張?jiān)\，王閆宇，云艷虹，陳俊樸，石惠宇，王學(xué)梅

(海南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，?？?570228)

母山羊產(chǎn)前15 d到產(chǎn)后15 d這段特殊時(shí)期為圍產(chǎn)期，在圍產(chǎn)期由于機(jī)體經(jīng)歷了劇烈的生理變化，能量需求較大，但在圍產(chǎn)前期瘤胃易受到胎兒壓迫，使得采食獲得的營(yíng)養(yǎng)成分減少，因此機(jī)體多處于能量負(fù)平衡狀態(tài)[1]。在負(fù)平衡狀態(tài)下，體內(nèi)會(huì)出現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝不足、皮質(zhì)甾類激素大量釋放的現(xiàn)象[2]，此時(shí)機(jī)體需大量利用體脂進(jìn)行供能[3]，產(chǎn)生的非酯化脂肪酸會(huì)進(jìn)入乳腺組織，調(diào)節(jié)產(chǎn)生大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)，造成乳腺出現(xiàn)氧化損傷甚至免疫抑制[4]，從而引發(fā)乳腺炎[5]。同時(shí)乳腺細(xì)胞作為乳脂和乳蛋白合成分泌的重要場(chǎng)所，對(duì)維持其內(nèi)部的氧化-抗氧化穩(wěn)態(tài)具有重要的意義。因此，平穩(wěn)的度過(guò)圍產(chǎn)期減少氧化應(yīng)激的發(fā)生，有利于減少乳腺受到的損傷，提高母羊哺乳能力以及下個(gè)泌乳周期的生產(chǎn)性能和繁殖性能[6]。過(guò)氧化氫(H2O2)憑借其強(qiáng)氧化性且極易透過(guò)細(xì)胞膜誘發(fā)一系列反應(yīng)攻擊細(xì)胞[7]，被廣泛應(yīng)用于誘導(dǎo)氧化損傷[8]。以H2O2為誘導(dǎo)劑建立細(xì)胞體外氧化損傷模型的研究已有很多，但是鮮見(jiàn)關(guān)于建立山羊乳腺上皮細(xì)胞(GMEC)氧化損傷模型的研究。因此，通過(guò)GMEC建立體外的山羊氧化應(yīng)激模型，有利于了解其氧化應(yīng)激的發(fā)生機(jī)制并尋找應(yīng)對(duì)的措施。

目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者普遍選擇在飼料中添加某些抗氧化劑來(lái)維持山羊機(jī)體氧化穩(wěn)態(tài)，如丁酸鈉、亞硒酸鈉、煙酰胺、花青素等。Chang等[9]研究發(fā)現(xiàn)，高精料飼糧中補(bǔ)充丁酸鈉能夠緩解高精料飼糧造成的奶山羊乳腺氧化應(yīng)激，減少乳腺細(xì)胞的凋亡。孫婧陶等[10]研究發(fā)現(xiàn)，0.5 μg/mL亞硒酸鈉可以有效減少H2O2對(duì)延邊奶山羊乳腺上皮細(xì)胞的損傷。尹清艷[11]和何家俊[12]對(duì)圍產(chǎn)期奶山羊的研究均發(fā)現(xiàn)，飼料中添加煙酰胺有效降低了機(jī)體乳腺氧化產(chǎn)物的累積，提高了乳品質(zhì)以及乳汁的抗氧化能力，改善了羔羊的免疫功能，從而提高羔羊存活率，其中花青素作為一種水溶性天然色素，因其安全性高、清除自由基能力強(qiáng)的特點(diǎn)[13]，近年來(lái)被學(xué)者廣泛研究。Xie等[14]研究表明，茄屬植物花青素可通過(guò)抑制胱天蛋白酶3(Caspase-3)的表達(dá)，減弱阿散酸對(duì)雞成纖維細(xì)胞的氧化應(yīng)激。海南地區(qū)特有的含豐富花青素的紫大薯對(duì)緩解三硝基苯磺酸(TNBS)誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎效果良好[15]。然而紫大薯花青素能否保護(hù)圍產(chǎn)期山羊的乳腺組織，以及減少氧化應(yīng)激對(duì)乳腺細(xì)胞造成的損傷及其發(fā)揮作用的機(jī)制尚不清楚，亟需建立乳腺細(xì)胞氧化損傷的細(xì)胞模型進(jìn)行深入的研究。因此，本試驗(yàn)以H2O2作為氧化損傷模型誘導(dǎo)劑，以GMEC為試驗(yàn)對(duì)象，依據(jù)細(xì)胞存活率、培養(yǎng)液及細(xì)胞中ROS含量、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)活性及抗氧化標(biāo)志物的活性、含量的變化，探索最佳的H2O2處理濃度與時(shí)間，建立可靠的細(xì)胞氧化損傷模型，為今后在細(xì)胞層面探究紫大薯花青素對(duì)氧化損傷的保護(hù)機(jī)制提供模型條件，也為將來(lái)在飼料中添加海南紫大薯保護(hù)圍產(chǎn)期山羊乳腺組織提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 GMEC購(gòu)自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

1.1.2 主要試劑 胎牛血清(FBS)購(gòu)自HyClone公司；0.25%胰蛋白酶、DMEM/F12培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素混合溶液(100×雙抗)均購(gòu)自Gibco公司；CCK-8購(gòu)自Biosharp公司；表皮生長(zhǎng)因子(EGF)購(gòu)自Sigma公司；H2O2購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；過(guò)氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、總抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物科技有限公司；動(dòng)物細(xì)胞裂解液購(gòu)自TIANDZ公司；蛋白酶抑制劑(PMSF)、PBS、ROS、LDH試劑盒均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

完全培養(yǎng)基：DMEM/F12+6% FBS+1%雙抗+0.1% EGF。

終止培養(yǎng)基：DMEM/F12+10% FBS。

H2O2工作液：取10 μL H2O2原始液(10 mol/L)加入990 μL超純水配制成100 mmol/L H2O2母液，分別取35、43、46、49、52、55 μL H2O2母液用超純水配制成100 μL的H2O2儲(chǔ)備液；取各H2O2儲(chǔ)備液100 μL添加9 900 μL DMEM/F12培養(yǎng)基稀釋至350、430、460、490、520、550 μmol/L備用。

1.2 方法

1.2.1 H2O2處理濃度和時(shí)間的篩選 取培養(yǎng)24 h后處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的GMEC，按每孔3.8×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出后設(shè)28個(gè)處理組，每個(gè)處理組設(shè)6個(gè)重復(fù)。采用7×4二因子完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，即第一因素為H2O2濃度：0(對(duì)照組)、350、430、460、490、520和550 μmol/L，第二因素為H2O2處理時(shí)間：8、11、14、17 h。每孔添加工作液100 μL后置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)至各時(shí)間點(diǎn)吸出培養(yǎng)液，用PBS清洗3遍。之后向每孔中加入10 μL CCK-8試劑及100 μL不含F(xiàn)BS的DMEM/F12培養(yǎng)基，放回培養(yǎng)箱孵育2 h顯色。用酶標(biāo)儀測(cè)定D450 nm值，并按照以下公式進(jìn)行計(jì)算，根據(jù)存活率篩選H2O2處理濃度和時(shí)間。

GMEC相對(duì)存活率(%)=測(cè)定組D450 nm/對(duì)照組D450 nm×100%

1.2.2 H2O2處理對(duì)LDH活性的影響 篩選出細(xì)胞存活率在70%左右時(shí)H2O2處理濃度與時(shí)間后，取培養(yǎng)24 h后處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞按每孔1.3×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。 取出后設(shè)24個(gè)處理組，每個(gè)處理組設(shè)3個(gè)重復(fù)。 設(shè)H2O2濃度為0、350、430、460、490、520 μmol/L，設(shè)作用時(shí)間為4、6、8、10 h。每孔添加工作液3 mL后置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)至各時(shí)間點(diǎn)后吸出上清液，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定上清液中LDH活性。

1.2.3 H2O2處理對(duì)ROS含量的影響 1.2.2中取上清后的細(xì)胞經(jīng)PBS清洗3次后，按照說(shuō)明書(shū)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS含量，通過(guò)熒光酶標(biāo)儀在488 nm激發(fā)波長(zhǎng)，525 nm發(fā)射波長(zhǎng)下進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果以相對(duì)熒光強(qiáng)度表示。

1.2.4 H2O2處理對(duì)細(xì)胞抗氧化標(biāo)志物的影響 1.2.2中取上清后的細(xì)胞用PBS清洗3次后，每孔加入500 μL細(xì)胞裂解液與5 μL蛋白酶抑制劑，冰浴狀態(tài)下裂解30 min后用細(xì)胞刮刀刮凈孔底，將裂解液收集至1.5 mL離心管中做好標(biāo)記，1 000 r/min離心5 min，取上清備用。 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)分別檢測(cè)細(xì)胞中MDA含量、GSH-Px活性及上清液中SOD、CAT活性和T-AOC。

通過(guò)抗氧化標(biāo)志物的水平進(jìn)一步確定H2O2最適處理濃度與處理時(shí)間。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，采用Duncan氏法進(jìn)行組間多重比較，主體間效應(yīng)方式采用單變量線性分析。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 H2O2處理對(duì)細(xì)胞存活率的影響

由表1可知，當(dāng)處理時(shí)間為8、11、14、17 h時(shí)，GEMC存活率隨H2O2濃度的升高呈下降趨勢(shì)。 H2O2處理8 h時(shí),350、430、460 μmol/L 3個(gè)濃度下的細(xì)胞存活率分別為64.6%、72.9%、66.2%，較對(duì)照組顯著降低(P<0.05)，H2O2濃度>460 μmol/L 的處理組細(xì)胞存活率已降至60%以下。當(dāng)處理時(shí)間超過(guò)8 h后,各濃度處理下的細(xì)胞存活率均低于60%，與本試驗(yàn)70%的預(yù)期存活率有明顯差距。因此，后續(xù)試驗(yàn)所用H2O2濃度設(shè)為350、430、460、490、520 μmol/L,處理時(shí)間設(shè)為4、6、8、10 h。

2.2 H2O2處理對(duì)LDH活性的影響

由表2可知，培養(yǎng)液中LDH活性隨H2O2處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈持續(xù)增加的趨勢(shì)，在4 h時(shí)除430 μmol/L處理組外，各濃度處理下LDH活性均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；與對(duì)照組相比,6～10 h各處理組LDH活性均顯著升高(P<0.05)，且H2O2濃度越大處理時(shí)間越長(zhǎng)，變化就越明顯，其中430 μmol/L處理組在8 h時(shí)的LDH活性較4 h有顯著提高(P<0.05)，>430 μmol/L濃度的處理組在6 h時(shí)LDH活性即顯著高于4 h時(shí)的LDH活性(P<0.05)。

表1 各組GMEC存活率

表2 各組LDH活性

2.3 H2O2處理對(duì)ROS含量的影響

由表3可知，細(xì)胞內(nèi)ROS含量隨H2O2處理時(shí)間的增加趨勢(shì)，4 h時(shí)各處理濃度ROS含量無(wú)明顯變化；6 h時(shí)，各處理濃度下GMEC內(nèi)ROS的含量較對(duì)照組顯著升高(P<0.05)；8 h時(shí)各處理濃度下GMEC內(nèi)ROS的含量較對(duì)照組均有顯著升高(P<0.05)，同時(shí)各濃度處理組ROS含量較6 h均顯著升高(P<0.05)，說(shuō)明8 h為ROS含量變化的轉(zhuǎn)折時(shí)間點(diǎn),此時(shí)430 μmol/L處理組ROS相對(duì)含量達(dá)到168.3%，且在8 h時(shí)各處理組ROS含量趨于穩(wěn)定。

表3 各組ROS含量

2.4 H2O2處理對(duì)抗氧化標(biāo)志物活性的影響

由表4和5可知，CAT活性和T-AOC隨H2O2處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈先升后降再上升的整體趨勢(shì)。在6 h時(shí)，與4 h相比除430μmol/L處理組CAT活性顯著降低外(P<0.05)，各處理組CAT活性和T-AOC均出現(xiàn)了升高的現(xiàn)象，且490、520 μmol/L處理組T-AOC較對(duì)照組有顯著的升高(P<0.05)。8 h時(shí)各處理組CAT活性和T-AOC較6 h明顯下降，且430、520 μmol/L處理組的CAT活性和T-AOC較6 h均顯著降低(P<0.05)，說(shuō)明處理8 h為CAT活性和T-AOC變化的轉(zhuǎn)折時(shí)間點(diǎn)，此時(shí)350、430 μmol/L處理組CAT活性和T-AOC較對(duì)照組均顯著降低(P<0.05)。然而在10 h時(shí)除460、490、520 μmol/L處理組CAT活性比8 h降低外，其余各處理組CAT活性和T-AOC較8 h明顯上升。

由表6和7可知，SOD和GSH-Px活性隨H2O2處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降的趨勢(shì)。4 h時(shí)460 μmol/L處理組SOD和GSH-Px活性較對(duì)照組均顯著降低(P<0.05)；6 h時(shí)除350、460 μmol/L處理組SOD活性變化不明顯外，各處理組SOD和GSH-Px活性較對(duì)照組均顯著降低(P<0.05)。在8 h時(shí)除350 μmol/L處理SOD活性變化不明顯外，各處理組SOD和GSH-Px活性較對(duì)照組均顯著降低(P<0.05)，此時(shí)430 μmol/L處理組SOD活性較4 h顯著降低(P<0.05)，GSH-Px活性較6 h顯著降低(P<0.05)。 10 h時(shí)各處理組SOD和GSH-Px活性較對(duì)照組均顯著降低(P<0.05)。

表4 各組CAT活性

表5 各組T-AOC活性

表6 各組SOD活性

表7 各組GSH-Px含量

由表8可知，MDA含量隨H2O2處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈先降后升的整體趨勢(shì)。6 h時(shí)除350 μmol/L處理組外，MDA含量較4 h時(shí)均出現(xiàn)明顯降低。 8 h時(shí)430 μmol/L處理組較6 h明顯上升，且430、490、520 μmol/L處理組MDA含量較對(duì)照組顯著提高(P<0.05)。10 h時(shí)各處理組MDA含量均較對(duì)照組顯著提高(P<0.05)，此時(shí)350 μmol/L處理組較8 h顯著提高(P<0.05)，430 μmol/L處理組較6 h顯著提高(P<0.05)。

由表9可知，T-AOC主要受處理時(shí)間影響(P<0.05)；MDA含量主要受處理濃度影響(P<0.05)；CAT活性既受處理時(shí)間又受處理濃度影響(P<0.05)；細(xì)胞存活率、SOD、GSH-Px、LDH活性和ROS含量既受處理時(shí)間又受處理濃度影響(P<0.05)，同時(shí)還受到兩種因素的交互影響(P<0.05)。

表8 各組MDA含量

表9 處理時(shí)間和濃度的主體效應(yīng)和相互效應(yīng)對(duì)各指標(biāo)的影響

續(xù)表

3 討 論

在構(gòu)建氧化應(yīng)激模型時(shí)，細(xì)胞存活率通常在70%左右，降低至50%時(shí)會(huì)出現(xiàn)不可逆的嚴(yán)重?fù)p傷[16]；高于70%則說(shuō)明細(xì)胞狀態(tài)良好，氧化后沒(méi)有產(chǎn)生較為明顯的損傷；低于60%則說(shuō)明細(xì)胞開(kāi)始大量死亡并逐漸出現(xiàn)不可逆的氧化損傷，不利于試驗(yàn)的進(jìn)一步進(jìn)行[17-18]。本試驗(yàn)在構(gòu)建損傷模型時(shí)，由于初始處理時(shí)間8 h的設(shè)定跨度過(guò)大，導(dǎo)致所有處理濃度下GMEC的存活率均低于70%，并且隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)損傷程度逐漸加重，不符合建立模型的要求。因此，在處理時(shí)間和濃度上做出了一些調(diào)整，重新設(shè)定損傷時(shí)間為4、6、8、10 h，并去除較大的550 μmol/L處理濃度，防止出現(xiàn)不可逆的嚴(yán)重?fù)p傷以便后續(xù)試驗(yàn)的進(jìn)行。

由于培養(yǎng)液中添加不同濃度的H2O2導(dǎo)致外源ROS大量進(jìn)入細(xì)胞，ROS作為氧自由基在體內(nèi)發(fā)揮著重要的作用，既可以作為第二信使誘導(dǎo)并維持癌細(xì)胞的致癌表型，還可以誘導(dǎo)細(xì)胞衰老和凋亡[19]。正常代謝產(chǎn)生的ROS會(huì)被細(xì)胞內(nèi)抗氧化蛋白所消耗[20]，然而在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，大量產(chǎn)生的ROS對(duì)細(xì)胞DNA、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)造成損傷，從而影響細(xì)胞正常生理功能甚至引發(fā)凋亡[21]。在這種情況下，ROS可以直接或間接作為凋亡信號(hào)通過(guò)BH3(Bcl-2 homology domain 3-only)蛋白引起B(yǎng)ax(Bcl-2-asslciated protein X)蛋白移位至線粒體外膜并改變其通透性，使線粒體內(nèi)的促凋亡因子釋放到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)引發(fā)凋亡[22]。LDH作為一種存在于細(xì)胞質(zhì)中的酶，正常情況下不會(huì)分泌到胞外，只有在細(xì)胞膜受損或細(xì)胞凋亡的情況下才會(huì)釋放到細(xì)胞外[23]，因此培養(yǎng)液中LDH活性常被用來(lái)反映細(xì)胞凋亡情況[24]。本研究結(jié)果顯示，GMEC內(nèi)ROS含量在4 h時(shí)各處理組無(wú)明顯變化，在6～8 h時(shí)變化幅度較4～6 h時(shí)更大，說(shuō)明4～6 h時(shí)產(chǎn)生的ROS較少，可能是被某些抗氧化酶消耗掉一部分；而培養(yǎng)液中LDH含量從4 h開(kāi)始顯著升高，證明ROS含量一旦高于正常水平就可引發(fā)細(xì)胞凋亡。

抗氧化酶系統(tǒng)作為保護(hù)機(jī)體免受氧化損傷的屏障之一，主要由CAT、SOD和GSH-Px等多種抗氧化酶組成[25]。T-AOC可以反映機(jī)體內(nèi)抗氧化物質(zhì)對(duì)自由基的清除能力，以及各種抗氧化酶之間的協(xié)同程度，是評(píng)價(jià)機(jī)體抗氧化能力的重要指標(biāo)[26]。MDA作為自由基在機(jī)體內(nèi)發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化的終產(chǎn)物，不僅會(huì)影響抗氧化酶的活性，還會(huì)造成線粒體膜損傷[27]，因此也可作為判斷細(xì)胞損傷程度的條件之一。當(dāng)氧化應(yīng)激發(fā)生時(shí)，機(jī)體的抗氧化酶系統(tǒng)已存在較大的損傷或不足，因此人們常用黃酮類(如花青素)等一系列抗氧化活性物質(zhì)來(lái)提高機(jī)體的抗氧化能力[28]。海南紫大薯塊莖含有大量且種類豐富的花青素及膳食纖維等活性成分[29]，使其在開(kāi)發(fā)成為特色畜禽飼料方面具有巨大的潛力，Han等[30]研究發(fā)現(xiàn)紫大薯花青素可以顯著提高小鼠肝臟中SOD和GSH-Px的mRNA表達(dá)量。因此本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)過(guò)氧化產(chǎn)物及抗氧化能力2個(gè)方面進(jìn)行評(píng)定，能夠較完整地反映細(xì)胞的損傷程度，也為后續(xù)探究海南紫大薯花青素對(duì)氧化損傷的保護(hù)能力提供模型基礎(chǔ)。

本研究結(jié)果顯示，在不同濃度H2O2處理下，GMEC的CAT活性和T-AOC在4～6 h出現(xiàn)了升高的現(xiàn)象，與此同時(shí)MDA含量短暫降低，且ROS含量增長(zhǎng)緩慢。這可能是由于在H2O2的刺激下，細(xì)胞內(nèi)部有關(guān)抗氧化的基因或蛋白被激活，通過(guò)調(diào)控核轉(zhuǎn)錄因子2-抗氧化反應(yīng)元件(Nrf2-ARE)抗氧化機(jī)制[31]，增強(qiáng)CAT活性和T-AOC來(lái)應(yīng)對(duì)受到的刺激使細(xì)胞內(nèi)ROS含量保持相對(duì)穩(wěn)定從而降低MDA含量，這與喬娜等[32]對(duì)小鼠精原細(xì)胞氧化損傷的研究中CAT、T-AOC和MDA的變化趨勢(shì)是一致的。由于刺激時(shí)間逐漸加長(zhǎng)，刺激程度保持穩(wěn)定，導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)法長(zhǎng)期有效地應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激從而造成不可逆的損傷。因此CAT活性和T-AOC在6～8 h明顯降低，與本研究中主效應(yīng)分析結(jié)果顯著受處理時(shí)間影響的結(jié)果相一致。與此同時(shí)，細(xì)胞外LDH活性仍顯著升高，證明這些有限的保護(hù)機(jī)制無(wú)法阻止細(xì)胞凋亡。隨著H2O2處理濃度的增加，ROS的產(chǎn)量也逐漸增加，SOD和GSH-Px作為清除ROS的重要抗氧化酶在活性降低時(shí)可造成ROS大量堆積，從而引起脂質(zhì)過(guò)氧化，使MDA的含量增加。本試驗(yàn)結(jié)果表明，各H2O2濃度在不同時(shí)間的變化不明顯，而相同時(shí)間下H2O2濃度越高M(jìn)DA含量增加越顯著，這與王吉等[33]在對(duì)豬腎細(xì)胞氧化損傷的研究中得出的MDA含量變化與單寧酸添加濃度呈正相關(guān)的結(jié)果一致，但其中具體的調(diào)控機(jī)制以及大分子物質(zhì)的變化情況還需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

用430 μmol/L H2O2處理GMEC 8 h，細(xì)胞存活率降至72.9%，細(xì)胞內(nèi)ROS和MDA含量均顯著升高，GSH-Px活性顯著降低，培養(yǎng)液中LDH活性顯著升高，CAT和SOD活性顯著降低，T-AOC活性明顯降低。表明本研究利用H2O2成功建立GMEC氧化損傷模型，適宜濃度為430 μmol/L，作用時(shí)間為8 h。