孫 艷，馮曉微，劉佳瑋，劉 蓓，靳天雄，馮鳴鵲，劉明超

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，保定 071001)

奶牛子宮內(nèi)膜炎是常發(fā)的奶牛產(chǎn)后疾病，根據(jù)臨床表現(xiàn)可分為臨床型子宮內(nèi)膜炎和亞臨床型子宮內(nèi)膜炎[1]。病原微生物感染是引發(fā)奶牛子宮內(nèi)膜炎的主要原因，其中以大腸桿菌(Escherichiacoli，E.coli)和化膿隱秘桿菌(Trueperellapyogenes，T.pyogenes)最常見，發(fā)病率在15%左右[2]，該病會導(dǎo)致奶牛的產(chǎn)犢間隔延長，使患病牛的生育率降低，是危害奶牛養(yǎng)殖業(yè)的主要疾病之一[3]，給養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。近年來，隨著奶牛養(yǎng)殖業(yè)的規(guī)模化，子宮內(nèi)膜炎發(fā)病率出現(xiàn)明顯的上升趨勢，該病嚴(yán)重危害了奶牛養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[4]。中國對奶牛子宮內(nèi)膜炎的治療方法主要是使用抗生素治療，長期以來抗生素類獸藥的不當(dāng)使用，不僅造成了病原菌嚴(yán)重的交叉耐藥，且可能會影響奶制品消費(fèi)群體的身體健康[5-6]。因此，找到一種可替代抗生素治療和預(yù)防奶牛子宮內(nèi)膜炎的安全高效、無殘留、無污染的綠色制劑已成為奶牛子宮內(nèi)膜炎防治研究的重要工作。研究表明，乳酸菌通常存在于人類的陰道及胃腸道中[7]，也存在于奶牛的陰道中[8]，是健康奶牛生殖道內(nèi)的常駐菌群[9]。長期食用含乳酸菌的食品可改善機(jī)體陰道中的菌群[10]，且在圍產(chǎn)期奶牛陰道內(nèi)灌注乳酸菌，能顯著提高機(jī)體的免疫反應(yīng)，降低子宮內(nèi)膜炎的發(fā)病率和子宮感染的發(fā)生率[11]。Genis等[12]研究結(jié)果表明，益生菌(鼠李糖乳桿菌、酸乳球菌和雷氏乳桿菌)組合在減少子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和組織中的炎癥及由大腸桿菌引起的感染等方面具有一定的作用，且目前使用益生菌菌株已被提議作為預(yù)防產(chǎn)后子宮感染和活體炎癥的一種替代方法。宋鵬杰等[13]從奶牛生殖道中分離出植物乳桿菌、副干酪乳桿菌和鼠李糖乳桿菌，以上3種奶牛生殖道乳酸菌培養(yǎng)的上清液對大腸桿菌、無乳鏈球菌及金黃色葡萄球菌均表現(xiàn)出良好的抑制效果。石麗穎等[14]報(bào)道，從奶牛生殖道中分離的乳酸菌、殊異腸球菌和絨毛腸球菌對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌均有良好的抑菌效果。本試驗(yàn)旨在通過分離鑒定奶牛生殖道內(nèi)的益生乳酸菌，為防治奶牛子宮內(nèi)膜炎提供綠色環(huán)保、無污染、無殘留的新型微生物制劑，同時(shí)為進(jìn)一步研究和開發(fā)用于防治奶牛子宮內(nèi)膜炎的微生態(tài)制劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所涉及樣品均采集自保定市滿城區(qū)某奶牛養(yǎng)殖場10頭產(chǎn)后25～50 d的健康奶牛。大腸桿菌O111∶K58(B4)(菌株編號：CVCC1450)和鼠李糖乳桿菌GR-1(菌株編號：ATCC 55826)均由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)營養(yǎng)與免疫實(shí)驗(yàn)室惠贈；MRS和LB培養(yǎng)基均購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司；DNA提取試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌生化鑒定管購自青島海博生物技術(shù)有限公司；慶大霉素、青霉素及四環(huán)素等12種藥敏紙片均購自杭州微生物試劑有限公司；蛋白酶K和過氧化氫酶購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 樣品采集

選擇產(chǎn)后子宮復(fù)舊良好、卵巢無異常的奶牛進(jìn)行采樣。用清水將奶牛外陰部擦洗干凈，再用0.1%的新潔爾滅溶液進(jìn)行擦洗消毒。在子宮頸口附近收集生殖道分泌物，置于無菌的50 mL離心管中(裝有20 mL滅菌MRS肉湯)，并用封口膜封閉管口，標(biāo)記牛的編號和日期。樣品采集后放于冰盒中，4 h內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離培養(yǎng)。

1.3 細(xì)菌分離培養(yǎng)與純化

將采集到的樣品置于液體培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)18～24 h，富集完成之后，取100 μL涂布于MRS平板上，37 ℃厭氧培養(yǎng)18～24 h，挑出平板上生長的單個(gè)菌落，MRS固體培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng)18～24 h。重復(fù)之前的步驟2～3次，直至分離出的菌落形態(tài)、顏色、大小一致。

1.4 形態(tài)特征觀察

挑取單個(gè)菌落進(jìn)行涂片，革蘭染色后進(jìn)行鏡檢，觀察菌體形態(tài)特征。

1.5 16S rDNA基因序列鑒定

利用DNA提取試劑盒提取分離菌株的基因組DNA，采用V3區(qū)通用引物(338F:5′-CCTACGG-GAGGCAGCAG-3′，518R：5′-ATTACCGCGGCT-GCTGG-3′)對16S rDNA V3區(qū)擴(kuò)增。 PCR反應(yīng)體系25 μL：2×TaqPCR Mix 12.5 μL，DNA模板1 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物送往生工生物工程(上海)股份有限公司測序，測序結(jié)果輸入NCBI核酸數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析。

1.6 具有抑菌活性乳酸菌菌株的篩選

將初篩菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中厭氧靜置培養(yǎng)18 h后，用牛津杯法測其抑菌活性，選擇對主要致病菌大腸桿菌抑菌活性最強(qiáng)的菌株進(jìn)行試驗(yàn)。將待測乳酸菌懸液12 000 r/min離心20 min，將牛津杯放入病原菌平板上，取240 μL乳酸菌上清液加入牛津杯中，每個(gè)菌株做3個(gè)重復(fù)，對照組添加等量的無菌蒸餾水，將平板放入恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)48 h，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑。

1.7 乳酸菌主要抑菌物質(zhì)分析

1.7.1 有機(jī)酸排除試驗(yàn) 為消除有機(jī)酸對抑菌能力的影響，按照1.6方法取上清，使用1 mol/L NaOH溶液將乳酸菌上清液的pH調(diào)整為7.0，以大腸桿菌作為指示菌，以未處理的乳酸菌上清液為對照，用牛津杯法測定抑菌物質(zhì)是否為有機(jī)酸。

1.7.2 細(xì)菌素排除試驗(yàn) 為消除蛋白類對抑菌能力的影響，按照1.6方法取上清，每1 mL上清液中加入1 mg/mL蛋白酶K，37 ℃水浴處理3 h，以大腸桿菌作為指示菌，以未處理的乳酸菌上清液為對照，用牛津杯法測定抑菌物質(zhì)是否含有細(xì)菌素。

1.7.3 過氧化氫排除試驗(yàn) 為消除過氧化氫對抑菌能力的影響，按照1.6方法取上清，向上清液中添加濃度為10 mg/mL過氧化氫酶溶液，37 ℃水浴處理1 h，以大腸桿菌作為指示菌，以未處理的乳酸菌上清液為對照，用牛津杯法測定抑菌物質(zhì)是否含有過氧化氫。

1.8 生長曲線繪制

取出凍存的菌液，在超凈臺中用接種環(huán)蘸取菌液放入事先配制好的已滅菌的MRS肉湯培養(yǎng)基中，活化3次，37 ℃厭氧靜置培養(yǎng)12～14 h，備用。取活化后的乳酸菌按1%比例接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中，充分混合均勻后分別吸取5 mL混合液置于13個(gè)5 mL無菌離心管中，分別培養(yǎng)0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h，測量600 nm波長下的吸光度。 選用未接種乳酸菌的MRS液體培養(yǎng)基作空白對照，選用接種鼠李糖乳桿菌的MRS液體培養(yǎng)基作陽性對照。 測定前用渦旋振蕩器搖勻，若菌液濃度太大，應(yīng)適當(dāng)稀釋之后進(jìn)行測量。 記錄數(shù)據(jù)，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，D600 nm值為縱坐標(biāo)，繪制菌株的生長曲線。

1.9 產(chǎn)酸能力曲線繪制

方法同1.8，最后使用pH計(jì)分別測定各個(gè)試管中乳酸菌菌液的pH，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，pH為縱坐標(biāo)，繪制菌株的產(chǎn)酸能力曲線。

1.10 乳酸菌藥物敏感性試驗(yàn)

在乳酸菌平板上挑取乳酸菌，接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，使用MRS培養(yǎng)基將菌液濃度調(diào)整為3×106CFU/mL，涂布在平板上，室溫放置5 min，用鑷子將抗菌藥紙片貼于平板上，37 ℃厭氧培養(yǎng)18 h，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑。

2 結(jié) 果

2.1 乳酸菌的分離培養(yǎng)與形態(tài)觀察

應(yīng)用MRS瓊脂培養(yǎng)基對10個(gè)健康奶牛生殖道分泌物樣本中存在的乳酸菌進(jìn)行分離純化，結(jié)果共分離得到13株革蘭陽性菌，分離的菌株經(jīng)純化后，菌落呈乳白色或白色，大小均一，邊緣整齊，濕潤光滑。菌體形態(tài)一般為短桿狀或球形，根據(jù)菌落形態(tài)特征以及革蘭染色結(jié)果，初步鑒定上述13株菌株為乳酸菌。將13株菌暫時(shí)命名為21、23、25、26、31、32、33、34、35、41、45、46和47號菌株。

2.2 16S rDNA序列鑒定

擴(kuò)增產(chǎn)物測序后用BLAST軟件進(jìn)行比對分析，鑒定了13株乳酸菌屬于植物乳桿菌屬和腸球菌屬。35、34、33、25、26號菌株與植物乳桿菌RCM1相似性為100%，21、23、47號菌株與植物乳桿菌LB11相似性為100%，41、46號菌株與植物乳桿菌6.1相似性為100%，45號菌株與植物乳桿菌PKL20相似性為99.38%，31號菌株與殊異腸球菌S16B相似性為100%，32號菌株與鼠腸球菌ANP1相似性為100%(表1)。

表1 13株乳酸菌測序比對結(jié)果

2.3 具有抑菌活性乳酸菌的篩選結(jié)果

以大腸桿菌作為病原菌指示菌，通過牛津杯法對分離得到的13株菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，由表2可知，13株菌對大腸桿菌都有抑菌活性，其中21、25、33、34、35號菌株的抑菌活性較強(qiáng)。

表2 13株乳酸菌對大腸桿菌的抑菌圈直徑

2.4 乳酸菌主要抑菌物質(zhì)分析

由圖1可知，將上清液pH調(diào)整到7.0時(shí)，25、34號和鼠李糖乳桿菌GR-1菌株的上清液對大腸桿菌的抗菌活性均極顯著下降(P<0.01)；33號菌株上清液對大腸桿菌的抗菌活性顯著下降(P<0.05)；21、35號菌株上清液對大腸桿菌的抗菌活性均無顯著變化(P>0.05)。表明25、33、34號和鼠李糖乳桿菌GR-1菌株的主要抗菌物質(zhì)包括有機(jī)酸。向上清液中加入蛋白酶K時(shí)，21、25、33、34號和鼠李糖乳桿菌GR-1菌株上清液對大腸桿菌的抗菌活性均極顯著下降(P<0.01)；35號菌株的上清液對大腸桿菌的抗菌活性顯著下降(P<0.05)。表明這5株菌株和鼠李糖乳桿菌GR-1的主要抗菌物質(zhì)包括肽類及蛋白類物質(zhì)。向上清液中加入過氧化氫酶時(shí)，21、33、35號和鼠李糖乳桿菌GR-1菌株上清液對大腸桿菌的抗菌活性均極顯著下降(P<0.01)；25、34號菌株的上清液對大腸桿菌的抗菌活性均顯著下降(P<0.05)。表明這5株菌株和鼠李糖乳桿菌GR-1的主要抗菌物質(zhì)包括過氧化氫。

2.5 生長曲線

由圖2可知，5株乳酸菌在培養(yǎng)6 h后開始大量繁殖，進(jìn)入對數(shù)生長期，14 h后趨于平緩，進(jìn)入生長穩(wěn)定期。35號菌株在10～12 h生長速度較慢，在12～14 h生長速度較快。21號菌株在6～10 h生長速度較慢，10～20 h生長速度較快，逐漸趨于穩(wěn)定。5株乳酸菌對數(shù)生長期時(shí)間段為6～14 h，穩(wěn)定生長期時(shí)間段為14～24 h。表明5株乳酸菌的生長性能均較好，菌體密度較高。

2.6 產(chǎn)酸能力曲線

由圖3可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，5株乳酸菌培養(yǎng)液的pH也隨之降低，至培養(yǎng)16 h后21、25、33、34、35號菌株的pH分別降到4.07、3.74、3.77、3.87、3.74，并趨于穩(wěn)定。表明5株乳酸菌均具有很強(qiáng)的產(chǎn)酸性能。

與對照相比，*，差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01)；無*，差異不顯著(P>0.05)Compared with control,*,Significant difference (P<0.05);**,Extremely significant difference (P<0.01)；No *,No significant difference (P>0.05)圖1 不同條件下乳酸菌上清液對大腸桿菌抑菌活性Fig.1 Antibacterial activity of lactic acid bacteria supernatant against Escherichia coli under different conditions

圖2 乳酸菌生長曲線Fig.2 Growth curve of lactic acid bacteria

圖3 乳酸菌產(chǎn)酸曲線Fig.3 Acid production curve of lactic acid bacteria

2.7 乳酸菌藥物敏感性試驗(yàn)

由表3可知，5株乳酸菌對氨芐西林、四環(huán)素、紅霉素等大多數(shù)抗菌藥敏感，但對環(huán)丙沙星、萬古霉素和卡那霉素完全耐藥，部分菌株對鏈霉素、利福平產(chǎn)生抗性。

表3 乳酸菌藥物敏感性

續(xù)表

3 討 論

獸醫(yī)工作者們越來越關(guān)注乳酸菌作為替抗產(chǎn)品治療奶牛疾病的新興領(lǐng)域，乳酸菌在多種病原菌引起的疾病的預(yù)防和治療中彰顯了巨大的潛力，其中就包括奶牛產(chǎn)后疾病[15-16]。乳酸菌作為奶牛生殖道內(nèi)的常駐優(yōu)勢菌群，可通過產(chǎn)生一些細(xì)菌素、酸性物質(zhì)、過氧化氫等物質(zhì)發(fā)揮益生效應(yīng)。乳酸菌通過產(chǎn)生過氧化氫增強(qiáng)其殺菌能力[17]；產(chǎn)生的酸性物質(zhì)能使生殖道內(nèi)環(huán)境的pH降低，使生殖道內(nèi)環(huán)境維持在一個(gè)較低的pH水平，抵御致病菌的入侵[18]；產(chǎn)生的細(xì)菌素類物質(zhì)可殺死在生殖道內(nèi)繁殖的致病菌，恢復(fù)機(jī)體健康。本研究采集健康奶牛生殖道分泌物，通過MRS培養(yǎng)基對其中的乳酸菌進(jìn)行分離，得到5株具有抑制大腸桿菌活性的益生乳酸菌，經(jīng)形態(tài)觀察和16S rDNA測序，確定得到的菌株均為乳酸菌，經(jīng)鑒定為植物乳桿菌和腸球菌。說明從奶牛中分離得到的乳酸菌制成微生態(tài)制劑可更好更安全地作用于奶牛相關(guān)疾病的預(yù)防和治療。

抗菌藥物敏感性是評價(jià)益生菌安全性的重要指標(biāo)之一[19-20]。本試驗(yàn)分離的大多數(shù)菌株對氨芐西林、四環(huán)素、紅霉素、利福平、甲氧芐啶、氯霉素和青霉素7種抗菌藥物高度敏感，而所有分離菌株對環(huán)丙沙星、卡那霉素和萬古霉素完全耐藥。有研究表明乳酸菌對慶大霉素、卡那霉素等氨基糖苷類抗生素可能存在天然耐藥[19]，這也與高婧等[21]、黃曉棠[22]試驗(yàn)結(jié)果一致。由于部分菌株對環(huán)丙沙星已產(chǎn)生抗性，因此在臨床上這些菌株可聯(lián)合抗菌藥共同使用，抗菌藥對耐藥性乳酸菌無毒害作用且能有效殺滅病原菌，使機(jī)體的微生態(tài)環(huán)境的優(yōu)勢菌群為乳酸菌。但耐藥基因是否會轉(zhuǎn)移至其他乳酸菌或病原菌，導(dǎo)致乳酸菌作為益生菌使用可能存在潛在危險(xiǎn)性，這仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。左瑞雨等[23]研究結(jié)果表明，乳酸菌對不同抗生素的耐藥作用還會逐步加強(qiáng)。因此，在選擇制備微生態(tài)制劑的菌株時(shí)，可盡量選擇所帶抗藥因子少的益生菌。

此外，有研究表明植物乳桿菌對于某些病原菌具有抑制作用[24]，在本研究中也獲得了一致的結(jié)果，這也與尹珺伊等[25]、薛洋洋[26]試驗(yàn)結(jié)果相一致。因此，植物乳桿菌作為益生菌制劑對于穩(wěn)定陰道環(huán)境具有良好效果[27]。雖然腸球菌更多在腸道或糞便樣品中分離得到，然而其仍是健康女性陰道微生物的重要組成部分[28]，這也說明其在抑制致病菌過程中可能也發(fā)揮一定作用。

多項(xiàng)研究結(jié)果表明，陰道內(nèi)的乳酸菌可通過黏附占位、維持菌群平衡、調(diào)節(jié)生殖道內(nèi)的pH、產(chǎn)生細(xì)菌素來抑制生殖道內(nèi)致病菌的生長繁殖從而維持生殖道健康。抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，本研究分離的13株乳酸菌中，有5株乳酸菌對大腸桿菌抑菌活性較好。進(jìn)一步通過抑菌活性試驗(yàn)分析，結(jié)果表明，21和35號菌株的抗菌物質(zhì)為過氧化氫和細(xì)菌素，而25、33、34號菌株的抗菌物質(zhì)除了過氧化氫和細(xì)菌素以外還產(chǎn)生有機(jī)酸。吳惠貞等[29]對羅伊氏乳桿菌LYS-1發(fā)酵液的抑菌特性研究結(jié)果表明，其抑菌物質(zhì)應(yīng)為多種組分，可能由小分子肽、過氧化氫和有機(jī)酸組成，與本研究結(jié)果相一致。這些產(chǎn)物能通過酸化生殖道內(nèi)微生態(tài)環(huán)境，抑制其他病原微生物的生長和繁殖，來維持生殖道微生態(tài)環(huán)境的穩(wěn)定。

從生長曲線來看，25、33、34號菌株的對數(shù)生長期為6～12 h，35號菌株的對數(shù)生長期為6～14 h，21號菌株的對數(shù)生長期為8～20 h；從產(chǎn)酸曲線來看，分離的5株菌株其pH趨于穩(wěn)定都只需16 h。這些特性保證了5株菌株進(jìn)入生殖道內(nèi)能迅速活化并大量繁殖，在生殖道內(nèi)其生長規(guī)律適合繁殖和產(chǎn)生發(fā)酵代謝產(chǎn)物，保證了其在動物生殖道內(nèi)產(chǎn)生益生作用的基礎(chǔ)。

根據(jù)上述結(jié)果可確定，益生菌能抑制大腸桿菌的繁殖，改善生殖道的菌群，但兩者之間的相關(guān)機(jī)制則還需進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)結(jié)果也表明，利用分離自牛生殖道的菌株制成微生態(tài)制劑治療牛子宮內(nèi)膜炎確實(shí)可行，為進(jìn)一步開發(fā)微生態(tài)制劑奠定了基礎(chǔ)。但這些菌株在使用中的具體作用機(jī)理還需在體內(nèi)試驗(yàn)中進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究分離得到的3株植物乳桿菌有望作為微生態(tài)制劑用于奶牛子宮內(nèi)膜炎的臨床防治。作為微生態(tài)制劑的使用效果如何，還需開展動物體內(nèi)安全性相關(guān)試驗(yàn)進(jìn)行確定。