王 奔，袁 帥，鄭 怡，張宏玲

(吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動物科技學(xué)院，吉林 132101)

肝臟作為動物機體中最關(guān)鍵的代謝器官，其結(jié)構(gòu)和功能的完整性對于機體健康狀況有重要的影響[1]。隨著畜禽養(yǎng)殖集約化、規(guī)模化的快速發(fā)展，養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)的疾病問題逐漸凸顯，這使得藥物在畜禽養(yǎng)殖中的使用量不斷提高[2]。而很多藥物中的成分難以被畜禽機體完全代謝，對動物肝臟組織有一定的損傷作用，氟喹諾酮類抗生素藥物長時間的使用將導(dǎo)致動物肝臟組織出現(xiàn)藥物性損傷的情況，誘發(fā)肝臟組織出現(xiàn)纖維化、肝硬化等疾病，最終對畜禽的機體健康和生產(chǎn)性能造成負(fù)面影響[3-4]。藥物性肝損傷受到多種信號通路的激活和抑制，這些信號通路可以介導(dǎo)機體氧化應(yīng)激、肝細(xì)胞損傷和凋亡等機制，其中JNK/MAPK信號通路與肝細(xì)胞的損傷凋亡有直接的關(guān)系。 谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶A1(GSTA1)作為動物機體中一種重要的Ⅱ相藥物代謝酶，在肝臟解毒和細(xì)胞保護中發(fā)揮著重要的作用。肝臟組織中肝細(xì)胞核因子-1(HNF-1)是調(diào)控肝臟組織中特異性基因表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，這些酶和轉(zhuǎn)錄因子與JNK信號通路及肝功能息息相關(guān)[5-6]。如何通過調(diào)控JNK/MAPK信號通路來緩解畜禽生產(chǎn)中肝臟藥物性損傷成為現(xiàn)階段改善動物肝臟健康狀況的熱點問題。本實驗室前期已篩選出可通過脂多糖(LPS)聯(lián)合恩諾沙星(ENR)(80 μg/mL LPS+20 μg/mL ENR，LPS/ENR)在仔豬原代肝細(xì)胞中建立藥物損傷模型(未發(fā)表)，為了進一步研究JNK信號通路在肝臟損傷中的作用，通過使用JNK抑制劑SP600125處理仔豬藥物性損傷肝細(xì)胞，探索JNK抑制劑對仔豬藥物性肝損傷緩解的作用及其機制，旨在為畜禽養(yǎng)殖中肝臟健康的保障提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM培養(yǎng)基購自賽默飛世爾科技有限公司；SP600125、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒均購自南京建成生物有限公司。超凈工作臺(SN17069-15)購自上海森信有限公司；恒溫培養(yǎng)箱(DH4000)購自天津泰斯特有限公司；倒置顯微鏡(T1-SM)購自尼康映像儀器銷售有限公司；PCR擴增儀(Biometra-Tgradient)購自Biometra公司；實時熒光定量PCR儀(LightCyclcr?96型)購自Roche公司。

1.2 仔豬肝細(xì)胞的分離培養(yǎng)

選取健康的30日齡仔豬(吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院試驗動物基地)，取肝臟組織剪成1 mm3小塊，用150 U/mL Ⅰ型膠原酶消化處理后，去除未消化組織，先后使用100目和200目的篩網(wǎng)進行過濾，收集含有肝細(xì)胞的濾液，50×g離心3 min，用DMEM培養(yǎng)液洗滌并離心2次(50×g，2 min)。用含15%胎牛血清的HM培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞后接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)2～3 h可以觀察到80%～90%的細(xì)胞貼壁，隨后更換培養(yǎng)基去除未貼壁的細(xì)胞。分離的原代肝細(xì)胞用含15%胎牛血清的HM培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2的環(huán)境下培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞分組及處理

在仔豬原代肝細(xì)胞匯合度達(dá)80%左右時，用0.05%胰酶消化后計數(shù)，以1×105/mL接種到24孔板。將細(xì)胞分為對照組(C)、JNK抑制劑組(SP)、模型組(M)和治療組(T)4組，每組6個重復(fù)。對照組不添加藥物，JNK抑制劑組添加2 μmol/L SP600125[7]，模型組添加80 μg/mL LPS+20 μg/mL ENR，治療組添加80 μg/mL LPS+20 μg/mL ENR+2 μmol/L SP600125。各組原代肝細(xì)胞用含有15%胎牛血清的HM培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h后，用PBS清洗3次，加入各分組的藥物后繼續(xù)培養(yǎng)6 h，收集培養(yǎng)液上清及細(xì)胞用于后續(xù)指標(biāo)的測定。

1.4 測定指標(biāo)

1.4.1 轉(zhuǎn)氨酶活性 按照ALT、AST試劑盒說明書測定并計算各組培養(yǎng)液上清中ALT、AST的活性。

1.4.2 GSH-Px、SOD活性及MDA的含量 按照試劑盒說明書測定并計算各組肝細(xì)胞中GSH-Px、SOD的活性及MDA的含量。

1.4.3 HNF-1和GSTA1 mRNA的相對表達(dá)量 用TRIzol法提取各組細(xì)胞總RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)GenBank中HNF-1和GSTA1基因的序列，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計特異性引物，引物信息見表1。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以β-actin為內(nèi)參基因，進行實時熒光定量PCR反應(yīng)。 PCR反應(yīng)體系20 μL：2×TranStart Top Green qPCR SuperMix 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，cDNA 0.5 μL，ddH2O 8.7 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性5 s，55 ℃退火15 s,72 ℃延伸10 s，共40個循環(huán)。使用2-△△Ct法計算mRNA的相對表達(dá)量。

表1 引物信息

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，差異顯著時使用Duncan氏法對組間數(shù)據(jù)進行多重比較。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 JNK抑制劑對肝細(xì)胞培養(yǎng)液中ALT和AST活性的影響

由圖1可知，與對照組相比，SP和T組肝細(xì)胞培養(yǎng)液上清中ALT和AST活性均沒有顯著差異(P>0.05)，M組肝細(xì)胞培養(yǎng)液上清中ALT和AST活性均顯著增加(P<0.05)；與M組相比，T組肝細(xì)胞培養(yǎng)液上清中ALT和AST的活性均顯著下降(P<0.05)。

2.2 JNK抑制劑對肝細(xì)胞抗氧化性能的影響

由圖2可知，與對照組相比，M組肝細(xì)胞中GSH-Px和SOD的活性均極顯著降低(P<0.01)；T組肝細(xì)胞中GSH-Px和SOD的活性沒有顯著差異(P>0.05)。與M組相比，T組肝細(xì)胞中GSH-Px和SOD的活性均顯著提高(P<0.05)。

由圖3可知，與對照組相比，M組肝細(xì)胞中MDA的含量極顯著增加(P<0.01)，T組肝細(xì)胞中MDA的含量沒有顯著差異(P>0.05)；與M組相比，T組肝細(xì)胞中MDA的含量顯著下降(P<0.05)。

2.3 JNK抑制劑對肝細(xì)胞中HNF-1和GSTA1 mRNA相對表達(dá)量的影響

由圖4可知，與對照組相比，M組肝細(xì)胞中HNF-1和GSTA1 mRNA的相對表達(dá)量均極顯著降低(P<0.01),T組肝細(xì)胞中HNF-1和GSTA1 mRNA的相對表達(dá)量沒有顯著差異(P>0.05);與M組相比，T組肝細(xì)胞中HNF-1和GSTA1 mRNA的相對表達(dá)量均顯著增加(P<0.05)。

肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標(biāo)不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)；肩標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同Values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05); And with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01); While with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below圖1 各組肝細(xì)胞培養(yǎng)液上清中轉(zhuǎn)氨酶的活性Fig.1 Transaminase activity in culture medium supernatant of hepatocyte in each group

圖2 各組肝細(xì)胞中抗氧化酶的活性Fig.2 Antioxidant enzyme activity of hepatocytes in each group

圖3 各組肝細(xì)胞中MDA的含量Fig.3 MDA content of of hepatocytes in each group

3 討 論

3.1 JNK抑制劑對肝細(xì)胞培養(yǎng)液中轉(zhuǎn)氨酶活性的影響

肝臟組織是動物機體中重要的代謝器官，對于脂類營養(yǎng)物質(zhì)的代謝，機體中代謝廢物的轉(zhuǎn)化和清除等具有關(guān)鍵的作用。肝臟在發(fā)揮功能的同時也很容易受到毒性物質(zhì)的影響，其中藥物性肝損傷是誘發(fā)急性和慢性肝臟疾病的重要病因之一[8-9]。隨著中國畜禽養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，疾病問題也開始逐漸凸顯，藥物在畜禽養(yǎng)殖中用量的增加也進一步提高了畜禽機體中肝臟組織出現(xiàn)疾病的概率[10]。 ALT和AST的活性水平是評價肝臟功能的重要指標(biāo)，在肝臟組織健康的情況下，ALT和AST均在肝細(xì)胞中，若受到刺激或者損傷后，肝細(xì)胞出現(xiàn)壞死、裂解等狀況，ALT和AST釋放到血液中，導(dǎo)致血液中ALT和AST濃度顯著提高[11]。本試驗中，通過使用LPS聯(lián)合ENR對仔豬原代肝細(xì)胞進行處理，ALT和AST活性均顯著升高，表明成功建立了藥物性肝損傷模型。ENR是畜禽養(yǎng)殖中一種常見的氟喹諾酮類藥物，楊鴻溢等[12]研究表明氟喹諾酮類藥物的使用可顯著提高機體中內(nèi)毒素的含量，而內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的重要成分，主要由LPS組成。LPS在動物機體中的蓄積將出現(xiàn)毒性作用，誘發(fā)肝臟組織出現(xiàn)損傷[13]，這也是本研究中通過LPS/ENR能成功建立仔豬原代肝細(xì)胞藥物性肝損傷模型的主要原因。研究表明，SP600125是JNK通路中JNK1、JNK2、JNK3的直接抑制劑，主要是通過抑制JNK通路中的磷酸化水平，有效地阻斷JNK通路中ATP的結(jié)合過程，同時減少c-jun活性因子的激活[14-15]。Kanamori等[16]和Sreekanth等[17]通過在肝臟損傷模型中應(yīng)用JNK抑制劑均獲得了緩解肝臟損傷的效果，改善了肝臟功能。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過在仔豬原代肝細(xì)胞損傷模型中額外添加JNK抑制劑SP600125可以有效降低肝細(xì)胞培養(yǎng)液中ALT和AST的活性水平，緩解由于LPS/ENR造成的肝細(xì)胞損傷。

3.2 JNK抑制劑對肝細(xì)胞抗氧化水平的影響

肝臟組織在代謝過程中會產(chǎn)生大量的代謝廢物和自由基，這些物質(zhì)的轉(zhuǎn)化和清除需要消耗大量的抗氧化酶，所以肝細(xì)胞中抗氧化酶的活性水平對于保障肝臟功能的正常有非常重要的作用[18]。GSH-Px是機體中一種廣泛存在的過氧化物分解酶，其活性中心是硒半胱氨酸，可以將動物機體中有毒有害的過氧化物還原成無毒無害的羥基化合物，進而保護機體細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)和功能完整[19]。SOD是機體中一種常見的抗氧化金屬酶，可以有效催化超氧陰離子自由基出現(xiàn)歧化反應(yīng)，維持機體的氧化平衡[20]。本研究中LPS/ENR的添加顯著降低了肝細(xì)胞中GSH-Px和SOD的活性水平，郭凡溪等[21]在海藍(lán)蛋雞試驗中通過腹腔注射LPS/ENR，顯著降低了海藍(lán)蛋雞肝臟抗氧化水平，本研究結(jié)果與之相似。而在額外添加了JNK抑制劑SP600125處理時，有效緩解了由于LPS/ENR造成的抗氧化酶活性降低的情況。MDA的含量是反映機體組織細(xì)胞氧化損傷的關(guān)鍵指標(biāo)，它是機體脂質(zhì)過氧化過程中出現(xiàn)的小分子產(chǎn)物，其含量的高低間接表明了組織細(xì)胞的氧化水平[22]。本試驗中LPS/ENR處理仔豬原代肝細(xì)胞后，細(xì)胞中MDA的含量顯著提高，而在此基礎(chǔ)上添加了JNK抑制劑SP600125時，仔豬原代肝細(xì)胞中MDA的含量與對照組沒有顯著差異，有效緩解了LPS/ENR對肝細(xì)胞造成的氧化損傷。說明SP600125可以有效提高肝細(xì)胞的抗氧化能力。

3.3 JNK抑制劑對肝細(xì)胞中HNF-1和GSTA1 mRNA相對表達(dá)量的影響

研究表明，GSTA1在機體中可以有效催化GSH與氧化代謝產(chǎn)物相結(jié)合，降低和緩解機體的氧化水平，保障機體組織功能的正常。在機體出現(xiàn)肝臟損傷時，GSTA1含量的變化先于ALT和AST含量的變化，可以作為早期肝臟損傷的判斷標(biāo)準(zhǔn)[23]。動物機體的血清和尿液中GSTA1的變化分別可以反映肝細(xì)胞狀態(tài)和腎近端腎小管狀態(tài)[24]。前人的研究發(fā)現(xiàn)，機體中HNF-1可以通過與GSTA1的啟動子結(jié)合進而調(diào)控GSTA1的表達(dá)，最終影響肝細(xì)胞損傷水平[25]。張園園等[7]對醋氨酚誘導(dǎo)損傷的肝細(xì)胞用JNK抑制劑處理后，有效降低了肝細(xì)胞損傷的程度，提高了GSTA1 mRNA的表達(dá)量。本試驗結(jié)果表明，在對仔豬原代肝細(xì)胞進行LPS/ENR處理后，肝細(xì)胞中HNF-1和GSTA1 mRNA相對表達(dá)量均極顯著降低，而在使用了JNK抑制劑SP600125處理后，肝細(xì)胞中HNF-1和GSTA1 mRNA相對表達(dá)量的水平和對照組沒有顯著差異，說明LPS/ENR對肝細(xì)胞的損傷會影響HNF-1和GSTA1的表達(dá)，而JNK抑制劑SP600125可以通過調(diào)控HNF-1和GSTA1的表達(dá)來緩解肝細(xì)胞藥物性損傷。

4 結(jié) 論

JNK抑制劑SP600125可以通過調(diào)控細(xì)胞的抗氧化能力及HNF-1和GSTA1的表達(dá)緩解仔豬原代肝細(xì)胞由LPS/ENR導(dǎo)致的藥物性損傷。