王梓行，鄧興梅，邱潤(rùn)輝，朱德馨，李 佳，陶婷婷，朱嘉樂(lè)，孫志華,2,3，張 輝,2,3

(1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，石河子 832000；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)動(dòng)物疾病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子 832000；3.動(dòng)物健康養(yǎng)殖國(guó)家國(guó)際聯(lián)合研究中心，石河子 832000)

豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea,PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一類急性傳染病，發(fā)病豬表現(xiàn)為腹瀉、消瘦、精神消沉等特征[1]。PEDV在感染豬后，S蛋白與細(xì)胞膜上的氨基肽酶N(APN)受體結(jié)合侵入豬的小腸上皮細(xì)胞引起細(xì)胞損傷[2]，腸絨毛膜萎縮、脫落。PEDV可以感染各年齡段的豬，其中仔豬的臨床癥狀最為嚴(yán)重，死亡率最高可達(dá)100%。迄今為止，基于原型毒株CV777制成的滅活苗和減毒苗對(duì)于減少PED的危害仍具有重要意義，但在近年來(lái)的免疫壓力下，PEDV的S基因頻繁突變，比原型毒株CV777毒力更強(qiáng)的PEDV毒株在中國(guó)豬群傳播，這使得許多采取常規(guī)免疫程序的豬場(chǎng)的仔豬大量死亡[3]。因此，新型疫苗的研發(fā)[4]、疫苗的升級(jí)以及尋找新的藥物靶點(diǎn)來(lái)發(fā)展相關(guān)藥物研究對(duì)減少PED對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成的損失有著重要的意義。

自噬是真核生物特有的通過(guò)溶酶體降解細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)成分的統(tǒng)稱[5]。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)，屬于自噬相關(guān)蛋白8(ATG8)的同源物。自噬發(fā)生時(shí)，proLC3經(jīng)過(guò)ATG4的剪切形成LC3Ⅰ,LC3Ⅰ經(jīng)過(guò)ATG7和ATG3修飾后，與磷脂酰乙醇胺結(jié)合形成LC3Ⅱ，LC3Ⅱ可穩(wěn)定存在于自噬小體膜上，LC3Ⅱ的檢測(cè)被認(rèn)為是自噬檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)[6]。研究表明，病毒感染細(xì)胞可引起細(xì)胞自噬，而細(xì)胞自噬又會(huì)影響病毒的復(fù)制[7]。如豬繁殖與呼吸綜合征病毒誘導(dǎo)Marc-145細(xì)胞自噬進(jìn)而提高病毒的復(fù)制效率[8]，新城疫病毒感染Vero細(xì)胞后誘導(dǎo)自噬并在感染期間促進(jìn)新城疫病毒的復(fù)制[9]。Guo等[10]證實(shí)PEDV感染Vero細(xì)胞后誘導(dǎo)細(xì)胞自噬以促進(jìn)PEDV的復(fù)制。據(jù)報(bào)道，人源長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)-HOTAIR是一類與細(xì)胞自噬密切相關(guān)的lncRNA分子[11]，在多種癌癥和細(xì)胞中均有報(bào)道。然而，在動(dòng)物疫病的相關(guān)的研究中，lncRNA-HOTAIR的調(diào)控作用鮮有報(bào)道。

本研究通過(guò)建立PEDV誘導(dǎo)非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero-E6)自噬模型，篩選lncRNA-HOTAIR同源序列并結(jié)合Western blotting和實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)檢測(cè)其在PEDV感染Vero-E6細(xì)胞過(guò)程中的調(diào)控作用，進(jìn)而通過(guò)RNA干擾技術(shù)驗(yàn)證所得同源序列在PEDV誘導(dǎo)Vero-E6細(xì)胞發(fā)生自噬中的作用，為揭示lncRNA在PEDV感染Vero-E6細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮調(diào)控作用提供依據(jù)，對(duì)PEDV致病機(jī)制的研究、PED的防治以及新型藥物靶點(diǎn)的開(kāi)發(fā)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與毒株 Vero-E6細(xì)胞和PEDV毒株均由新疆石河子大學(xué)動(dòng)物疾病防控兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑及儀器 DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清(FBS)均購(gòu)自Gibco公司；UltraSYBR Mixture(Low ROX)熒光定量染料、Ultrapure RNA Kit均購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；Advanced系列轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Zeta Life公司；LC3A/B Rabbit mAb購(gòu)自Cell Signaling Technology(CST)公司；HRP AffiniPURE Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)購(gòu)自Earthox公司；高敏性ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京諾維贊生物科技股份有限公司；高通量實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(QuantStudioTM5 Real-time PCR Instrument A23134)購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司；電泳儀(DYCZ-24EN)購(gòu)自北京六一生物科技有限公司；化學(xué)發(fā)光成像儀(FluorChem E)購(gòu)自ProteinSimple公司。

1.2 方法

1.2.1 猴源同源序列預(yù)測(cè) 用LongMan在線軟件(http:∥lncRNA.sum.edu.cn)對(duì)lncRNA-HOTAIR進(jìn)行猴源同源序列(lncRNA-M)篩選分析；將篩選得到的序列上傳至在線軟件RNAfold(http:∥rna.tbi.nuivie.ac.at/cgi-bin /RNAWebSuit/RNAfold.cgi)生成序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)圖；利用LncLocator在線預(yù)測(cè)軟件(http:∥www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/lncLocator/#)對(duì)lncRNA-M序列進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)其核質(zhì)分布。

1.2.2 引物及干擾片段的設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)GenBank中PEDV N、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、lncRNA及GAPDH mRNA序列，用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)特異性引物，具體信息見(jiàn)表1。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。lncRNA的3條干擾片段(siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3)均由安徽通用生物系統(tǒng)有限公司設(shè)計(jì)并合成。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng) 將保存在的第8代Vero-E6細(xì)胞從液氮中取出后迅速放入37 ℃溫水中，待完全融化后轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中以1 000 r/min離心5 min，棄上清，用含10% FBS的DMEM重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞匯合度達(dá)到90%～100%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，傳代2次后的細(xì)胞用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.4 PEDV感染的Vero-E6細(xì)胞模型的建立及鑒定 取復(fù)蘇后傳代3次處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Vero-E6細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液后用PBS洗3次，加入500 μL PEDV與1 mL DMEM，添加終濃度為10 μg/mL的胰酶，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱孵育2 h，每隔20 min搖晃培養(yǎng)瓶。孵育結(jié)束棄病毒液，添加6 mL維持液(6 mL DMEM添加24 μL胰酶)繼續(xù)置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。定時(shí)觀察細(xì)胞狀態(tài)以及細(xì)胞病變的產(chǎn)生。感染48 h后，棄去病毒液，用PBS清洗細(xì)胞2次，用Trizol法提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，進(jìn)行N基因的擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，52.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

表1 引物及干擾片段信息

1.2.5 Western blotting檢測(cè)LC3蛋白表達(dá)水平 按1.2.4的方法建立PEDV感染Vero-E6細(xì)胞模型，分別在0、6、12、24、36和48 h收集細(xì)胞，加入450 μL蛋白裂解液后置于冰上裂解30 min，12 000 r/min離心10 min，收集上清后用BCA法測(cè)蛋白濃度，將蛋白定量后煮沸變性備用。制備12%分離膠和5%濃縮膠，上樣量為20 μL，轉(zhuǎn)膜35 min，5%脫脂奶粉封閉3 h，LC3A/B Rabbit mAb一抗(1∶1 000) 4 ℃過(guò)夜孵育，HRP AffiniPURE Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)二抗(1∶10 000)4 ℃孵育3 h，ECL顯色，化學(xué)發(fā)光成像儀拍照并保存，用于后續(xù)分析。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)LC3和lncRNA-M的表達(dá)水平 按1.2.4的方法建立PEDV感染Vero-E6細(xì)胞模型，分別在0、6、12、24、36和48 h后收集細(xì)胞并提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以GAPDH為內(nèi)參基因，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)LC3Ⅰ、LC3Ⅱ及l(fā)ncRNA-M的mRNA表達(dá)水平(每組各3個(gè)重復(fù))。PCR反應(yīng)體系10 μL：SYBR 5 μL，cDNA模板1 μL，上、下游引物各0.2 μL，ddH2O 3.6 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共50個(gè)循環(huán)。采用2-△△Ct法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7 lncRNA-M干擾對(duì)自噬的影響 將Vero-E6細(xì)胞接種于12孔板中，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到50%時(shí)，將3條lncRNA-M干擾片段(表1)按照siRNA產(chǎn)品使用說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每條干擾片段做3個(gè)重復(fù)孔并設(shè)立對(duì)照組(siRNA NC)。 轉(zhuǎn)染后24 h按照1.2.4方法接毒。接毒24 h后按照1.2.6方法檢測(cè)lncRNA-M的mRNA表達(dá)水平，篩選出干擾效率最高的1條siRNA。將Vero-E6細(xì)胞均勻接種于6孔板并設(shè)立lncRNA-M干擾組及其對(duì)照組，待細(xì)胞匯合度達(dá)到50%時(shí)分別轉(zhuǎn)染干擾效率最高的干擾片段和siRNA NC，細(xì)胞長(zhǎng)滿后均進(jìn)行接毒。按照1.2.5方法分別收集接毒24、48 h的細(xì)胞，檢測(cè)LC3蛋白的表達(dá)水平。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每個(gè)試驗(yàn)均重復(fù)3次。采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，組間差異采用t檢驗(yàn),結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 lncRNA-M篩選及其二級(jí)結(jié)構(gòu)與核質(zhì)分布預(yù)測(cè)

LongMan在線軟件預(yù)測(cè)得到自噬相關(guān)分子lncRNA-HOTAIR的lncRNA-M為lncRNA 0.1(Ensembl Gene ID：ENSG00000228630.1_Macaque)，lncRNA 0.1位于第11號(hào)染色體上,全長(zhǎng)2 626 bp；利用RNAfold在線軟件結(jié)合lncRNA 0.1的序列信息使用熱力學(xué)最小自由能法預(yù)測(cè)并生成lncRNA 0.1的二級(jí)結(jié)構(gòu)(圖1A)，其由大量莖區(qū)、發(fā)卡環(huán)、內(nèi)環(huán)以及少量的凸環(huán)和多分枝環(huán)構(gòu)成；lncRNA 0.1核質(zhì)分布分析結(jié)果顯示，lncRNA 0.1在細(xì)胞質(zhì)中的分布為41.88%，在細(xì)胞核中的分布為37.78%(圖1B)。

圖1 lncRNA 0.1二級(jí)結(jié)構(gòu)(A)及核質(zhì)分布(B)預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.1 Prediction results of lcnRNA 0.1 secondary structure (A) and subcellular localization (B)

2.2 PEDV感染Vero-E6細(xì)胞病變觀察及PEDV N基因鑒定

PEDV感染Vero-E6細(xì)胞48 h后可觀察到明顯的細(xì)胞病變，與對(duì)照組(圖2A)相比，感染組的細(xì)胞呈現(xiàn)明顯皺縮、細(xì)胞膜融合、細(xì)胞聚集成團(tuán)形成合胞體及大量脫落的現(xiàn)象(圖2B)。1.0%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在1 326 bp處出現(xiàn)目的條帶(圖2C)，與預(yù)期大小一致。說(shuō)明PEDV感染Vero-E6細(xì)胞模型成功建立，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

①A，對(duì)照組(100×)；B，PEDV感染組(100×)；C，目的片段擴(kuò)增電泳圖。②M，DL2000 DNA Marker；1～3，Vero-E6細(xì)胞；4，陰性對(duì)照①A,Control group (100×);B,PEDV infected group (100×);C,Amplification electrophoretogram of the target fragment.②M,DL2000 DNA Marker;1-3,Vero-E6 cells;4,Negative control圖2 PEDV感染Vero-E6及PEDV N基因的PCR結(jié)果Fig.2 PEDV infected Vero-E6 and PCR results of PEDV N gene

2.3 PEDV感染Vero-E6細(xì)胞自噬檢測(cè)

PEDV感染Vero-E6細(xì)胞6、12、24、36、48 h后，Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，LC3Ⅱ蛋白的表達(dá)量隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)而增加(圖3A)；根據(jù)LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白條帶計(jì)算灰度值并繪制柱狀圖，結(jié)果顯示LC3Ⅱ、LC3Ⅰ蛋白的比值在48 h最高，且極顯著高于0 h (P<0.01，圖3B)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)LC3的表達(dá)結(jié)果顯示，LC3Ⅱ、LC3ⅠmRNA比值在PEDV感染Vero-E6細(xì)胞6、12、24、36和48 h后總體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在48 h表達(dá)量最高，極顯著高于0 h (P<0.01)(圖3C)。

①A，LC3Ⅱ、LC3Ⅰ蛋白Western blotting檢測(cè)；B，LC3Ⅱ和LC3Ⅰ蛋白比值；C，LC3Ⅱ和LC3Ⅰ mRNA比值。②與0 h相比，**，差異極顯著(P<0.01)。圖4同①A, Western blotting detection of LC3Ⅱ and LC3Ⅰ proteins; B, Ratio of LC3Ⅱ and LC3Ⅰportein; C, Ratio of LC3Ⅱ and LC3Ⅰ mRNA. ②Compared with 0 h, **, Extremely significant difference (P<0.01). The same as fig.4圖3 PEDV感染Vero-E6后LC3蛋白和mRNA的相對(duì)表達(dá)量Fig.3 Expression of LC3 protein and mRNA after PEDV infection

2.4 PEDV感染的Vero-E6細(xì)胞lncRNA 0.1表達(dá)情況

PEDV感染Vero-E6細(xì)胞6、12、24、36、48 h后，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，lncRNA 0.1 的相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，12、24、36、48 h時(shí)lncRNA 0.1的表達(dá)量均極顯著高于0 h (P<0.01)(圖4)。

圖4 PEDV感染Vero-E6后lncRNA 0.1的表達(dá)Fig.4 Expression of lncRNA 0.1 after PEDV infection

2.5 干擾后lncRNA 0.1 mRNA和LC3蛋白的表達(dá)水平

轉(zhuǎn)染3條干擾片段后，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，siRNA-2的干擾效率最高，干擾效率為80%(圖5A)。Vero-E6細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA-2后，待細(xì)胞匯合度達(dá)到90%接毒，Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，干擾組接毒24和48 h后自噬標(biāo)志蛋白LC3的表達(dá)均明顯降低，說(shuō)明自噬受到抑制(圖5B)。

①與對(duì)照組相比，**，差異極顯著(P<0.01)。②1、3，對(duì)照組24、48 h LC3蛋白表達(dá)水平；2、4，siRNA-2干擾組24、48 h LC3蛋白表達(dá)水平①Compared with control group, **, Extremely significant difference (P<0.01). ②1 and 3, LC3 protein expression levels of control group at 24 and 48 h; 2 and 4, LC3 protein expression levels of siRNA-2 interference group at 24 and 48 h 圖5 lncRNA 0.1 mRNA(A)與LC3蛋白(B)的表達(dá)水平Fig.5 Expression of lncRNA 0.1 mRNA (A) and LC3 protein (B) after interference

3 討 論

自2010年至今，豬流行性腹瀉在中國(guó)各地均有爆發(fā)，對(duì)中國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)產(chǎn)生了巨大的危害，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，相關(guān)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，在中國(guó)33個(gè)省市地區(qū)的豬腹瀉疫情中，PEDV為主要疫病病原[12]。由于近年引起中國(guó)仔豬腹瀉的主要病原是PEDV變異株[13]，使用經(jīng)典株CV777的疫苗并不能有效地阻止PEDV變異株的感染[14]。因此，為解決中國(guó)各地PED的普遍暴發(fā)以及各地毒株類型的錯(cuò)綜復(fù)雜而導(dǎo)致的疫苗保護(hù)性差、PEDV防治藥物單一這一問(wèn)題，迫切需要對(duì)PEDV的致病機(jī)理進(jìn)行更深入地研究以開(kāi)發(fā)新的藥物靶點(diǎn)。目前，PEDV的研究主要集中在蛋白水平即探究病毒與宿主蛋白的互作[15]，但在核酸水平對(duì)于病毒與宿主的互作研究較少。因此，本試驗(yàn)從核酸水平出發(fā)，探究lncRNA對(duì)PEDV感染細(xì)胞自噬的調(diào)控作用。

與其他幾種RNA病毒一樣，冠狀病毒長(zhǎng)期以來(lái)被認(rèn)為與細(xì)胞自噬途徑相互作用[16]。自噬是一種保守的細(xì)胞過(guò)程，涉及自噬體的形成，自噬體包圍細(xì)胞質(zhì)成分，如長(zhǎng)壽命蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)聚集體和細(xì)胞器等，并將這些成分運(yùn)送到溶酶體進(jìn)行降解。盡管自噬是一種組成性途徑，但當(dāng)細(xì)胞處于應(yīng)激條件下，如饑餓或病原體感染時(shí)，自噬會(huì)上調(diào)。本研究中，在PEDV感染Vero-E6細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值呈上升趨勢(shì)；Western blotting結(jié)果顯示自噬標(biāo)志蛋白LC3的表達(dá)量隨著感染時(shí)間的增加而增多，試驗(yàn)結(jié)果從mRNA和蛋白的水平證實(shí)了PEDV感染細(xì)胞后誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬。

研究表明，lncRNA不僅能調(diào)節(jié)mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯，還參與調(diào)節(jié)病毒感染宿主后的抗病毒感染過(guò)程[17]。目前已有文章報(bào)道lncRNA對(duì)病毒的復(fù)制有重要影響[18],如馬齊蔓等[19]發(fā)現(xiàn)lncRNA 1620在牛病毒性腹瀉病毒感染牛腎細(xì)胞(MDBK)后參與調(diào)控細(xì)胞凋亡和病毒復(fù)制；王磊等[20]發(fā)現(xiàn)lncRNA 2694.1在豬流行性腹瀉病毒感染Vero細(xì)胞后參與調(diào)控PEDV的復(fù)制，當(dāng)過(guò)表達(dá)lncRNA 2694.1時(shí)，細(xì)胞中的病毒拷貝數(shù)明顯升高等。lncRNA-HOTAIR是一類與自噬密切相關(guān)的lncRNA分子。據(jù)報(bào)道，在腸胃道間質(zhì)瘤細(xì)胞中l(wèi)ncRNA-HOTAIR通過(guò)miR-130a/ATG2B通路激活自噬[21]；在肺泡巨噬細(xì)胞中l(wèi)ncRNA-HOTAIR通過(guò)miR-17-5p/ATG2/ATG7/ATG16通路調(diào)控自噬[22]。然而病毒感染后lncRNA-HOTAIR的調(diào)控作用以及l(fā)ncRNA-HOTAIR在動(dòng)物模型中的研究鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)通過(guò)生物信息學(xué)分析，篩選到了lncRNA-HOTAIR同源序列l(wèi)ncRNA 0.1,生物信息學(xué)分析結(jié)果得出lncRNA 0.1位于11號(hào)染色體，主要分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，且在細(xì)胞質(zhì)中的分布高于細(xì)胞核，分別為41.88%和37.78%。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR證實(shí)了在PEDV感染Vero-E6細(xì)胞后lncRNA 0.1的表達(dá)量隨著感染時(shí)長(zhǎng)的增加而升高。 成功干擾lncRNA 0.1后，自噬標(biāo)志蛋白LC3的表達(dá)明顯降低，自噬受到抑制，證實(shí)了lncRNA 0.1對(duì)自噬具有促進(jìn)作用。這一結(jié)果不但從核酸的水平驗(yàn)證了PEDV與宿主相互作用，也為自噬與lncRNA分子之間建立了聯(lián)系。隨著高通量測(cè)序技術(shù)日益成熟，對(duì)于PEDV感染細(xì)胞的全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序工作已經(jīng)陸續(xù)完成[23]，隨著越來(lái)越多表達(dá)差異顯著的lncRNA分子被挖掘，這些差異表達(dá)的lncRNA分子通過(guò)何種途徑和哪些通路發(fā)揮調(diào)控作用也是亟需解決的問(wèn)題。

綜上所述，lncRNA 0.1 在PEDV誘導(dǎo)的Vero-E6細(xì)胞自噬中具有促進(jìn)作用，這可能是病毒為促進(jìn)其本身生存繁殖的一種生存策略，推測(cè)lncRNA 0.1可能與某個(gè)或多個(gè)miRNA互作而形成這種調(diào)節(jié)作用?？傊?，本研究為進(jìn)一步研究PEDV感染過(guò)程中l(wèi)ncRNA調(diào)控自噬及宿主-病毒相互作用提供了一定的試驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)；同時(shí)lncRNA分子有可能成為PEDV診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，在PEDV感染Vero-E6細(xì)胞過(guò)程中自噬被激活，篩選出lncRNA 0.1可以調(diào)控自噬，且干擾lncRNA 0.1后，LC3蛋白的表達(dá)明顯降低，細(xì)胞自噬受到抑制，說(shuō)明lncRNA 0.1對(duì)于細(xì)胞自噬的發(fā)生起到正調(diào)節(jié)作用。結(jié)果可為進(jìn)一步揭示lncRNA在PEDV感染期間調(diào)節(jié)自噬的功能提供基礎(chǔ)，同時(shí)為PEDV的防治和相關(guān)藥物靶點(diǎn)的開(kāi)發(fā)提供新思路。