尉小軍，李巧巧，曾東東，蔣建軍

(石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，石河子 832000)

單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes，Lm)，簡稱單增李斯特菌，其生存能力強，廣泛存在于食品、環(huán)境及動物宿主體內(nèi)，是一種可對人類及畜禽健康造成嚴(yán)重危害的食源性胞內(nèi)兼性厭氧致病菌[1]。單增李斯特菌在致病過程中每步特定的生物學(xué)過程中都有特定的毒力因子參與其中,并產(chǎn)生各自的作用，其中不同的毒力因子之間相互密切聯(lián)系協(xié)作共同實現(xiàn)特定的生物學(xué)效應(yīng)[2]。內(nèi)化素作為其中一種重要的與黏附侵襲相關(guān)的毒力因子，能夠識別宿主細(xì)胞上的受體，包括inlA、inlB、inlC、inlC2、inlD、inlE、inlF、inlG、inlH等共25個基因[2-3]。其中，inlA和inlB作為最早鑒定出在細(xì)菌的黏附侵襲中起重要作用的毒力基因是非吞噬細(xì)胞所必需、單增李斯特菌所特有的[4]。Glaser等[5]通過比較基因組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)inlK基因只存在于單增李斯特菌中，在非致病性李斯特菌中不存在，并且在單增李斯特菌感染過程中inlK基因表達(dá)有明顯上升，表明inlK基因參與單增李斯特菌的致病過程。Dortet等[6]研究發(fā)現(xiàn)，inlK基因在單增李斯特菌逃避自噬過程中有一定作用。其中一些單增李斯特菌毒力基因已被證實會對其生物被膜形成產(chǎn)生影響，這些毒力基因不表達(dá)也會導(dǎo)致其生物被膜形成能力的減弱。有研究發(fā)現(xiàn)，單增李斯特菌Lmo2193、Lmo0159、Lmo0160、FlaA基因的丟失會導(dǎo)致其生物被膜形成能力下降[7-9]。王少輝等[10]通過構(gòu)建Lm10403sinlK基因缺失株發(fā)現(xiàn)，inlK基因的缺失會導(dǎo)致單增李斯特菌生物被膜形成能力顯著下降。生物被膜是細(xì)菌本身通過分泌的多糖、蛋白質(zhì)等代謝產(chǎn)物黏附于生物或非生物表面形成的膜樣結(jié)構(gòu)[11-12],是細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境、有利于自身生存的特有的生命活動[13]。研究發(fā)現(xiàn)，生物被膜中的黏液層、囊狀層和胞外多糖等阻礙了消毒劑和防腐劑的擴散，并起到一定阻滯作用[14]，能夠增強細(xì)菌的耐藥能力和對不良環(huán)境應(yīng)激的抵抗能力[15]，對抗普通消毒劑的能力也顯著增強[16]。張麗蓉等[17]通過研究鮑曼不動桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的游離菌及形成生物被膜的細(xì)菌對消毒劑的抗性，發(fā)現(xiàn)形成生物被膜的細(xì)菌對消毒劑抗性均比游離菌強。陳秋云[18]研究發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌以生物被膜形式生長比以游離菌形式生長對消毒劑的耐藥性有明顯的提高。多年來經(jīng)典細(xì)菌學(xué)主要研究的是浮游生長的細(xì)菌，而生物被膜作為細(xì)菌等微生物存在的主要形式鮮見報道[19]。因此，本試驗通過構(gòu)建單增李斯特菌的inlK基因缺失株，研究其生物被膜形成能力改變對不同消毒劑的抗性的影響，以期為生產(chǎn)中有效防控單增李斯特菌污染提供科學(xué)建議。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 單增李斯特菌Lm90SB2從新疆某羊場患李斯特菌病綿羊的腦組織中分離,為4b型血清型；pKSV7溫敏性穿梭質(zhì)粒由浙江大學(xué)動物科技學(xué)院饋贈。

1.1.2 主要試劑 腦心浸液培養(yǎng)基BHI購自青島高科技園海博生物技術(shù)有限司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；pMD19-T(Simple)載體、穿梭載體pKSV7、限制性內(nèi)切酶(BamHⅠ和EcoRⅠ)、T4 DNA連接酶、2×PCR Mix、DL2000 DNA Marker及DL5000 DNA Marker均購自TaKaRa公司；氯霉素購自Promega公司；84消毒液(次氯酸鈉含量50 g/L)購自烏市天一靈河消毒洗滌制品有限公司；新潔爾滅(苯扎溴銨含量27～33 g/L)購自山東利爾康醫(yī)療科技股份有限公司；結(jié)晶紫購自天津永晟精細(xì)化工有限公司；硫代硫酸鈉、吐溫80均購自天津市鑫鉑特化工有限公司；卵磷脂購自上?？曝S實業(yè)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計及合成 參考GenBank上公布的F2365菌株inlK基因序列(登錄號：AE017262.2)，運用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計用于擴增inlK基因的上、下游同源臂及驗證缺失株的特異性引物，引物信息見表1。引物均由北京華大基因公司合成。

表1 引物信息

1.2.2 菌液的制備 將-80 ℃凍存的標(biāo)準(zhǔn)菌株Lm90SB2在BHI固體培養(yǎng)基四區(qū)劃線過夜培養(yǎng)后挑選單個菌落，于50 mL BHI液體培養(yǎng)基中37 ℃過夜培養(yǎng)，用于后續(xù)試驗。

1.2.3 基因缺失株的構(gòu)建及鑒定 通過同源重組技術(shù)構(gòu)建inlK基因缺失株。利用PCR以Lm90SB2菌株DNA為模板，用PF1/PR1和PF2/PR2分別擴增inlK基因上、下游同源臂，并回收PCR產(chǎn)物。經(jīng)SOE-PCR融合上、下游同源臂純化產(chǎn)物，將融合產(chǎn)物與pMD19-T載體連接，命名為pMD19-T-ΔinlK，通過大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞克隆后進(jìn)行測序。提取測序正確的質(zhì)粒經(jīng)過雙酶切后與穿梭載體pKSV7連接，得到重組穿梭質(zhì)粒pKSV7-ΔinlK，然后通過電轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入到Lm90SB2菌株中，在42 ℃條件下和氯霉素抗性(10 μg/mL)的雙重壓力下進(jìn)行同源重組傳代。在無抗性壓力條件下傳數(shù)十代使載體質(zhì)粒丟失，通過引物PK1/PK2進(jìn)行PCR鑒定后，得到穩(wěn)定遺傳的基因缺失株命名為Lm90SB2ΔinlK。

1.2.4inlK基因缺失對Lm90SB2菌株生物被膜形成能力的影響 將-80 ℃凍存的Lm90SB2菌株和inlK缺失株在BHI固體培養(yǎng)基四區(qū)劃線過夜培養(yǎng)后挑選單個菌落于20 mL BHI液體培養(yǎng)基中，37 ℃過夜培養(yǎng)后將Lm90SB2菌株和inlK基因缺失株的菌液以1∶100的體積接種于新鮮的BHI液體培養(yǎng)基中，待D600 nm值≈0.2時制成菌懸液，各取200 μL菌液分別加入到96孔微孔板中，37 ℃恒溫箱靜置培養(yǎng)8、12、24、48 h，每個時間點8個重復(fù)；通過結(jié)晶紫染色法染色后在倒置顯微鏡下觀察其生物被膜形態(tài)，然后每個孔添加200 μL 95%乙醇脫色45 min，于酶標(biāo)儀中測定D600 nm值。

1.2.5 中和劑的篩選 將Lm90SB2菌株及inlK基因缺失株的單個菌落接種于10 mL新鮮配制BHI液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃搖床中過夜培養(yǎng)16 h，用PBS將菌濃度調(diào)到108CFU/mL，制成菌懸液備用。 取胰蛋白胨1.0 g、氯化鈉8.5 g，用900 mL蒸餾水溶解，并調(diào)節(jié)pH在7.0～7.2，用蒸餾水加至1 L，分裝后經(jīng)121 ℃高壓滅菌制成稀釋液。 參考吳伯梅[20]、董錕等[21]的方法略有修改，以含3 g/L卵磷脂+3 g/L吐溫80的PBS溶液和10 g/L卵磷脂+20 g/L吐溫80的PBS溶液為新潔爾滅消毒劑(苯扎溴銨含量2 g/L)的中和劑，含5 g/L硫代硫酸鈉+5 g/L卵磷脂+20 g/L吐溫80的PBS溶液和10 g/L硫代硫酸鈉+30 g/L卵磷脂+20 g/L吐溫80的PBS溶液為84消毒劑(有效氯含量1 g/L)的中和劑。參照《消毒技術(shù)規(guī)范》[22]，采取懸液定量試驗方法進(jìn)行試驗，設(shè)消毒劑+菌懸液、消毒劑+菌懸液+中和劑、中和劑+菌懸液、消毒劑+中和劑+菌懸液、稀釋液+菌懸液(陽性對照)、稀釋液+中和劑+培養(yǎng)基(陰性對照)6個試驗組，分別記為A、B、C、D、E、F組,試驗在20 ℃水浴恒溫條件下進(jìn)行。評判標(biāo)準(zhǔn)：A組無菌生長，或有極少數(shù)菌落生長；B組有較A組多，但較C、D、E組的菌落少；其中C、D、E組有較為相似的菌落生長，且各組間菌落數(shù)誤差率不超過15%；F組無菌生長。重復(fù)3次試驗均符合要求時,則所選中和劑適宜有效。其中C、D、E組間菌落數(shù)誤差率計算公式如下：

組間菌落數(shù)誤差率(%)=

1.2.6 不同消毒劑對單增李斯特菌的滅菌率測定 將過夜培養(yǎng)的inlK基因缺失株及Lm90SB2菌株菌液分別接種于新配制的BHI液體培養(yǎng)基中，待D600 nm值=0.2時制成菌懸液，分別取1 mL加入放置有NC膜的24孔聚苯乙烯微孔板中，37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)，于48 h后無菌取出，加5 mL PBS輕輕晃動，去除懸浮和黏附不牢固的細(xì)菌，每張NC膜分別放入5 mL濃度為1∶15及1∶30的新潔爾滅消毒劑和濃度為1∶50及1∶100的84消毒劑中，空白對照組中加入5 mL 1×PBS。 作用1、5、10、20 min后，取出NC膜移入裝有5 mL相應(yīng)中和劑的試管內(nèi)，中和10 min。將膜完全粉碎釋放其中的細(xì)菌，用PBS 10倍稀釋后，取1 mL上述液體接種于BHI固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)后計算菌落數(shù)，與空白對照組比較計算滅菌率。每組重復(fù)3次，取平均值。

實際菌落數(shù)(CFU/mL)=平板菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)

滅菌率(%)=(A-B)/A×100%

式中，A，滅菌前平均菌落數(shù)即對照組菌落數(shù)；B，滅菌后平均菌落數(shù)，即不同消毒劑與親本株和缺失株作用不同時間的菌落數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，組間差異采用t檢驗。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。 采用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié) 果

2.1 基因缺失株的鑒定

以PK1/PK2為引物進(jìn)行菌液PCR檢測，結(jié)果顯示，inlK基因缺失株擴增出大小為1 313 bp的單一條帶，Lm90SB2親本株擴增出大小為3 140 bp的單一條帶(圖1)，表明inlK基因完全缺失，成功構(gòu)建穩(wěn)定遺傳的inlK基因缺失株，命名為Lm90SB2ΔinlK。

2.2 inlK基因缺失對Lm90SB2菌株生物被膜形成能力的影響

由圖2可知，Lm90SB2ΔinlK株在8 h時開始形成生物被膜；在12、24 h網(wǎng)格結(jié)構(gòu)逐漸明顯致密，48 h形成高度致密的生物被膜。在生物被膜生成過程中Lm90SB2ΔinlK株生物被膜網(wǎng)格結(jié)構(gòu)在致密程度較Lm90SB2菌株低下，形成時間上較Lm90SB2菌株晚。由圖3可知，在8、12、24 h時，與Lm90SB2親本株相比,Lm90SB2ΔinlK株生物被膜形成量顯著下降(P<0.05)，48 h時生物被膜形成量極顯著下降(P<0.01)。

M，DL5000 DNA Marker；1，Lm90SB2ΔinlK株；2，Lm90SB2親本株M,DL5000 DNA Marker;1,Lm90SB2ΔinlK strain;2,Lm90SB2 parental strain圖1 Lm90SB2ΔinlK株及親本株P(guān)CR鑒定Fig.1 PCR identification of Lm90SB2ΔinlK strain and parental strain

圖2 菌株生物被膜形態(tài)學(xué)觀察(200×)Fig.2 Morphological observation of biofilm of strains (200×)

*，差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01)*,Significant difference (P<0.05)；**，Extremely significant difference (P<0.01)圖3 菌株生物被膜形成能力測定結(jié)果Fig.3 Determination results of biofilm formation ability of strains

2.3 中和劑篩選結(jié)果

由表2結(jié)果可知，含有10 g/L卵磷脂+20 g/L吐溫80的PBS溶液作為新潔爾滅消毒劑的中和劑和含10 g/L硫代硫酸鈉+30 g/L卵磷脂+20 g/L吐溫80的PBS溶液作為84消毒劑的中和劑其誤差率均>15%，不符合中和劑篩選標(biāo)準(zhǔn)。含3 g/L卵磷脂+3 g/L吐溫80的PBS溶液作為新潔爾滅的中和劑和含5 g/L硫代硫酸鈉+5 g/L卵磷脂+20 g/L吐溫80的PBS溶液作為84消毒劑的中和劑其誤差率均<15%，符合中和劑篩選標(biāo)準(zhǔn)。因此，后續(xù)試驗用含3 g/L卵磷脂+3 g/L吐溫80的PBS溶液構(gòu)成的中和劑可有效中和本試驗中使用的新潔爾滅消毒液，用5 g/L硫代硫酸鈉+5 g/L卵磷脂+20 g/L吐溫80的PBS溶液可有效中和本試驗中適用的84消毒劑。

表2 中和劑篩選結(jié)果

2.4 不同消毒劑對單增李斯特菌的滅菌率

由表3可知，與Lm90SB2親本株相比，在新潔爾滅濃度為1∶15時，作用1、5 min對Lm90SB2ΔinlK株滅菌率均極顯著增加(P<0.01)，作用10 min時顯著增加(P<0.05)；在新潔爾滅濃度為1∶30時，作用1、5、10 min時對Lm90SB2ΔinlK株滅菌率均極顯著增加(P<0.01)。由表4可知，與Lm90SB2親本株相比，在84消毒劑濃度為1∶50時，作用1、5 min對Lm90SB2ΔinlK株滅菌率均極顯著增加(P<0.01)；在84消毒劑濃度為1∶100時，作用1、5、10 min對Lm90SB2ΔinlK株滅菌率均極顯著增加(P<0.01)。作用20 min時，2種消毒劑在不同濃度下對2株菌的滅菌率均為100%，無顯著差異(P>0.05)。

表3 不同濃度新潔爾滅對單增李斯特菌的滅菌率

續(xù)表

表4 不同濃度84消毒劑對單增李斯特菌的滅菌率

3 討 論

單增李斯特菌是自然界中廣泛存在的食源性致病菌，生物被膜的形成是其廣泛存在于環(huán)境中且對消毒劑產(chǎn)生耐藥的原因之一。生物被膜作為細(xì)菌的保護(hù)機制，能夠幫助細(xì)菌逃避機體免疫系統(tǒng)的清除和藥物的殺滅。消毒劑消毒法常作為清除生物被膜的主要方式，其中84消毒劑的主要成分為次氯酸鈉，作為食品環(huán)境中常用的消毒劑其主要作用機理為次氯酸鈉能與質(zhì)粒DNA直接反應(yīng)導(dǎo)致雙鏈斷裂，侵入細(xì)胞內(nèi)部與蛋白質(zhì)發(fā)生氧化作用導(dǎo)致細(xì)菌死亡[23-24]。新潔爾滅的主要成分為苯扎溴銨，通過其分子結(jié)構(gòu)中的疏水基團(tuán)滲入細(xì)菌胞漿膜和蛋白質(zhì)層，使細(xì)菌的通透性發(fā)生使菌體破裂,蛋白質(zhì)變性,從而起殺菌效果[25]。徐冬旸等[26]研究發(fā)現(xiàn)，常規(guī)濃度的84消毒劑可抑制李斯特菌的生長，而Lee等[27]研究發(fā)現(xiàn),游離氯能夠使外部生物膜失活，而對于內(nèi)部生物被膜不受游離氯的影響，游離氯不能完全滲透生物膜。目前大部分研究圍繞消毒劑對浮游菌與生物被膜的殺菌效果，本研究通過構(gòu)建Lm90SB2ΔinlK株，研究其生物被膜形成能力的改變對抵抗消毒劑能力的影響。

生物被膜形成能力測定結(jié)果顯示，inlK基因缺失后會導(dǎo)致菌株生物被膜形成能力明顯下降，inlK基因位于單增李斯特菌細(xì)胞膜外，這可能與細(xì)菌胞外蛋白或組織表面的物質(zhì)發(fā)生相互作用，有利于單增李斯特菌黏附在物體表面促進(jìn)生物被膜的形成。這與王少輝等[10]構(gòu)建Lm10403sinlK基因缺失株測定生物被膜形成能力結(jié)果一致，表明inlK基因?qū)卧隼钏固鼐锉荒ば纬删哂兄匾饔?。生物被膜由于具有特殊的多層立體結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致抗微生物藥或消毒劑到達(dá)內(nèi)層細(xì)菌時的濃度較低且滲透時間較長，耐藥性相比較浮游細(xì)菌明顯增強，使得常規(guī)的方法無法做到有效殺菌或抑菌[28]。Saitou等[29]研究發(fā)現(xiàn)，用不同的消毒劑處理生物被膜狀態(tài)和游離狀態(tài)下的銅綠假單胞菌時，形成生物被膜時的殺滅率明顯低于游離狀態(tài)，與本試驗不同濃度的消毒劑對生物被膜的殺滅率結(jié)果一致，表明生物被膜對消毒劑等外界因素有較強的抵抗作用，而生物被膜量的減少會導(dǎo)致細(xì)菌消毒劑抗力下降，這可能是由于生物被膜致密的空間結(jié)構(gòu)使其對外界環(huán)境的變化極不敏感，生物被膜越厚空間結(jié)構(gòu)越致密，對殺菌劑等外界因素的抗力越強。

4 結(jié) 論

本研究利用同源重組技術(shù)成功構(gòu)建了Lm90SB2ΔinlK株，inlK基因的缺失會導(dǎo)致菌株生物被膜形成能力及消毒劑抗力顯著下降，結(jié)果可為單增李斯特菌在環(huán)境污染防控及食品安全上提供參考依據(jù)。