)始復(fù)制[13-14]，因此,p54和p30蛋白是2個(gè)在病毒感染早期表達(dá)的蛋白，可作為早期檢測(cè)的靶標(biāo)[15-16]。

p72蛋白由B646L(VP72)基因編碼，分子質(zhì)量為73.2 ku，在病毒感染的晚期階段表達(dá)，是病毒粒子核衣殼的主要組成部分，具有很高的抗原性與免疫原性[17-18]。

CD2v蛋白(又稱(chēng)為PEP402R)類(lèi)似于T細(xì)胞表面的CD2分子，為糖蛋白，由EP402R基因編碼，表達(dá)于病毒感染晚期，其分子質(zhì)量為105 ku。該蛋白與病毒毒力、宿主免疫應(yīng)答及ASFV感染細(xì)胞的紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象有關(guān)，因此可基于CD2v的生物學(xué)特性建立紅細(xì)胞吸附(haemadsorption，HAD)試驗(yàn)[19-21]。

此外，pK145R、pB602L和pK205R蛋白能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高水平的特異性抗體[22-23]，可用于ASFV的抗體與抗原檢測(cè)，而病毒脫帽酶D250R或g5R對(duì)病毒復(fù)制至關(guān)重要，主要在病毒感染的早期表達(dá)，也有望作為ASFV感染早期診斷的靶抗原[24-25]。

2 ASF的診斷與檢測(cè)技術(shù)

迄今為止，開(kāi)發(fā)的ASF診斷與檢測(cè)技術(shù)均是針對(duì)ASFV的結(jié)構(gòu)蛋白及其編碼基因。OIE推薦的實(shí)驗(yàn)室診斷方法包括兩大類(lèi)：一類(lèi)是抗原檢測(cè)法，包括病毒分離、病毒抗原及基因組DNA的檢測(cè)；另一類(lèi)是抗體檢測(cè)，包括間接免疫熒光試驗(yàn)(indirect immunofluorescence assay,IFA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)、免疫印跡試驗(yàn)等。病毒分離鑒定是ASF診斷的經(jīng)典方法，始于20世紀(jì)60年代。該方法必須在生物安全3級(jí)(biosafety level 3,BSL-3)及以上實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，對(duì)操作人員的技術(shù)要求較高，且需進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，因此該方法不再被推薦為ASF診斷的選擇。HAD試驗(yàn)也曾是OIE推薦的ASFV特異性檢測(cè)方法之一。大多數(shù)ASFV分離毒株在接種細(xì)胞48～72 h后出現(xiàn)紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象，由于豬紅細(xì)胞能吸附在感染ASFV的單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞表面，形成特征性玫瑰花環(huán)，因此，HAD試驗(yàn)通常用于對(duì)分離培養(yǎng)的病毒進(jìn)行鑒定，但該方法依賴(lài)于原代豬組織細(xì)胞培養(yǎng)，故耗時(shí)3～10 d，且會(huì)漏檢一些無(wú)紅細(xì)胞吸附能力的毒株，因此,不適合ASF的快速診斷[26-27]。

現(xiàn)行的檢測(cè)方法主要集中于病毒核酸檢測(cè)和血清學(xué)檢測(cè)。前者包括不同類(lèi)型的PCR基因擴(kuò)增方法，后者則主要為IFA、ELISA及免疫膠體金等抗原抗體檢測(cè)技術(shù)，由于各種檢測(cè)方法的原理和適用場(chǎng)景不同，需根據(jù)當(dāng)?shù)貙?shí)驗(yàn)室的診斷能力及樣本質(zhì)量選擇適合的方法。為此，研究者也針對(duì)各種實(shí)際情況改進(jìn)和創(chuàng)新了不同的檢測(cè)技術(shù)。

2.1 病毒核酸檢測(cè)方法

ASFV的病毒核酸檢測(cè)方法主要有常規(guī)PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、微滴數(shù)字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)、交叉引物擴(kuò)增技術(shù)(crossing-priming amplification,CPA)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)、重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(recombinase polymerase amplification,RPA)等。中國(guó)動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心已開(kāi)展了2個(gè)批次ASF現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)試劑評(píng)價(jià)工作。實(shí)時(shí)熒光定量PCR和LAMP為中國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部推薦使用的現(xiàn)場(chǎng)快速診斷方法，目前公布的已批準(zhǔn)或待批準(zhǔn)(通過(guò)復(fù)核)的34個(gè)ASF現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)試劑名單中，28個(gè)是實(shí)時(shí)熒光定量PCR，6個(gè)為等溫?cái)U(kuò)增方法[28]。

2.1.1 基于常規(guī)PCR的核酸檢測(cè)方法 PCR為ASFV的檢測(cè)提供了一種廣泛用于ASFV實(shí)驗(yàn)室診斷的靈敏、特異、快速的方法。目前基于所有ASFV毒株VP72序列高度保守區(qū)域的新型PCR顯示出比OIE認(rèn)可的常規(guī)PCR更高的靈敏度，且在此基礎(chǔ)上建立的巢式PCR及多重PCR具有更高的靈敏度。PCR還具有對(duì)樣品純度要求低等優(yōu)點(diǎn)，當(dāng)腐敗的組織樣品不適合進(jìn)行病毒分離或樣品中的病毒已被滅活時(shí)，其仍是非常有效的檢測(cè)方法，但常規(guī)PCR檢測(cè)的樣品數(shù)量少，不適合大規(guī)模檢測(cè)[29-30]。然而，在此基礎(chǔ)上發(fā)展的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，如RPA、CPA、LAMP及ddPCR則從不同方面克服了常規(guī)PCR的缺陷。

RPA和重組酶介導(dǎo)擴(kuò)增技術(shù)(recombinase aided amplification,RAA)是利用重組酶、單鏈結(jié)合蛋白和DNA聚合酶在37 ℃恒溫下的核酸快速擴(kuò)增技術(shù)。二者原理相同，唯一不同的是RPA所用重組酶來(lái)源于T4噬菌體，而RAA使用的是從細(xì)菌或真菌中獲得的重組酶。二者的原理是重組酶與引物形成蛋白-DNA復(fù)合物，能在雙鏈DNA中尋找同源序列。引物找到同源序列后，會(huì)發(fā)生鏈交換反應(yīng)并啟動(dòng)DNA合成。反應(yīng)過(guò)程迅速，可在10 min之內(nèi)獲得可檢出水平的擴(kuò)增產(chǎn)物。Ceruti等[31]以ASFV p72蛋白的編碼基因B646L為模板，開(kāi)發(fā)了一種以中性紅為指示劑的實(shí)時(shí)RPA檢測(cè)技術(shù)。該檢測(cè)技術(shù)的分析靈敏度為3.5拷貝/μL，其敏感性和特異性均為100%,與OIE推薦的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的符合率為100%，且只需簡(jiǎn)單的DNA分離步驟就能快速檢測(cè)ASFV。研究表明，RPA/RAA可與橫向流動(dòng)檢測(cè)(lateral flow assay，LFA)結(jié)合使用，可更直觀地觀察結(jié)果。Wang等[32]利用RPA擴(kuò)增產(chǎn)物與LFA相結(jié)合，開(kāi)發(fā)出金納米粒子試紙條，該方法反應(yīng)迅速，可特異性識(shí)別感染ASFV和經(jīng)典豬瘟病毒(classical swine fever,CSFV)的血液樣本中的ASFV，檢測(cè)限(limit of detection,LOD)為102拷貝/μL，且實(shí)現(xiàn)快速擴(kuò)增后對(duì)產(chǎn)物的肉眼觀察，整個(gè)過(guò)程無(wú)需任何昂貴的儀器。Zhang等[33]利用RAA與LFA結(jié)合建立了一種靈敏、特異、快速和簡(jiǎn)單的即時(shí)檢測(cè)血液樣本中ASFV的方法RAA-LFA。RAA-LFA從采樣到最終診斷確定的完整工作流程可在30 min內(nèi)以最少的設(shè)備要求完成，包括簡(jiǎn)單稀釋和煮沸5 min處理血樣，在37 ℃水浴中使用RAA法等溫?cái)U(kuò)增10 min，以及在室溫下使用LFA視覺(jué)讀數(shù)10～15 min，其結(jié)果比OIE推薦的PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR靈敏10倍。RPA/RAA的缺點(diǎn)是檢測(cè)成本較高，且單一溫度低濃度模板擴(kuò)增會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生非特定產(chǎn)物。

CPA技術(shù)是一種新型核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，是中國(guó)首個(gè)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的核酸擴(kuò)增技術(shù)[34]。其針對(duì)目的基因4或5個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4或5條特異性引物，利用具有鏈交換特性的BstDNA聚合酶、甜菜堿，在65 ℃左右條件下高效、快速和高特異性擴(kuò)增靶序列。Fraczyk等[35]設(shè)計(jì)5種交叉引物在63 ℃通過(guò)鏈置換擴(kuò)增目標(biāo)基因建立的CPA，無(wú)需初始變性步驟,不僅可檢測(cè)血液和血清，且可檢測(cè)到各種形式的豬肉產(chǎn)品中的ASFV，LOD達(dá)到7.2拷貝/μL。

ASFV檢測(cè)的LAMP是當(dāng)前研究熱點(diǎn)的新型核酸擴(kuò)增技術(shù)。其工作原理是針對(duì)目標(biāo)DNA鏈上的6個(gè)區(qū)段設(shè)計(jì)4對(duì)不同的引物，利用鏈置換反應(yīng)將基因模板、引物、鏈置換型DNA合成酶、基質(zhì)等共同置于(60～65 ℃)恒溫條件下擴(kuò)增15～60 min，一個(gè)步驟完成。LAMP具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、直觀可視、不需檢測(cè)儀器等特點(diǎn)，能滿(mǎn)足基層快速診斷ASF的需求[36]。Wang等[37]以中性紅作為比色指示劑建立了靶向ASFV拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ基因的LAMP技術(shù)，可以對(duì)ASFV進(jìn)行半定量檢測(cè)，是中國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部評(píng)價(jià)的第一批ASFV核酸檢測(cè)試劑盒之一；Zhu等[38]將蜂巢芯片(Hive-Chip)與直接LAMP檢測(cè)相結(jié)合建立了多元化、可視化的檢測(cè)平臺(tái)。 其設(shè)計(jì)了靶向5個(gè)ASFV基因(B646L、B962L、C717R、D1133L和G1340L基因)的LAMP引物并在Hive-Chip中預(yù)先固定。這種基于芯片的LAMP對(duì)模擬樣本的LOD為30～50拷貝/μL，且靶基因之間沒(méi)有交叉反應(yīng)，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程不超過(guò)70 min，將是現(xiàn)場(chǎng)快速和準(zhǔn)確檢測(cè)ASFV的一個(gè)有前景的平臺(tái)。但由于核酸氣溶膠污染，LAMP技術(shù)假陽(yáng)性較多，因此需進(jìn)一步改進(jìn)。

此外，ddPCR是結(jié)合液滴微流控芯片與數(shù)字PCR技術(shù)的一種新型技術(shù)。其原理是將水相溶液樣品分成數(shù)萬(wàn)個(gè)納升體積大小的微滴，經(jīng)PCR擴(kuò)增后對(duì)微滴進(jìn)行逐個(gè)檢測(cè)，含待檢靶標(biāo)的微滴有熒光信號(hào)的微滴判讀為1，沒(méi)有熒光信號(hào)的微滴判讀為0，根據(jù)泊松分布原理及陽(yáng)性微滴的個(gè)數(shù)與比例即可得出靶分子的起始拷貝數(shù)或濃度。這是一種不依賴(lài)于標(biāo)準(zhǔn)曲線即可實(shí)現(xiàn)DNA絕對(duì)定量的方法，與傳統(tǒng)PCR相比，其靈敏度、特異性都很高，且適合基質(zhì)復(fù)雜樣品的檢測(cè)，尤其是在病毒含量較低的潛伏期的組織。2017年，鄔旭龍等[39]建立ASFV ddPCR，對(duì)163份國(guó)內(nèi)和進(jìn)境的組織樣本及血清樣本的LOD可達(dá)到0.36 拷貝,在20 μL反應(yīng)體系中約為10 拷貝/反應(yīng),檢測(cè)靈敏度是實(shí)時(shí)熒光定量PCR的10倍，因此可作為ASFV的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)時(shí)技術(shù)儲(chǔ)備。 然而，該方法同樣需昂貴的儀器設(shè)備,很難在基層推廣。

2.1.2 基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的核酸檢測(cè)方法 實(shí)時(shí)熒光定量PCR是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR過(guò)程，然后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析。由于具有檢測(cè)速度快(1 h)、結(jié)果客觀、可定量基因組含量等優(yōu)點(diǎn)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)成為OIE、世界糧農(nóng)組織(Food and Agriculture Organization,FAO)與中國(guó)推薦使用的檢測(cè)ASFV的首選方法及金標(biāo)準(zhǔn)。研究人員在此基礎(chǔ)上進(jìn)行改良，建立了一系列的ASFV檢測(cè)方法。王淑娟等[40]針對(duì)ASFV的p72基因和CSFV的5′-UTR序列的保守區(qū)域分別設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物和1條探針，建立了一種基于TaqMan MGB探針技術(shù)的FQ-PCR方法，能用于ASFV和CSFV快速鑒別檢測(cè)，LOD為10 拷貝/μL，檢測(cè)結(jié)果與豬瘟國(guó)標(biāo)方法及OIE推薦的ASFV檢測(cè)方法的符合率為100%。劉洋等[41]基于微芯片建立了ASFV免提取實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)，可用于中國(guó)不同地區(qū)ASFV毒株的通用檢測(cè)，LOD為10 拷貝/μL，與OIE推薦的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法符合率為100%，獲得了農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第一批ASFV現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)試劑的推薦。為滿(mǎn)足基層檢疫的需要，Chen等[42]研發(fā)了一種用于ASFV按需檢測(cè)的便攜式磁流體裝置。該設(shè)備采用微滴磁流體從血液、組織或拭子樣本中自動(dòng)純化DNA，然后利用快速熱循環(huán)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。檢測(cè)結(jié)果與參考實(shí)時(shí)熒光定量PCR陽(yáng)性符合率達(dá)92.2%，陰性符合率為93.6%，具有很高的診斷準(zhǔn)確性，且可在30 min內(nèi)獲得ASFV檢測(cè)結(jié)果。由于所有的試驗(yàn)都在一個(gè)一次性墨盒里進(jìn)行，不會(huì)對(duì)環(huán)境造成任何污染，因此適用于養(yǎng)豬場(chǎng)內(nèi)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

2.1.3 基于CRISPR/Cas12a的核酸檢測(cè)方法 CRISPR/Cas系統(tǒng)是古生菌和細(xì)菌中一種重要的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，可對(duì)特定基因序列進(jìn)行編輯。通過(guò)該技術(shù)對(duì)病毒基因進(jìn)行缺失或改造可用于動(dòng)物模型的制備、全基因組篩選、抗病毒及抗微生物和核酸檢測(cè)等[43]。新發(fā)現(xiàn)的CRISPR-Cas12a蛋白分子質(zhì)量比Cas9小，更易進(jìn)入組織或細(xì)胞，且脫靶效應(yīng)小，可更精確地選擇切割靶標(biāo)，因此基于CRISPR/Cas12a系統(tǒng)建立ASFV檢測(cè)方法是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)[44]。Bai等[45]以VP72為靶標(biāo)DNA，利用CRISPR/Cas12a系統(tǒng)檢測(cè)到ASFV DNA與Cas12a/crRNA復(fù)合物降解的ssDNA報(bào)告基因的熒光信號(hào)，從而建立高度敏感的ASFV核酸檢測(cè)方法,該方法不需要進(jìn)行核酸擴(kuò)增，在2 h內(nèi)能完成檢測(cè)，LOD為1 pmoL/L。Wang等[46]基于CRISPR/Cas12a技術(shù)和側(cè)向流檢測(cè)開(kāi)發(fā)了一種適用于食品樣品中的ASFV檢測(cè)方法(CRISPR/Cas12a-LFD),該方法LOD為20拷貝/反應(yīng)，與其他的豬病毒DNA沒(méi)有交叉反應(yīng),對(duì)149份臨床樣本中ASFV的檢測(cè)結(jié)果與實(shí)時(shí)熒光定量PCR的符合率為100%。Wu等[47]結(jié)合PCR方法與CRISPR/Cas12a系統(tǒng)建立了一種橫向流動(dòng)生物傳感器(lateral flow biosensor,LFB)，可檢測(cè)全血中的ASFV，直接通過(guò)肉眼觀察結(jié)果，檢測(cè)靈敏度可達(dá)2×10-15moL/L。由于CRISPR/Cas12a技術(shù)無(wú)需昂貴的儀器，為ASFV的檢測(cè)提供了一種更加便攜、簡(jiǎn)單、靈敏和特異性新型替代方法，因此其可能是ASF疫情的預(yù)防和控制措施中具有前景的研究方向。

2.2 血清學(xué)檢測(cè)方法

ASFV感染后在豬體內(nèi)引起強(qiáng)烈的體液免疫反應(yīng)并持續(xù)很長(zhǎng)時(shí)間。雖然產(chǎn)生的抗體不能完全中和再次感染的病毒，卻能成為指示病毒感染的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。尤其是當(dāng)豬感染低毒力病毒株時(shí)，抗體檢測(cè)可能是鑒別受感染動(dòng)物的唯一方法。OIE推薦的檢測(cè)ASFV抗體的方法包括ELISA、IFA、間接免疫過(guò)氧化物酶試驗(yàn)(indirect immunoperoxidase test，IPT)及免疫層析試紙條技術(shù)等。

2.2.1 基于ELISA的抗體檢測(cè)方法 ELISA檢測(cè)方法具備操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)快速、成本較低等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛用于ASF檢測(cè)，既可用于檢測(cè)抗原，也可用于檢測(cè)血清中的抗體?？贵w檢測(cè)ELISA是國(guó)際貿(mào)易指定檢測(cè)低毒力和中等毒力ASFV感染豬的診斷方法。研究人員利用原核/真核系統(tǒng)表達(dá)重組蛋白建立了間接ELISA、競(jìng)爭(zhēng)ELISA和阻斷ELISA等多種ELISA方法。目前國(guó)外已上市商品化試劑盒，包括法國(guó)IDvet公司分別研發(fā)了針對(duì)p32、p62、p72蛋白的ASFV多抗體檢測(cè)的間接ELISA試劑盒及針對(duì)p32蛋白的競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)試劑盒，西班牙Ingenasa公司利用VP72蛋白的單克隆抗體建立的阻斷ELISA抗體檢測(cè)試劑盒，瑞典Svanovir公司以p30蛋白為靶點(diǎn)建立的間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒等。

此外，科研人員對(duì)ELISA方法進(jìn)行技術(shù)改良，大大提高了ELISA方法的靈敏度和特異性。Yang等[48]利用化學(xué)發(fā)光法的自動(dòng)化、靈敏度高、適合防疫過(guò)程中動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)等優(yōu)勢(shì)對(duì)ASF ELISA技術(shù)進(jìn)行改良。Chen等[49]使用2種抗ASFV p72的單克隆抗體M-5和M-6基于放大的發(fā)光數(shù)值建立了一種檢測(cè)血清中ASFV的快速、免洗、一步式的ELISA(AlphaLISA)。AlphaLISA檢測(cè)的線性范圍為0.78～100 ng/mL，具有很高的敏感性。其對(duì)60份豬血清樣本檢測(cè)的靈敏度分別為93%和100%,特異性達(dá)到100%和91.7%。Giménez-lirola等[50]利用原核表達(dá)的重組蛋白p30制備了可用于檢測(cè)血清和口腔液樣品中的ASFV抗體。Nieto-pelegrín等[51]用半純化的ASFV VP72蛋白和人胚胎腎細(xì)胞(HEK293T)表達(dá)的重組蛋白ASFV VP30作為檢測(cè)抗原建立間接ELISA方法，首次在接種豬的糞便樣品中檢測(cè)到ASFV抗體。 以上這2種ELISA方法擴(kuò)大了現(xiàn)場(chǎng)條件下ASF監(jiān)測(cè)樣品的范圍。

2021年7月，中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心發(fā)布了ASFV抗體檢測(cè)試劑盒名單，全國(guó)共計(jì)26個(gè)廠家33種ELISA抗體檢測(cè)試劑盒通過(guò)實(shí)驗(yàn)室測(cè)評(píng)和專(zhuān)家評(píng)審，可用于臨床豬血清ASFV抗體檢測(cè)[52]。

2.2.2 基于熒光和酶標(biāo)記的抗體檢測(cè)方法 對(duì)于ASFV抗體檢測(cè)，一般推薦使用ELISA大范圍篩查抗體陽(yáng)性樣品，并采用IFA或IPT等血清學(xué)試驗(yàn)確認(rèn)[53-54]。這是因?yàn)榕R床采集的血清處理或保存不當(dāng)，如溶血樣品可能會(huì)造成高達(dá)20%的假陽(yáng)性結(jié)果。與ELISA檢測(cè)一樣，IFA和IPT均是通過(guò)特異性抗原抗體反應(yīng)實(shí)現(xiàn)對(duì)ASF抗體的檢測(cè)。IFA利用熒光標(biāo)記的二抗，陽(yáng)性血清能使ASFV感染的細(xì)胞出現(xiàn)特異性熒光。IPT利用陽(yáng)性血清能與ASFV感染的細(xì)胞結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗體作為二抗，與抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，在細(xì)胞表明形成不溶性可見(jiàn)產(chǎn)物。因此，這2種具有高度敏感性和特異性的快速檢測(cè)技術(shù)適用于從血清、血漿或組織滲出液中檢測(cè)ASFV抗體。基于熒光酶學(xué)顯色系統(tǒng)的發(fā)展，一種靈敏度比ELISA高的熒光標(biāo)記抗體檢測(cè)新方法得以開(kāi)發(fā)。Liu等[55]于2021年成功研制了快速簡(jiǎn)便的熒光素酶免疫沉淀試驗(yàn)(MB-LIPS)方法，可來(lái)檢測(cè)ASFV抗體。MB-LIPS是以ASFV p30蛋白作為識(shí)別元件，熒光素酶標(biāo)記的重組融合蛋白修飾磁珠A/G作為信號(hào)成分，從而建立了ASFV感染早期的抗體檢測(cè)方法。

2.2.3 基于免疫層析技術(shù)的抗體檢測(cè)試紙條 免疫層析技術(shù)是基于抗原抗體特異性免疫反應(yīng)的新型膜檢測(cè)技術(shù)，這種方法操作簡(jiǎn)便、快速、特異性強(qiáng)，無(wú)需借助于大型儀器讀取結(jié)果，因此更適于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)(pen-side test)。傳統(tǒng)免疫層析技術(shù)以膠體金為標(biāo)記物，通過(guò)條帶顯色對(duì)目標(biāo)物定性檢測(cè)或半定量分析。2014年，張?chǎng)斡畹萚56]利用重組ASFV p54蛋白為抗原建立了葡萄球菌蛋白A (staphylococcal protein A,SPA)捕獲膠體金標(biāo)記的p54抗原抗體復(fù)合物為檢測(cè)系統(tǒng)的膠體金免疫層析試紙條，檢測(cè)結(jié)果表明該方法的敏感性為200 ng，對(duì)ASFV抗體陽(yáng)性血清具有高度特異性。2016年，Sastre等[57]利用ASFV VP72蛋白的單克隆抗體包被試紙條，建立了能區(qū)分檢測(cè)ASFV與CSFV抗體的免疫層析試紙條。該試紙條LOD為3 ng，但這種方法靈敏度較差，且難以準(zhǔn)確定量。2020年，孫燕燕等[58]利用原核蛋白表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了ASFV的p30蛋白，將其用金納米顆粒標(biāo)記后包被在硝酸纖維素膜上，檢測(cè)ASFV感染豬的血清，與進(jìn)口ELISA試劑盒相比，敏感性和特異性分別為92.52%和92%，從而改進(jìn)了上述技術(shù)。此外，在此基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)的熒光微球標(biāo)記的試紙條，既保留了傳統(tǒng)膠體金試紙條的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，又發(fā)揮了熒光顯色的高度敏感性，因此成為當(dāng)前即時(shí)診斷技術(shù)的熱門(mén)研究方向之一[59]。

3 展 望

自2018年底ASF席卷中國(guó)以來(lái)，中國(guó)科研人員探索研發(fā)了各類(lèi)針對(duì)ASF的診斷技術(shù)，許多精確而快速的診斷盒研發(fā)成功并投入使用，在ASF的診斷與早期控制過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。層出不窮的ASF診斷技術(shù)其核心主要圍繞著病原學(xué)診斷與血清學(xué)診斷展開(kāi)，每種診斷技術(shù)都有其優(yōu)缺點(diǎn)。如ddPCR和RAP/RAA具有高靈敏度和特異性，但受昂貴的試驗(yàn)設(shè)備限制，ELISA、膠體金試紙條靈敏度和特異性較差，卻能節(jié)約檢測(cè)成本。此外，目前發(fā)現(xiàn)唾液采集樣本檢測(cè)ASF具有較好的臨床診斷優(yōu)勢(shì)，省時(shí)省力，還可減少對(duì)豬的應(yīng)激，因此，適用于大規(guī)模監(jiān)測(cè)唾液中病毒和抗體的技術(shù)值得期待。

然而，由于ASFV具有潛伏感染的特性，該階段病毒處于復(fù)制沉默或靜止，基因組拷貝數(shù)極低，僅編碼潛伏相關(guān)轉(zhuǎn)錄本(latency associated transcript,LAT)或microRNA，不誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，致使目前檢測(cè)ASFV DNA及其誘導(dǎo)的抗體的各種方法均無(wú)法甄別潛伏感染的動(dòng)物[60]，因此快速篩查出處于潛伏期或感染早期傳染源的新型檢測(cè)技術(shù)將是未來(lái)ASF防控體系的重要需求。隨著生物學(xué)技術(shù)的日益發(fā)展，用于特定捕獲富集流行病和人畜共患病毒的生物素化 RNA 誘餌技術(shù)(VirBaits)正成為下一代檢測(cè)技術(shù)的代表。這種技術(shù)已在嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(SARS-CoV-2)、ASFV、埃博拉病毒、馬爾堡病毒、尼帕病毒、裂谷熱病毒的診斷過(guò)程中體現(xiàn)出無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)，證實(shí)了其為快速、低成本、高靈敏度與高特異性的診斷方法，有望成為ASF診斷技術(shù)主要研究方向[61]，為從根本上解決ASFV潛伏或早期感染提供新的診斷技術(shù)手段。