何金明，孫智禹，劉玉玲，徐 凱，牛慶生

(吉林省養(yǎng)蜂科學研究所，吉林 132108)

新疆黑蜂是一個被列入中國《中國畜禽遺傳資源志·蜜蜂志》的本地西方蜜蜂地方品種，中心產區(qū)為阿爾泰山、天山山脈及伊犁河谷地區(qū)，是新疆地區(qū)特有的、與當?shù)貧夂颦h(huán)境及蜜源等生態(tài)條件相適應的優(yōu)良蜂種，特別適合新疆北疆淺山區(qū)丘陵地帶飼養(yǎng)，具有抗寒、抗逆、抗病、產卵力強、采集力強、節(jié)省飼料及蜂蜜純天然且含天然藥用成分等優(yōu)點[1]。近年來，隨著飼養(yǎng)方式的改變和引入蜂種的大量應用，新疆黑蜂的飼養(yǎng)范圍逐年縮小，飼養(yǎng)量也不斷減少。然而，飼養(yǎng)過程中的盲目引種導致新疆黑蜂雜化程度非常嚴重，純種新疆黑蜂數(shù)量急劇下降。2006年，新疆黑蜂被列為《國家級畜禽遺傳資源保護名錄》的瀕危物種之一，對新疆黑蜂的保護工作已迫在眉睫[2-3]。

中國西方蜜蜂(Apismellifera)遺傳資源較為豐富，既有新疆黑蜂、東北黑蜂及浙江漿蜂等地方特色品種，又有意大利蜜蜂、卡尼鄂拉蜂等引入蜂種，不同蜂種在外部形態(tài)、生產性能、抗病力及適應性等方面具有較大差異，與各蜂種在進化過程中受到的長期自然選擇和人工定向選擇密切相關。選擇作用會使生物群體在世代傳遞過程中的某些基因型個體比例發(fā)生變化，繼而在基因組上留下相應的選擇印跡，即選擇信號(selection signal)[4]。利用基因組上的選擇信號進行群體遺傳學分析有助于了解種群的進化歷史，并對研究物種的種質特性、遺傳育種等問題提供幫助。隨著基因組學和高通量測序技術的快速發(fā)展，大范圍的基因組選擇信號得以快速檢測，為畜禽種質資源的鑒定和保護利用提供了新的方法[5]。通過全基因組重測序技術檢測選擇信號以挖掘動物優(yōu)良性狀相關候選基因已被成功應用于牛[6-7]、豬[8]、雞[9]、羊[10-11]等畜禽中，并鑒定出了多個與繁殖、毛色、生長等經濟性狀相關的重要基因。動物基因組選擇信號分析的成功應用為揭示蜜蜂遺傳資源進化歷史及發(fā)掘其優(yōu)良性狀相關潛在遺傳學基礎提供了新的研究方向。當前關于新疆黑蜂的多數(shù)研究僅限于常規(guī)生產性能、繁殖性能、蜂蜜王漿品質的測定與比較，對其種質資源的鑒別僅能根據(jù)形態(tài)特征等傳統(tǒng)方法進行判斷，缺乏對其品種優(yōu)良特性及候選基因的研究，其遺傳進化關系尚不明確[12-13]。鑒于上述情形，本研究利用全基因組重測序技術對新疆黑蜂和其他引入品種進行不同蜂種間的遺傳差異檢測，分析新疆黑蜂的遺傳進化關系，并通過選擇信號分析挖掘新疆黑蜂特異性狀的相關基因，以期為制定更有效的保種措施和進一步的蜂種資源利用與開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試蜂種為來源于吉林省養(yǎng)蜂科學研究所(國家級蜜蜂基因庫)的新疆黑蜂(Xinjiang Black bee,XJB)、意大利蜜蜂(Apismelliferaligustica,ITA)、歐洲黑蜂(Apismelliferamellifera,EUR)、卡尼鄂拉蜂(Apismelliferacarnica,CAR)、高加索蜂(Apismelliferacaucasica,CAU)的核心保種群。于2020年5月15日從各蜂種中分別選取10群培育蜂王，2020年6月1日從每群中分別選取1只剛羽化出房的處女蜂王進行試驗。長白山中華蜜蜂(Apismelliferacaucasica,A.c.c)采自位于吉林省敦化市的長白山中華蜜蜂保種場，選取1只未交尾的處女蜂王作為群體遺傳分析的參考群體。收集的蜂王樣本立即投入液氮中，返回實驗室后(約4 h)立即放入-80 ℃保存，用于基因組DNA提取。

1.2 方法

1.2.1 基因組重測序數(shù)據(jù)獲取 使用天根生化科技(北京)有限公司組織基因組DNA試劑盒提取蜜蜂組織基因組DNA，構建500 bp雙末端測序文庫，利用Illumina HiSeq PE150平臺進行測序。

1.2.2 測序數(shù)據(jù)質控、過濾和處理 為了得到有效且高質量測序數(shù)據(jù)(clean reads)，需要對Illumina HiSeq PE150平臺獲得的原始測序數(shù)據(jù)(raw reads)進行嚴格過濾。過濾原則如下：①去除含有接頭序列的reads；②去除單端測序reads中含N比例>10%的paired reads；③僅保留單端測序reads中含低質量堿基數(shù)<50%的序列。將質控后的高質量數(shù)據(jù)通過BWA(參數(shù)：mem-t-k32-M-R)軟件與西方蜜蜂參考基因組(https:∥ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCF/003/254/395/GCF_003254395.2_Amel_HAv3.1/GCF_003254395.2_Amel_HAv3.1_genomic.fna.gz)進行比對，獲得比對參考基因組后的BAM文件，用SAMTOOLS對BAM文件進行排序、去除重復，并進行SNP和Indel檢測，獲得高質量的遺傳變異位點。使用ANNOVAR軟件對識別出的高質量遺傳變異進行SNP信息注釋。

1.2.3 生物信息學分析 基于全基因組重測序技術檢測出的高質量SNP，采用Mega 6.0在線軟件(http:∥www.megasoftware.net/)的鄰接法(Neighbor-Joining)構建系統(tǒng)進化樹；使用Plink 1.09在線軟件(https:∥www.cog-genomics.org/plink/1.9/)進行主成分分析(principal component analysis,PCA)；利用Admixture 3.0在線軟件(http:∥software.genetics.ucla.edu/admixture/)進行群體遺傳結構分析；應用Haploview 4.1在線軟件(http:∥www.broad.mit.edu/mpg/haploview/)進行連鎖不平衡分析。 通過Plink 1.09軟件，基于群體遺傳分化指數(shù)(Fst)和核苷酸多樣性比值(θπ)兩種方法篩選排名5%的候選選擇區(qū)域，進行選擇信號的篩選。利用David在線軟件(https:∥david.ncifcrf.gov/)對提取到的受選擇區(qū)域候選基因進行GO功能和KEGG通路富集分析。

2 結 果

2.1 新疆黑蜂基因組SNP鑒定

新疆黑蜂全基因組重測序的數(shù)據(jù)經質控后，最終鑒定出了1 728 216個SNPs，新疆黑蜂中有73 812個SNPs位點位于編碼區(qū)，占4.3%；有1 159 436個SNPs位點位于內含子區(qū)，占67%；394 942個SNPs位點位于基因間區(qū)，占22.85%。新疆黑蜂基因組中存在18 526個非同義突變位點，可引起氨基酸的改變，可作為該蜂種遺傳特性候選SNP位點。

2.2 系統(tǒng)進化樹分析

通過對新疆黑蜂、意大利蜜蜂、高加索蜂、歐洲黑蜂、卡尼鄂拉蜂的SNP進行系統(tǒng)發(fā)育關系分析，結果見圖1。由圖1可知，意大利蜜蜂先與歐洲黑蜂聚在一支，其次是卡尼鄂拉蜂、新疆黑蜂，最后是高加索蜂，與其他蜂種相比，新疆黑蜂與高加索蜂親緣關系較遠；新疆黑蜂所有個體聚為一小支，其群體血統(tǒng)單一，與其他蜂種無個體交叉現(xiàn)象。

XJB，新疆黑蜂；ITA，意大利蜜蜂；CAU，高加索蜂；EUR，歐洲黑蜂；CAR，卡尼鄂拉蜂；A.c.c，中華蜜蜂。下同XJB,Xinjiang Black bee;ITA,Apis mellifera ligustica;CAU,Apis mellifera caucasica;EUR,Apis mellifera mellifera;CAR,Apis mellifera carnica;A.c.c,Apis cerana cerana.The same as below圖1 新疆黑蜂及4個引入蜂種的系統(tǒng)進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of Xinjiang Black bee and 4 introduced bees

2.3 SNP主成分分析

對所有試驗個體使用最大的2個主成分，第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)作圖(圖2)。由圖2可知，第一主成分將高加索蜂(CAU)分開， 第二主成分將其余蜂種分成了新疆黑蜂(XJB)、意大利蜜蜂(ITA)以及歐洲黑蜂(EUR)和卡尼鄂拉蜂(CAR)聚為一簇的群體，新疆黑蜂與其他蜂種之間存在一定的差異。

圖中每一個點代表一個樣品，不同的顏色代表不同的蜂種Each point represents a sample,different colors represent different bees圖2 主成分分析結果Fig.2 Results of principal component analysis

2.4 群體遺傳結構分析

通過對5個蜂種的SNP進行群體遺傳結構分析，繪制出了Structure推疊圖(圖3)。由圖3可知，假設祖先群體亞群數(shù)K=2時，50個個體被劃分為了2個亞群體(深藍和淺藍)，高加索蜂、歐洲黑蜂、意大利蜂血統(tǒng)比較純，新疆黑蜂和卡尼鄂拉蜂的個體有2種組成成分，說明其很有可能是由2個祖先亞群雜交而來；K=3時，其他蜂種沒有明顯變化，意大利蜂分離出來；當K>3時，新疆黑蜂被完全分化出來，其所屬祖先亞群與意大利蜂、卡尼鄂拉蜂、高加索蜂、歐洲黑蜂完全不同。

2.5 連鎖不平衡分析

由圖4可知，各蜂種的衰減速度是歐洲黑蜂>卡尼鄂拉蜂>高加索蜂>新疆黑蜂>意大利蜜蜂，即意大利蜜蜂的連鎖不平衡衰減速度最小，其次是新疆黑蜂，表明在進化過程中這2個群體與其他群體相比受馴化程度較高，受選擇強度較大。

圖中分別展示了預設為2～6個群體的結構；每份樣品用一個垂直線條表示，每個垂直線條的顏色表示該樣品祖先種群的比例The figure shows the structure of the predetermined 2 to 6 groups,respectively;Each sample is respresented by a vertical line,and line color indicates ancestral population proportion圖3 群體遺傳結構分析結果Fig.3 Results of population genetic structure analysis

圖4 連鎖不平衡衰減圖Fig.4 Linkage disequilibrium patterns map

2.6 選擇信號分析

通過計算基因組的θπ和Fst值，對篩選出的前5%區(qū)域的受選擇信號進行分析，將受選擇的基因進行GO功能富集分析，結果顯示，新疆黑蜂受選擇基因主要富集在代謝、繁殖、信號轉導等生物過程，細胞組分主要富集在細胞器、核小體、染色質和膜等，分子功能主要富集在有機環(huán)狀化合物結合、離子結合等功能，其中在這些主要富集的通路中共篩選出了細胞色素P450 314A亞家族多肽1(cytochrome P450 family 314 subfamily A polypeptide 1，Cyp314A1)、毛透明蛋白(Trichohyalin-like)、卷曲螺旋結構域蛋白112(coiled-coil domain-containing protein 112，CCDC112)、山梨醇脫氫酶(Sorbitol dehydrogenase)、絲氨酸蛋白酶抑制劑3(serine protease inhibitor 3，SPI-3)、鐵蛋白(soma ferritin，F(xiàn)er3HCH)、張力蛋白1(tensin-1，TNS1)、磷酸酶與張力蛋白同源物(phosphatase and tensin-like，Pten)、腺苷琥珀酸裂解酶(adenylosuccinate lyase，ADSL)、章魚胺受體β2R(octopamine receptor beta-2R，Octβ2R)、G補綴FHA域血管生成因子1(angiogenic factor with G patch and FHA domains 1，AFFG1)、鳥嘌呤核苷酸交換因子17(rho guanine nucleotide exchange factor 17，ARHGEF17) 12個候選基因(表1)，這些基因可能與新疆黑蜂的抗寒、產卵力強、抗病等生物學特性相關，參與了機體的繁殖、生長發(fā)育及免疫等生理活動。KEGG通路富集分析結果表明，卡尼鄂拉蜂與新疆黑蜂基因組相比，新疆黑蜂受選擇基因主要富集于嘌呤代謝、胞吞作用等信號通路；高加索蜂與新疆黑蜂基因組相比，新疆黑蜂受選擇基因主要富集于胞吞作用、磷酸肌醇代謝等信號通路；歐洲黑蜂與新疆黑蜂基因組相比，新疆黑蜂受選擇基因主要富集于物質代謝等信號通路，意大利蜂與新疆黑蜂基因組相比，新疆黑蜂受選擇基因主要富集于嘌呤代謝等信號通路(圖5)。

表1 新疆黑蜂受選擇基因GO功能富集分析

A～D，分別為與卡尼鄂拉蜂、高加索蜂、歐洲黑蜂、意大利蜂相比新疆黑蜂受選擇的KEGG通路富集分析圖A-D,KEGG pathway enrichment analysis of selected genes in Xinjiang Black bees compared with Apis mellifera carnica,Apis mellifera caucasica,Apis mellifera mellifera,Apis mellifera ligustica圖5 新疆黑蜂受選擇基因KEGG通路富集分析Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis of selected genes in Xinjiang Black bee

3 討 論

據(jù)報道，俄國人于1900年將黑色蜂種帶入了中國新疆伊犁和阿勒泰地區(qū)，1919年又經哈薩克斯坦將黑蜂帶入了新疆布爾津縣，1925-1926年又將黑蜂帶到了新疆伊寧飼養(yǎng)，慢慢發(fā)展到了整個伊犁地區(qū)，經過百余年的長期混養(yǎng)、自然雜交和人為選育逐漸形成了適應新疆氣候環(huán)境的蜂蜜高產型地方品種[1]。但是關于該蜂種是何起源未見詳細記錄。一直以來，新疆黑蜂被認為是歐洲黑蜂或高加索蜂的后代[14-15]，但都沒有相關的遺傳學證據(jù)。本研究對國家級蜜蜂基因庫(吉林)異地保存的新疆黑蜂保種群體進行遺傳學分析，發(fā)現(xiàn)新疆黑蜂與卡尼鄂拉蜂、意大利蜂、歐洲黑蜂親緣關系較近，而與高加索蜂的親緣關系較遠，所以暫不支持新疆黑蜂來源于高加索蜂。西方蜜蜂的起源進化和分類問題一直存在爭議，在目前已被確認的29個西方蜜蜂亞種中，根據(jù)形態(tài)學及線粒體分子數(shù)據(jù)被劃分為4個主要譜系：A系(非洲)、M系(西歐)、C系(東歐)、O系(中東)[16]。本研究系統(tǒng)進化樹結果與上述分類略有不同，可能是由于分析所用的數(shù)據(jù)集和具體的分析方法不同。此外，結合系統(tǒng)發(fā)育分析、主成分分析及群體遺傳結構和連鎖不平衡分析結果表明，新疆黑蜂在經歷了長時間的人工選擇及對中國新疆地區(qū)的氣候環(huán)境產生高度適應性后，與其他引入蜂種已經產生了明顯的遺傳差異，形成了獨立的遺傳背景，且在進化過程中受到的選擇強度較大，推測可能是由于長期的自然選擇和人工選育造成的。

新疆黑蜂對中國新疆地區(qū)的氣候、蜜源等生態(tài)條件逐漸形成了很強的適應性。本研究篩選出了毛透明蛋白(Trichohyalin-like)、山梨醇脫氫酶(Sorbitol dehydrogenase)等新疆黑蜂受選擇的候選基因,這些基因已被證明與昆蟲的抗寒及能量代謝有關。毛透明蛋白是一種富含谷氨酸、丙氨酸、精氨酸、賴氨酸、絲氨酸的結構蛋白，其特征氨基酸也是抗寒物質中的關鍵氨基酸。研究顯示，不同溫度梯度下的煙粉虱MED隱種和Asia Ⅱ 3隱種Trichohyalin基因的表達存在差異，且該基因在抵御低溫過程中發(fā)揮了一定的調控作用[17]，有助于煙粉虱在低溫條件下生存；山梨醇脫氫酶對昆蟲滯育期能量代謝的調控起到重要作用，它可以將越冬期的抗寒物質山梨醇轉化成糖原，進而分解成可供昆蟲生長發(fā)育的能源物質[18]。新疆黑蜂可以在惡劣的氣候、地理條件下生存，是中國唯一能夠在野外生存的西方蜜蜂類型，而這些候選基因的功能將有助于新疆黑蜂抗寒、越冬性能強等生物學特性的形成。

本研究篩選出的CYP314A1、CCDC112、Octβ2R等新疆黑蜂受選擇的候選基因在昆蟲以及人類繁殖、產卵等生命活動中發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，CYP314A1基因屬于CYP314家族成員，與昆蟲中誘導卵子發(fā)生和抗藥性形成等生理活動密切相關[19-20]；CCDC112是與高齡婦女產卵有關的差異蛋白之一[21]；Octβ2R基因可以激活多種信號通路以誘導產卵，而Octβ2R基因純合突變則導致果蠅雌性個體不育，它們雖表現(xiàn)出正常的求愛、交配、精子儲存和交配后排斥行為，但最后無法產卵[22]。新疆黑蜂體內CYP314A1、CCDC112、Octβ2R等繁殖候選基因在進化過程中受到選擇可能有利于該蜂種高繁殖能力的形成，因而具有產卵力較強、子脾面積大且春季繁殖快等特點，這些基因可以作為日后研究新疆黑蜂優(yōu)異繁殖性能的候選基因。此外，本研究中還篩選出了一些與生長發(fā)育相關的基因，它們也在新疆黑蜂進化的過程中受到了選擇，如與細胞凋亡、增殖及血管生成有關的Kruppel樣因子6(Kruppel-like factor 6，KLF6)[23]；通過誘導細胞凋亡來參與抵抗家蠶核型多角體病毒侵染的細胞色素C(Cytc)[24]；在細胞黏附、運動、生長等細胞生物學活動中發(fā)揮著重要作用的TNS1基因[25]；協(xié)作參與維持基因組穩(wěn)定性、修復DNA、參與控制基因重組的Pten基因[26]；與肌肉、生長、維持細胞代謝有關的ADSL基因[27]；高表達于血管內皮細胞，編碼蛋白具有強力血管生成作用的AFFG1以及對維持內皮間連接起著非常重要作用的ARHGEF17等基因[28-29]。KLF6、TNS1等上述基因的表達調控可能在新疆黑蜂的生長發(fā)育過程中起到了重要作用，使其更能應對伊犁北疆寒冷多風的惡劣生存環(huán)境。

新疆黑蜂在抗病力方面也優(yōu)于其他西方蜜蜂品種，本研究篩選出了SPI-3、Fer3HCH等多個與昆蟲免疫相關的基因。已有研究發(fā)現(xiàn)，絲氨酸蛋白酶抑制劑(Serpins)是昆蟲體內一類非常重要的蛋白酶抑制劑，昆蟲免疫應答的重要組成部分，其家族成員SPI-1和SPI-2基因在正常大鼠肝臟中表達，但SPI-3基因在正常大鼠中幾乎處于沉默，卻在大鼠肝臟急性炎癥期間以及大鼠腦短暫缺血后變得短暫活躍，表明SPI-3基因可能參與了針對炎癥應激的細胞防御反應[30-31]。昆蟲中的Fer3HCH基因通常存在于液泡系統(tǒng)和血淋巴中，研究認為該基因是赤擬谷盜的一種潛在的抗菌效應因子，在抵御病原感染方面具有一定作用；另外，果蠅體內基因過表達試驗結果表明，F(xiàn)er3HCH基因在保護機體免受氧化應激脅迫等方面發(fā)揮著重要作用[32]。以上與免疫相關的候選基因在新疆黑蜂體內受選擇，有利于該蜂種形成免疫力強的體質，從而具有較強的抗病力。

4 結 論

本研究通過全基因組重測序技術在新疆黑蜂中共鑒定出1 728 216個SNPs，其中18 526個非同義突變位點是后續(xù)研究新疆黑蜂遺傳特性候選的SNPs位點；篩選到了CYP314A1、Trichohyalin-like、CCDC112、Sorbitol dehydrogenase、SPI-3、Fer3HCH、TNS1、Pten、ADSL、Octβ2R、AFFG1、ARHGEF17共12個候選基因，解析了新疆黑蜂的抗寒、產卵力強、抗病等優(yōu)異性狀形成的分子機理，為新疆黑蜂種質資源評價、保護及開展分子標記輔助選擇提供了理論依據(jù)。