李佩岐，康 杰，2，王珂瑤，王慧敏，韓宇峰，王婷慧，崔 亮，張 劍，鄧瑞強(qiáng)，段智變

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，太谷 030801；2.山西醫(yī)科大學(xué)汾陽(yáng)學(xué)院,汾陽(yáng) 032200)

腹水嚴(yán)重危害人與動(dòng)物的健康。肉雞腹水綜合征(ascites syndrome，AS)是一種由遺傳、缺氧[1]、環(huán)境[2]等多因素導(dǎo)致的營(yíng)養(yǎng)代謝病，多發(fā)于4～7周齡快速生長(zhǎng)的肉雞，AS肉雞剖檢可見(jiàn)肝臟腫大或皺縮，表面凹凸不平，多呈暗紅色或棕黃色。中國(guó)AS的發(fā)病率約為7%，死亡率為1%～30%，給養(yǎng)雞業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]，目前，還沒(méi)有相關(guān)特效藥物。研究表明，中草藥可以通過(guò)不同的途徑降低AS發(fā)病率和死亡率[4]。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是目前已知的與肝纖維化形成關(guān)系最為密切的細(xì)胞因子，通過(guò)自分泌、旁分泌等方式影響肝細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞等分泌纖維化相關(guān)因子，誘導(dǎo)持續(xù)性致纖維化作用。TGF-β1通過(guò)與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體Ⅰ(transforming growth factor β receptor Ⅰ，TβRⅠ)結(jié)合促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)在肝臟大量沉積。Smads是目前已知的胞內(nèi)TβRⅠ的作用底物，不同類(lèi)型Smad之間相互協(xié)調(diào)，共同調(diào)節(jié)TGF-β1的生物學(xué)效應(yīng)[5]。目前AS發(fā)病機(jī)制研究多聚焦于缺氧和肺動(dòng)脈高壓[6-7]，研究顯示，肉雞肝臟損傷也參與AS形成[8]，但有關(guān)TGF-β1/Smad通路對(duì)AS肝纖維化的影響鮮見(jiàn)報(bào)道。本課題組前期研究表明，由黃芪、當(dāng)歸、丹參、茯苓等組成的復(fù)方中藥水提物能調(diào)節(jié)AS肉雞肝損傷，通過(guò)調(diào)控肝臟α-SMA、Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白可有效防治AS[9]。本研究采用模擬疾病因素多樣性的多因素AS模型[10]，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察，檢測(cè)TGF-β1、TβRⅠ和下游效應(yīng)因子Smad2、Smad3、Smad7基因及蛋白表達(dá)，研究TGF-β1/Smad通路在AS肝纖維化中的作用及復(fù)方中藥水提物對(duì)AS的防治效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 復(fù)方中藥水提物的制備 將黃芪、當(dāng)歸、丹參、茯苓以3∶2∶2∶2的比例組方(藥材購(gòu)自山西省太谷縣某藥材公司)，采用水煎法，減壓蒸餾濃縮得到1 g/mL的湯劑。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 選取258只1日齡健康Ross肉雞，基礎(chǔ)飼糧常規(guī)飼養(yǎng)至7日齡，肉雞和飼料均購(gòu)自山西省文水縣大象禽業(yè)有限公司。

1.1.3 主要試劑 Trizol?Reagent試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司；SYBR Prime ScripTMRT Reagent Kit、SYBR?Premix ExTaqTMⅡ試劑盒均購(gòu)自TaKaRa公司；雞TGFβ1 ELISA 試劑盒、雞TGFβR1 ELISA試劑盒均購(gòu)自上海藍(lán)基生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組、造模及給藥 258只7日齡健康Ross肉雞隨機(jī)分為5組：空白組(C)；模型組(M)；復(fù)方中藥水提物高、中、低劑量組(T1、T2、T3)。除正常組外，其余肉雞采用多因素法造模，即從8日齡開(kāi)始低溫環(huán)境(9～11 ℃)飼養(yǎng)、基礎(chǔ)飼糧中添加高脂(3%豬油)和高蛋白(4%魚(yú)粉)、高鈉(0.12% Na+)飲水，各劑量組每天分別在飲水中給予2.0、1.0、0.5 g/kg復(fù)方中藥水提物。試驗(yàn)期持續(xù)至45日齡。試驗(yàn)分組、藥物劑量及飼養(yǎng)方式具體見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)分組、藥物劑量及飼養(yǎng)方式

1.2.2 樣本采集 記錄15、25、35、45日齡肉雞體重，于35日齡每組隨機(jī)選取10只肉雞，取肝臟左葉1 cm3，固定于4%多聚甲醛，用于肝臟組織病理切片觀察。 在15、25、35、45日齡取肝臟組織樣品，一部分置于液氮，后轉(zhuǎn)-80 ℃保存，用于測(cè)定TGF-β1、TβRⅠ、Smad2、Smad3、Smad7基因mRNA相對(duì)表達(dá)量；另一部分放入消毒后的EP管中，-20 ℃保存，用于測(cè)定TGF-β1、TβRⅠ蛋白含量。

1.2.3 臨床癥狀和剖檢變化 每天觀察并記錄試驗(yàn)雞精神狀態(tài)、活動(dòng)、采食情況，每次剖殺觀察腹水、各臟器剖檢變化。

1.2.4 肝臟組織病理學(xué)觀察 石蠟包埋，常規(guī)切片5 μm，HE染色觀察肝臟組織結(jié)構(gòu)變化，Masson染色觀察肝臟組織膠原纖維沉積變化。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 取0.05 g肝臟至2 mL無(wú)菌EP管中，勻漿后按Trizol法提取總RNA，用核酸蛋白分析儀測(cè)定總RNA濃度，并以D260 nm/D280 nm值評(píng)價(jià)其純度后用100 μL DEPC水溶解，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。參考GenBank中已發(fā)表雞基因序列設(shè)計(jì)引物，以β-actin作為內(nèi)參基因，引物信息見(jiàn)表2。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系20 μL：上、下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，cDNA 2.0 μL，Mix 10.4 μL，RNase-free ddH2O 6.0 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，退火(退火溫度見(jiàn)表2)30 s，72 ℃延伸30 s，共45個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 ELISA法檢測(cè)蛋白含量 取肝臟組織于冰冷生理鹽水中緩慢沖洗，洗凈吸水后稱(chēng)重，按1∶9(W/V)加入生理鹽水，勻漿后3 000 r/min離心20 min，取上清液。稀釋(稀釋液∶樣品=4∶1)混勻備用。將所有試劑預(yù)溫至20 ℃，ELISA法測(cè)定D450 nm值，ELISA Cale軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，求出擬合公式，計(jì)算TGF-β1、TβRⅠ蛋白含量。

表2 引物序列信息

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，并用LSD法進(jìn)行多重比較。結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示差異顯著;P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 臨床癥狀和剖檢變化

模型組肉雞表現(xiàn)出較嚴(yán)重的臨床癥狀，發(fā)病初期肉雞采食量下降，精神沉郁，被毛雜亂，喜臥不喜站。癥狀嚴(yán)重時(shí)，可見(jiàn)肉雞腹部皮膚發(fā)紺、變薄，腹部膨大、觸壓有波動(dòng)感，拒絕站立，以腹部著地。剖檢可見(jiàn)腹腔內(nèi)有大量淡黃色液體；肝臟質(zhì)脆，邊緣鈍圓，表面有瘀血點(diǎn)；心臟有心包積液，心室壁肥厚；肺臟充血水腫，切面流出帶泡沫的液體；腎臟腫大；腸表面有瘀血點(diǎn)。 飼喂復(fù)方中藥水提物可使癥狀減輕。

2.2 復(fù)方中藥水提物對(duì)AS肉雞體重的影響

由表3可知，與空白組相比，各日齡模型組肉雞體重極顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，各劑量組肉雞體重均有不同程度上升且有劑量依賴(lài)性，其中各日齡高、中劑量組與15日齡低劑量組肉雞體重均極顯著上升(P<0.01)，35日齡低劑量組肉雞體重顯著上升(P<0.05)。

表3 復(fù)方中藥水提物對(duì)AS肉雞體重的影響

2.3 復(fù)方中藥水提物對(duì)AS肉雞肝臟組織病理學(xué)的影響

2.3.1 HE染色 肝臟組織HE染色后光鏡下觀察可見(jiàn)，空白組肉雞肝臟組織結(jié)構(gòu)基本完整，肝細(xì)胞大小均勻，間隙基本清晰，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組肉雞肝臟組織失去正常結(jié)構(gòu)，肝細(xì)胞腫大變性，細(xì)胞排列紊亂，部分細(xì)胞破碎，肝小葉界限模糊，部分形成假小葉，細(xì)胞間隙可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；與模型組相比，復(fù)方中藥水提物組的肉雞肝臟組織整體病變程度減輕(圖1)。

2.3.2 Masson染色 肝臟組織Masson染色后光鏡下觀察可見(jiàn)，空白組肉雞肝臟組織結(jié)構(gòu)基本完整，大小均勻，未見(jiàn)明顯藍(lán)色纖維分布，僅有少量纖維位于中央靜脈周?chē)?；模型組可見(jiàn)肝臟組織結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，肝索排列紊亂，可見(jiàn)大量纖維條索分布；與模型組相比，復(fù)方中藥水提物組可見(jiàn)部分肝索排列較為正常，纖維分布減少，整體病變有所改善(圖2)。

①C,空白組；M，模型組；T1,高劑量組；T2,中劑量組；T3，低劑量組。下同。②→表示炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)①C,Control group;M,Model group;T1,High dose group;T2,Medium dose group;T3,Low dose group.The same as below.②→ indicates inflammatory infiltration圖1 35日齡肉雞肝臟組織HE染色(400×)Fig.1 HE staining of liver sections in broilers at 35 days of age (400×)

→表示纖維沉積→ indicates fiber deposition圖2 35日齡肉雞肝臟組織Masson染色(400×)Fig.2 Masson staining of liver sections in broilers at 35 days of age (400×)

2.4 復(fù)方中藥水提物對(duì)AS肉雞肝臟TGF-β1和TβRⅠ基因mRNA相對(duì)表達(dá)量和蛋白含量的影響

由圖3可知，各日齡模型組肉雞肝臟TGF-β1、TβRⅠ基因mRNA相對(duì)表達(dá)量均極顯著高于空白組(P<0.01)。與模型組相比，復(fù)方中藥水提物各劑量組肉雞肝臟TGF-β1、TβRⅠ基因mRNA相對(duì)表達(dá)量均降低，其中各日齡高、中劑量組肉雞肝臟TGF-β1、TβRⅠ基因，15、45日齡低劑量組肉雞肝臟TGF-β1基因，以及25、35、45日齡低劑量組肉雞肝臟TβRⅠ基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量均極顯著降低(P<0.01)，35日齡低劑量組肉雞肝臟TGF-β1基因mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，且3個(gè)劑量組間高劑量組降低效果最顯著。

各日齡模型組肉雞肝臟TGF-β1蛋白含量和25、45日齡模型組肉雞肝臟TβRⅠ蛋白含量均極顯著高于空白組(P<0.01)，35日齡模型組肉雞肝臟TβRⅠ蛋白含量顯著高于空白組(P<0.05)。與模型組相比，復(fù)方中藥水提物各劑量組肉雞肝臟TGF-β1、TβRⅠ蛋白含量均降低，其中各日齡高劑量組肉雞肝臟TGF-β1、TβRⅠ蛋白含量，15、35日齡中、低劑量組肉雞肝臟TGF-β1蛋白含量，25、35、45日齡中劑量組及25日齡低劑量組肉雞肝臟TβRⅠ蛋白含量均極顯著降低(P<0.01)，25日齡中劑量組TGF-β1蛋白含量和15日齡中劑量組肉雞肝臟TβRⅠ蛋白含量均顯著降低(P<0.05)，且3個(gè)劑量組間高劑量組降低效果最顯著。

肩標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標(biāo)不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著(P<0.01)；肩標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同Values with different small letter superscripts mean significant different (P<0.05)；And with different capital letter superscripts mean extremely significant different (P<0.01)；While with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05).The same as below圖3 復(fù)方中藥水提物對(duì)AS肉雞肝臟TGF-β1和TβRⅠ基因mRNA相對(duì)表達(dá)量(A、B)和蛋白含量(C、D)的影響Fig.3 Effects of compound traditional Chinese medicine water extract on the relative expression of TGF-β1 and TβRⅠ genes mRNA (A and B) and protein content (C and D) in liver of AS in broilers

2.5 復(fù)方中藥水提物對(duì)AS肉雞肝臟Smad2、Smad3、Smad7 mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

由圖4可知，各日齡模型組肉雞肝臟Smad2、Smad3基因mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著高于空白組，Smad7基因mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著低于空白組(P<0.01)。與模型組相比，各日齡各劑量組肉雞肝臟Smad2基因mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)；各日齡高劑量組及15、35、45日齡中劑量組肉雞肝臟Smad3基因mRNA相對(duì)表達(dá)量均極顯著降低(P<0.01)，25日齡中劑量組和35、45日齡低劑量組肉雞肝臟Smad3基因mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著降低(P<0.05)；各日齡高劑量組，15、25、35日齡中劑量組，15、35日齡低劑量組肉雞肝臟Smad7基因mRNA相對(duì)表達(dá)量均極顯著升高(P<0.01)，且3個(gè)劑量組間高劑量組作用效果最顯著。

圖4 復(fù)方中藥水提物對(duì)AS肉雞肝臟Smad2(A)、Smad3(B)、Smad7(C)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.4 Effects of compound traditional Chinese medicine water extract on the relative expression of Smad2 (A),Smad3 (B) and Smad7 (C) genes mRNA in liver of AS in broilers

3 討 論

研究表明，AS肉雞肝臟表現(xiàn)嚴(yán)重病理?yè)p傷[11]。本試驗(yàn)用多因素法制作AS模型，臨床癥狀及剖檢變化與郭宇榮等[10]研究結(jié)果一致，并表現(xiàn)出肝臟結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞腫大變性，有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肝小葉界限模糊，部分形成假小葉，有大量膠原纖維沉積，結(jié)果表明，肉雞AS造模成功，肝臟發(fā)生了纖維化病理?yè)p傷。

肝纖維化的發(fā)生參與并導(dǎo)致腹水形成[12]。TGF-β1是肝纖維化最重要的始動(dòng)因子，通過(guò)經(jīng)典的TGF-β1/Smad通路產(chǎn)生纖維化效應(yīng)[5]。肝臟受到損傷時(shí)，TGF-β1大量激活和釋放，與靶細(xì)胞表面的TGF-β1受體結(jié)合，使TβRⅠ活化，活化的TβRⅠ激活下游Smad信號(hào)[13]。其中，Smad2和Smad3磷酸化能增加成纖維蛋白的表達(dá)，促進(jìn)膠原沉積，加快肝纖維化的進(jìn)程[14]；Smad7作為典型的抑制蛋白，通過(guò)與Smad2、Smad3競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合，阻斷Smad2和Smad3磷酸化，或可通過(guò)增強(qiáng)TGFβ-R的降解作用從而阻斷TGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，減輕肝纖維化[15]。研究表明，降低TGF-β1水平或抑制Smad2、Smad3表達(dá)[16]，阻斷TGF-β1/Smad信號(hào)通路[17]，可以減輕纖維化的發(fā)生發(fā)展。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AS模型組肉雞肝臟TGF-β1、TβRⅠ、Smad2和Smad3表達(dá)量均顯著升高，Smad7表達(dá)量顯著降低，表明在AS發(fā)病過(guò)程中，TGF-β1/Smad通路被激活，導(dǎo)致肝纖維化發(fā)生并參與AS形成及發(fā)展。

本試驗(yàn)所用復(fù)方中藥針對(duì)AS證候特點(diǎn)而配伍組方，其中，黃芪益氣健中，當(dāng)歸活血平肝，丹參活血化瘀，茯苓健脾滲濕，甘草補(bǔ)中調(diào)和，配方具有補(bǔ)益氣血、行氣活血與祛濕利水的協(xié)同作用。研究表明，黃芪總苷可通過(guò)抑制一氧化氮和細(xì)胞因子的釋放來(lái)抑制炎癥[18]，并通過(guò)調(diào)節(jié)肝臟功能指標(biāo)和Smad2、Smad3水平改善纖維化程度[19]；黃芪總黃酮能減少肝臟損傷和炎癥因子的產(chǎn)生[20]，通過(guò)抑制TGF-β1/Smad通路來(lái)抑制大鼠肝纖維化[21]；黃芪多糖能通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad通路，使Smad7表達(dá)升高，TGF-β1和Smad3表達(dá)降低，修復(fù)受損的肝臟組織基底膜樣細(xì)胞間質(zhì)，抑制肝纖維化[22]。當(dāng)歸有效成分阿魏酸能顯著降低TGF-β1誘導(dǎo)的Ⅰ型膠原和磷酸化Smad2、Smad3的增加[23]，促進(jìn)MMP-2、MMP-9表達(dá)，減少肝細(xì)胞凋亡并促進(jìn)肝細(xì)胞增殖，減輕肝纖維化[24]；甲基阿魏酸可有效改善四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)肝纖維化大鼠的肝臟氧化應(yīng)激損傷，減少細(xì)胞外基質(zhì)的積聚，減輕肝纖維化程度[25]。丹參有效成分丹酚酸B能夠減少肝臟膠原纖維沉積，降低CCl4誘導(dǎo)產(chǎn)生的TGF-β1含量[26]，明顯促進(jìn)體內(nèi)外肝纖維化細(xì)胞凋亡[27]；二氫丹參酮Ⅰ能夠通過(guò)調(diào)節(jié)失衡的谷胱甘肽代謝、氨基酸代謝、脂質(zhì)代謝、三羧酸循環(huán)等途徑發(fā)揮預(yù)防和治療肝纖維化的作用[28]。茯苓多糖通過(guò)調(diào)控代謝酶表達(dá)和抑制TLR4/NF-κB炎癥信號(hào)通路，可減輕氧化應(yīng)激和炎癥損傷，從而減輕小鼠酒精性肝損傷[29]；羧甲基茯苓多糖對(duì)肝纖維化大鼠模型肝細(xì)胞TGF-β表達(dá)具有明顯抑制作用，能下調(diào)Smad3的表達(dá)，上調(diào)Smad7的表達(dá)，對(duì)TGF-β/Smad通路具有較好的調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而減緩肝纖維化進(jìn)程[30]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)方中藥水提物可以有效防治AS，其中，與復(fù)方中藥水提物中、低劑量組相比，高劑量組可較早且較顯著影響TGF-β/Smad通路。復(fù)方中藥水提物可以減少肉雞肝臟膠原纖維沉積，降低TGF-β1和TβRⅠ的表達(dá)，調(diào)節(jié)Smad2、Smad3和Smad7的表達(dá)，調(diào)控TGF-β1/Smad通路，抑制纖維化，從而有效防治AS，其機(jī)制與復(fù)方中藥的有效配伍及各味中藥有效成分功能密切相關(guān)。

4 結(jié) 論

肝纖維化參與了肉雞AS的發(fā)生發(fā)展，機(jī)制與TGF-β1/Smad通路相關(guān)；由黃芪、當(dāng)歸、丹參、茯苓等制成的復(fù)方中藥水提物可以調(diào)控TGF-β1/Smad通路，抑制肝纖維化的發(fā)生，有效防治肉雞AS，其中高劑量組(2.0 g/kg)作用效果最為顯著。