田廣原,王宇琛,周雅坪,郭 婷,趙紅梅,趙逢淼,孫雅婕,卞宇晨,于佳梁,周雨霞

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，獸醫(yī)微生物學(xué)與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010018)

綿羊肺炎支原體(Mycoplasmaovipneumoniae，Mo)是引起綿羊和山羊呼吸道疾病的重要病原體之一[1]。支原體感染所引起的疾病在養(yǎng)殖業(yè)中危害范圍較廣[2]，通常情況下動(dòng)物以慢性、潛伏性感染為主，并與其他病原微生物共同感染[3]。內(nèi)蒙古地區(qū)是中國(guó)主要的養(yǎng)羊區(qū)，隨著養(yǎng)殖業(yè)逐漸規(guī)?；?，養(yǎng)殖密度也隨之增加，使得該病原在密集的群體中更加容易擴(kuò)散。

目前檢測(cè)綿羊肺炎支原體的方法有血清學(xué)方法、病原分離法、PCR、生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)等。病原分離法是檢測(cè)綿羊肺炎支原體的金標(biāo)準(zhǔn)，但其培養(yǎng)條件較為苛刻。鑒于綿羊肺炎支原體的高患病率，開(kāi)展一種血清學(xué)診斷靶標(biāo)的探索對(duì)于該病的防控具有重要意義[4]。ELISA具有靈敏度高、特異性好、易于牧場(chǎng)工作人員操作和批量化檢測(cè)等諸多優(yōu)點(diǎn)，已成為臨床中綿羊肺炎支原體檢測(cè)的常用方法[5]。

近年來(lái)，關(guān)于綿羊肺炎支原體保護(hù)性抗原的研究很多，黃海碧[6]針對(duì)綿羊肺炎支原體NM2010株全基因組的測(cè)序及基因功能結(jié)果注釋分析，篩選得到多個(gè)綿羊肺炎支原體表面脂蛋白；徐春光等[7]對(duì)綿羊肺炎支原體NM2010株篩選后得到其表面脂蛋白P60，并驗(yàn)證了P60蛋白是一種主要保護(hù)性抗原且具有良好的反應(yīng)原性?；诖耍驹囼?yàn)將P60基因進(jìn)行截短表達(dá)，并以Western blotting方法驗(yàn)證其反應(yīng)原性，將P60截短蛋白作為診斷抗原，建立檢測(cè)綿羊肺炎支原體抗體的間接ELISA方法，為綿羊肺炎支原體血清抗體檢測(cè)提供一種可行的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

綿羊肺炎支原體NM2010株及pET-32a(+)質(zhì)粒、口蹄疫病毒陽(yáng)性血清、小反芻獸疫病毒陽(yáng)性血清、布氏桿菌陽(yáng)性血清、牛支原體陽(yáng)性血清、絲狀支原體山羊亞種陽(yáng)性血清均由本實(shí)驗(yàn)室保存，臨床血清樣本于內(nèi)蒙古呼和浩特市周邊某羊場(chǎng)采集。

支原體基因組提取試劑盒購(gòu)自Axygen公司；牛血清白蛋白(BSA)、質(zhì)粒小提試劑盒、柱式膠回收試劑盒、大腸桿菌Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞、大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)自北京全式金生物科技有限公司；IPTG購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司；T4 DNA連接酶購(gòu)自TaKaRa公司；驢抗綿羊IgG-HRP、鎳層析柱BCA蛋白定量試劑盒均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；綿羊肺炎支原體標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、陰性血清及綿羊肺炎支原體間接血凝試劑盒均購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所。

1.2 P60蛋白抗原表位區(qū)預(yù)測(cè)及載體構(gòu)建

以綿羊肺炎支原體NM2010株(登錄號(hào)：AG35_RS03295)基因組DNA為模板，利用DNAStar軟件中的Protean對(duì)P60蛋白的抗原區(qū)、親水區(qū)進(jìn)行分析，篩選主要抗原域。通過(guò)Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)擴(kuò)增P60截短基因的特異性引物，上、下游引物分別為：5′-CGGGGTACCTCTGAAAGGT-TTGATGAAGATCGAA-3′和5′-CCGCTCGAG-TTGAATTCTAAGATCGTTAAATTGG-3′(下劃線處分別為KpnⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn))，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。對(duì)PCR產(chǎn)物及pET-32a(+)質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和XhoⅠ同時(shí)進(jìn)行雙酶切。然后用T4 DNA連接酶將目的片段和表達(dá)載體pET-32a(+)在16 ℃連接12 h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)Trans1-T1大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)菌落PCR篩選出陽(yáng)性菌落后提取重組質(zhì)粒，并由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3 重組蛋白最佳誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)至菌液D600 nm值為0.6～0.8時(shí)，分裝至6個(gè)試管中，每管5 mL，并編號(hào)，然后向每管中加入終濃度1 mmol/L的IPTG，37 ℃分別誘導(dǎo)2、4、6、8、10及12 h，經(jīng)SDS-PAGE篩選出最佳誘導(dǎo)時(shí)間。

1.4 重組蛋白的表達(dá)形式及純化鑒定

根據(jù)最佳誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)重組菌株進(jìn)行大量培養(yǎng)，待菌液D600 nm的值為0.6～0.8時(shí)，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG在37 ℃進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌體，用預(yù)冷的PBS洗滌3次，置于冰上進(jìn)行超聲破碎，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，分別收集上清液和沉淀，經(jīng)SDS-PAGE鑒定重組蛋白表達(dá)形式。

根據(jù)上述操作對(duì)重組菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)后收集菌體，超聲破碎后以12 000 r/min離心20 min收集菌體沉淀，經(jīng)變性、復(fù)性后用濾器過(guò)濾除雜質(zhì)，經(jīng)His-Ni柱親和層析進(jìn)行純化，采用梯度濃度洗脫方法，向Ni柱中加入2倍柱體積洗滌緩沖液，清洗3次；將過(guò)濾后的蛋白液加到Ni柱中，置于4 ℃結(jié)合2 h，棄管中液體；再用2倍柱體積的洗滌緩沖液沖洗Ni柱3次，洗脫雜蛋白；最后向Ni柱中加入2倍柱體積的結(jié)合緩沖液，洗脫目的蛋白。取40 μL純化后的蛋白與10 μL SDS-PAGE Buffer混勻，沸水浴10 min后冰上靜置2 min，上樣10 μL，經(jīng)SDS-PAGE鑒定重組蛋白的純化結(jié)果。采用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。

1.5 表達(dá)產(chǎn)物的Western blotting檢測(cè)

以綿羊支原體陽(yáng)性血清為一抗，驢抗綿羊IgG-HRP為二抗，將純化后得到的P60截短蛋白經(jīng)SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)至0.45 μm的NC膜上，隨后加入5%脫脂乳于4 ℃封閉12 h，封閉結(jié)束后用TBST洗滌5次，加入稀釋好的陽(yáng)性血清，37 ℃孵育2 h，再次洗滌5次后加入酶標(biāo)二抗，37 ℃孵育2 h，洗滌5次后加入顯色液，顯色結(jié)束后觀察結(jié)果，進(jìn)行Western blotting檢測(cè)，檢驗(yàn)表達(dá)產(chǎn)物的反應(yīng)原性。

1.6 間接ELISA方法的建立

1.6.1 重組抗原的最佳包被濃度以及一抗血清最佳稀釋濃度確定 通過(guò)篩選將純化后的P60截短蛋白經(jīng)包被液稀釋至4、2、1、0.5 μg/mL后，以每孔100 μL包被至酶標(biāo)板中，用3% BSA進(jìn)行封閉；PBST洗滌3次后將綿羊肺炎支原體陽(yáng)性及陰性血清均以1∶25、1∶50、1∶100、1∶200、1∶400稀釋，每孔100 μL，用PBST洗滌3次。將驢抗綿羊IgG-HRP二抗用稀釋液1∶4 000稀釋，每孔加100 μL。37 ℃孵育1 h，洗滌后每孔加入100 μL TMB顯色液，室溫避光顯色10 min，立刻向每孔中加入50 μL的終止液(2 mol/L H2SO4)終止反應(yīng)。用PBS做為空白對(duì)照。用酶標(biāo)儀測(cè)定D450 nm值，并計(jì)算陽(yáng)性血清與陰性血清吸光值的比(P/N)，選取D450 nm值接近1且P/N值最大的一組數(shù)值所對(duì)應(yīng)的條件，即為篩選出的最佳抗原包被量和一抗稀釋濃度。

1.6.2 一抗最佳孵育時(shí)間的確定 按照上述優(yōu)化后的條件進(jìn)行一抗孵育時(shí)間的篩選，分別選擇孵育0.5、1、1.5、2 h。比較各組D450 nm的值，篩選出一抗最佳孵育時(shí)間。

1.6.3 酶標(biāo)二抗最佳工作濃度的確定 按照上述優(yōu)化的條件進(jìn)行酶標(biāo)二抗的最佳工作濃度篩選，利用稀釋液將酶標(biāo)二抗按1∶3 000、1∶4 000、1∶5 000進(jìn)行稀釋，測(cè)定D450 nm值，確定二抗最佳工作濃度。

1.7 間接ELISA方法的驗(yàn)證

1.7.2 特異性試驗(yàn) 按照上述建立的ELISA方法，分別檢測(cè)口蹄疫病毒、小反芻獸疫病毒、布氏桿菌、牛支原體、絲狀支原體山羊亞種的陽(yáng)性血清，每種血清做3個(gè)重復(fù)，用綿羊肺炎支原體陰性和陽(yáng)性血清作為陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，并以PBS作為空白對(duì)照。

1.7.3 敏感性試驗(yàn) 將綿羊肺炎支原體標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清進(jìn)行2倍倍比稀釋，從1∶32稀釋至1∶4 096，并以綿羊肺炎支原體陰性血清作為陰性對(duì)照。利用上述建立的ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，以P/N值及陰陽(yáng)性臨界值為依據(jù)，判定該方法的敏感性。

1.7.4 重復(fù)性試驗(yàn) 批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)：以同一批次的蛋白包被酶標(biāo)板，隨機(jī)取5份血清，每個(gè)血清做5個(gè)重復(fù)，計(jì)算變異系數(shù)，評(píng)價(jià)批內(nèi)重復(fù)性；以5個(gè)不同批次包被的酶標(biāo)板對(duì)5份血清進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)血清做5個(gè)重復(fù)，變異系數(shù)(%)=(標(biāo)準(zhǔn)差÷平均值)×100%，計(jì)算變異系數(shù)，評(píng)價(jià)批間重復(fù)性。

1.7.5 臨床樣品的檢測(cè) 分別使用本試驗(yàn)建立的基于P60截短蛋白的間接ELISA方法和綿羊肺炎支原體間接血凝診斷試劑盒對(duì)從內(nèi)蒙古某羊場(chǎng)采集的92份臨床血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算二者的符合率。

2 結(jié) 果

2.1 P60蛋白抗原表位區(qū)預(yù)測(cè)及載體構(gòu)建

在GenBank中下載P60基因序列的CDS區(qū)域，用生物信息學(xué)軟件篩選出P60基因在58-928位氨基酸區(qū)域親水指數(shù)為0～2.0、抗原指數(shù)為0.8～1.7(圖1)。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室已完成的針對(duì)綿羊肺炎支原體NM2010株全基因組測(cè)序工作及基因功能注釋結(jié)果分析，篩選得到一個(gè)綿羊肺炎支原體黏附素樣蛋白P60，利用NCBI BLAST對(duì)P60基因進(jìn)行氨基酸序列相似性對(duì)比，分析結(jié)果顯示，綿羊肺炎支原體P60基因序列與綿羊肺炎支原體NCTC10151株的相似性為99.92%，證明該基因在綿羊肺炎支原體中具有較高的保守性。經(jīng)PCR反應(yīng)擴(kuò)增后得到P6058aa-928aa基因，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，目的片段大小約870 bp(圖2)。 將目的基因連接到pET-32a(+)載體中，經(jīng)測(cè)序重組表達(dá)載體與預(yù)期一致。

2.2 重組蛋白最佳誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化

SDS-PAGE結(jié)果顯示，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組蛋白均可在大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，其蛋白分子質(zhì)量約為42 ku(圖3)，均與預(yù)測(cè)分子質(zhì)量相符。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，蛋白的表達(dá)量也逐漸增大；當(dāng)誘導(dǎo)10 h后，蛋白表達(dá)量基本保持不變，最佳誘導(dǎo)時(shí)間為10 h。

2.3 重組蛋白的表達(dá)形式及純化鑒定

將誘導(dǎo)后pET-32a-P6058aa-928aa破碎，對(duì)上清液和沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行可溶性分析，結(jié)果表明，該蛋白在沉淀中出現(xiàn)，說(shuō)明重組蛋白以包涵體的形式表達(dá)(圖4A)；將包涵體進(jìn)行變性、復(fù)性后再進(jìn)行Ni柱親和層析純化和SDS-PAGE鑒定，在42 ku處出現(xiàn)目的條帶，未見(jiàn)其他雜蛋白(圖4B)，表明成功獲得純度較高的P60蛋白。BCA蛋白定量測(cè)得蛋白濃度為0.795 mg/mL。

圖1 綿羊肺炎支原體P60蛋白主要抗原域分析結(jié)果Fig.1 Analysis of major antigenic domains of Mycoplasma ovipneumoniae P60 protein

M,Trans 2K DNA Marker；1、2，綿羊肺炎支原體NM2010株 gDNA；3，陰性對(duì)照M,Trans 2K DNA Marker;1 and 2,Mycoplasma ovipneumoniae NM2010 gDNA strain;3,Negative control圖2 綿羊肺炎支原體P6058aa-928aa基因片段PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplification results of Mycoplasma ovipneumoniae P6058aa-928aa gene

M,蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～6,誘導(dǎo)2、4、6、8、10、12 h的重組蛋白M,Protein Marker;1-6,Recombinant protein induced for 2,4,6,8,10 and 12 h,respectively圖3 重組蛋白不同誘導(dǎo)時(shí)間的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of recombinant protein induced for different time

M，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1，pET-32a空載體；2，pET-32a-P6058aa-928aa 37 ℃誘導(dǎo)10 h破碎后上清液；3，pET-32a-P6058aa-928aa37 ℃誘導(dǎo)10 h破碎后沉淀；4，純化的P60重組蛋白M, Protein Marker; 1, pET-32a empty carrier; 2, Supernatant of induced pET-32a-P6058aa-928aa at 37 ℃ for 10 h; 3, Precipitate of induced pET-32a-P6058aa-928aa at 37 ℃ for 10 h; 4,Purified recombinant protein P60圖4 P60重組蛋白的表達(dá)(A)及純化(B)鑒定Fig.4 Expression (A) and purification (B) identification of recombinant protein P60

2.4 表達(dá)產(chǎn)物的Western blotting分析

Western blotting結(jié)果顯示，重組蛋白可以與綿羊肺炎支原體陽(yáng)性血清發(fā)生特異性結(jié)合(圖5)，證明該目的蛋白具有良好的反應(yīng)原性。

2.5 間接ELISA方法的建立

由表1可知，當(dāng)抗原蛋白的包被濃度為0.5 μg/mL，一抗血清的稀釋濃度1∶100時(shí),陽(yáng)性血清D450 nm值約為1且P/N值最大。由表2可知，血清作用1.5 h時(shí)，P/N值最大，為3.313。由表3可知，將酶標(biāo)二抗進(jìn)行1∶4 000稀釋時(shí)，P/N值最大，為4.171。

圖5 純化的重組蛋白Western blotting鑒定結(jié)果Fig.5 Western blotting identification results of purificated recombinant protein

表1 抗原最佳包被濃度及一抗血清最佳稀釋度的確定(D450 nm值)

表2 一抗最佳孵育時(shí)間確定(D450 nm值)

2.5 間接ELISA方法的驗(yàn)證

2.5.2 特異性試驗(yàn) 利用建立的間接ELISA方法對(duì)小反芻獸疫病毒、口蹄疫病毒、布氏桿菌、牛支原體、絲狀支原體山羊亞種及綿羊肺炎支原體的陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)，D450 nm值分別為0.131、0.200、0.176、0.169、0.191和0.792。結(jié)果表明，除綿羊肺炎支原體陽(yáng)性血清外，其余均顯示為陰性，證明本方法具有較好的特異性。

2.5.3 敏感性試驗(yàn) 利用建立的間接ELISA鑒定，結(jié)果顯示，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清稀釋度為1∶2 048時(shí)，D450 nm值>0.36(表4)，因此判定為陽(yáng)性，說(shuō)明本方法具有較高的敏感性。

表4 敏感性檢測(cè)結(jié)果

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 用建立的ELISA方法檢測(cè)血清樣本后，計(jì)算批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)的變異系數(shù)為2.6%～5.0%，批間重復(fù)試驗(yàn)的變異系數(shù)為2.6%～5.7%，且二者的變異系數(shù)均<10%(表5)，說(shuō)明建立的間接ELISA方法重復(fù)性較好，檢測(cè)結(jié)果較穩(wěn)定。

表5 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.5.5 臨床樣品的檢測(cè) 利用本試驗(yàn)建立的間接ELISA方法和綿羊肺炎支原體血凝診斷試劑盒，同時(shí)檢測(cè)內(nèi)蒙古某羊場(chǎng)采集的92份血清樣本，2種方法均判定為陽(yáng)性的血清有31份，二者的陽(yáng)性符合率為81.6%(31/38)；2種方法均判定為陰性的血清有50份，二者的陰性符合率為92.6%(50/54)，總符合率為88.0%[(31+50)/92](表6)。

表6 臨床樣本的檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

綿羊肺炎支原體在養(yǎng)殖密度較大的養(yǎng)殖場(chǎng)極易通過(guò)呼吸道進(jìn)行大規(guī)模傳播，因此一旦有羊感染病原，很快便會(huì)在羊群之間擴(kuò)散開(kāi)來(lái)，且一年四季均有發(fā)生，以秋冬季為主[9]。羔羊的發(fā)病率高達(dá)90%，易與其他病原混合感染，常見(jiàn)的有肺炎鏈球菌、巴氏桿菌及化膿桿菌[10]。普遍認(rèn)為，綿羊肺炎支原體膜蛋白上的黏附因子是其致病的關(guān)鍵原因，這其中也包括了主要保護(hù)性抗原。有研究人員提取了綿羊肺炎支原體的膜蛋白，發(fā)現(xiàn)上面存在多種免疫原性蛋白[11]。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室對(duì)分離到的綿羊肺炎支原體NM2010株基因組測(cè)序結(jié)果及生物信息學(xué)分析，綿羊肺炎支原體P60基因全長(zhǎng)1 602 bp，GC含量29.2%，第1～57 bp為信號(hào)肽區(qū)域[7]，由于其影響蛋白的折疊，故設(shè)計(jì)引物時(shí)將信號(hào)肽區(qū)域的序列截去，保留能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的抗原表位，而P60基因編碼的膜表面脂蛋白是參與免疫反應(yīng)的重要抗原成分，故本試驗(yàn)在保留目的基因完整的功能結(jié)構(gòu)域的基礎(chǔ)上截取一段連續(xù)的主要抗原表位進(jìn)行原核表達(dá)。

Mcauliffe等[12]首次以綿羊肺炎支原體的16S DNA為靶基因，建立了PCR檢測(cè)方法，但PCR所用到的設(shè)備比較多且價(jià)格昂貴，不適用于一般實(shí)驗(yàn)室；林裕勝等[13]建立了可以同時(shí)檢測(cè)綿羊肺炎支原體和絲狀支原體山羊亞種的雙重TaqMan探針熒光定量PCR，該方法操作繁瑣，成本較高；趙萍等[14]通過(guò)血凝抑制試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)綿羊肺炎支原體血清抗體，然而會(huì)有假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果出現(xiàn)。與之相比，間接ELISA以快速、敏感、可批量檢測(cè)樣品等優(yōu)點(diǎn)，更適于臨床檢測(cè)大量血清樣品。目前已建立了基于綿羊肺炎支原體全菌蛋白[15]、P60(N)-P65(C)[16]、P71[17]、P108[18]、P113[19]、P130[20]、EF-TU[21]、HSP70[22]及烯醇化酶[23]等抗體檢測(cè)方法，因各蛋白的功能不同，篩選出優(yōu)勢(shì)蛋白作為該病原的診斷抗原尤為重要。大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)分子質(zhì)量較大的蛋白時(shí)易產(chǎn)生包涵體，而包涵體需要用尿素變性后復(fù)性才能得到可溶性蛋白，變性復(fù)性過(guò)程較復(fù)雜，但本試驗(yàn)通過(guò)優(yōu)化誘導(dǎo)時(shí)間并純化后獲得了較單一的P6058aa-928aa蛋白，綜合Western blotting結(jié)果證明該蛋白具有良好的反應(yīng)原性，可將其作為間接ELISA方法的包被抗原。 與P60(N)-P65(C)蛋白相比，P6058aa-928aa蛋白包被時(shí)所需抗原量更少，并且發(fā)現(xiàn)用單一蛋白P6058aa-928aa作為診斷抗原時(shí)敏感性和重復(fù)性優(yōu)于串聯(lián)蛋白。而采用全菌作為包被抗原時(shí)，其復(fù)雜的抗原成分，很容易與其他病原產(chǎn)生的抗體發(fā)生交叉反應(yīng)，這種非特異性的結(jié)合會(huì)影響間接ELISA方法的準(zhǔn)確性，所以本試驗(yàn)利用篩選得到的優(yōu)勢(shì)抗原進(jìn)行包被有效地避免了該情況的發(fā)生。而間接ELISA方法較病原分離法更易操作，適合牧場(chǎng)檢測(cè)時(shí)使用，另外對(duì)儀器設(shè)備和實(shí)驗(yàn)室環(huán)境也沒(méi)有過(guò)高的要求。

本研究建立的綿羊肺炎支原體間接ELISA抗體檢測(cè)方法能夠特異性檢測(cè)綿羊肺炎支原體陽(yáng)性血清而不與口蹄疫病毒、小反芻獸疫病毒和絲狀支原體山羊亞種等6種病原體的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清發(fā)生交叉反應(yīng)，進(jìn)而證明了P6058aa-928aa蛋白純化成功，以該蛋白作為包被抗原時(shí)特異性較強(qiáng)。同時(shí)用間接血凝方法和本方法對(duì)92份臨床血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，二者陽(yáng)性符合率為81.6%，陰性符合率為92.6%，總符合率為88.0%，2種方法差異主要在于其原理不同，間接血凝法是通過(guò)致敏的綿羊紅細(xì)胞與相應(yīng)的抗體結(jié)合，使紅細(xì)胞聚集，出現(xiàn)的肉眼可見(jiàn)的凝集反應(yīng)。一般認(rèn)為ELISA方法的敏感性要高于間接血凝法，但P60蛋白僅僅是綿羊肺炎支原體眾多黏附樣蛋白中的一種，檢測(cè)效能有限，而且綿羊肺炎支原體的生長(zhǎng)需要從外界獲得多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，人工培養(yǎng)難度較大且周期較長(zhǎng)，故通過(guò)原核表達(dá)篩選出抗原性強(qiáng)的蛋白來(lái)代替全菌蛋白作為包被抗原是非常重要的。

4 結(jié) 論

本研究成功表達(dá)了P6058aa-928aa蛋白，并將其作為診斷抗原，建立了檢測(cè)綿羊肺炎支原體血清抗體的間接ELISA方法，包被抗原濃度為0.5 μg/mL，一抗血清的最佳稀釋濃度為1∶100，一抗最佳孵育條件為37 ℃、1.5 h，該方法與間接血凝法的總符合率為88.0%，說(shuō)明建立的間接ELISA方法比較可靠，可用于臨床樣本的檢測(cè)，為綿羊肺炎支原體的診斷及流行病學(xué)調(diào)查提供了較為可靠的方法。