李暢洋，高炳南，任雨龍，張 昊，孫 瑜，魏 笑，王秋菊

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶 163319)

近年來(lái)奶牛營(yíng)養(yǎng)代謝性疾病嚴(yán)重影響牛奶產(chǎn)量，而通過(guò)抗生素等藥物治療的方式，雖在一定程度上取得了效果，但也產(chǎn)生了極大的副作用。益生菌制劑通過(guò)利用動(dòng)物體內(nèi)存在的無(wú)害功能菌來(lái)調(diào)節(jié)動(dòng)物的內(nèi)外環(huán)境，可以達(dá)到基本解決營(yíng)養(yǎng)代謝紊亂疾病的效果[1-2]。奶牛瘤胃內(nèi)存在大量的微生物，在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，即生長(zhǎng)生產(chǎn)活動(dòng)中發(fā)揮著不可替代的作用。本試驗(yàn)通過(guò)分離奶牛瘤胃液中的菌株，采用16S rDNA序列相似性比對(duì)以及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析等方法對(duì)其進(jìn)行種屬鑒定，再通過(guò)鑒定其生理生化特性，進(jìn)一步確定各項(xiàng)功能與性質(zhì)，以期利用其調(diào)節(jié)瘤胃微生物菌群比例和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，對(duì)奶牛因營(yíng)養(yǎng)紊亂等問(wèn)題造成的疾病進(jìn)行初步治療，為后續(xù)通過(guò)瘤胃內(nèi)功能菌制備菌制劑提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 在黑龍江某養(yǎng)殖場(chǎng)選取10頭健康的成年荷斯坦奶牛，在飼喂前通過(guò)瘤胃管負(fù)壓采集瘤胃液，裝入充滿CO2的離心管中，放入37 ℃恒溫箱內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 主要試劑 厭氧菌瓊脂培養(yǎng)基(HB0310)、MH瓊脂(HB6235)和PremixTaq均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；DL2000 DNA Marker、瓊脂糖均購(gòu)自TaKaRa公司。

1.1.3 主要儀器 厭氧培養(yǎng)箱(YQX-I)購(gòu)自上海躍進(jìn)試驗(yàn)儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)箱(DHP-9272)購(gòu)自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；PCR基因擴(kuò)增儀(GE9612T-S)購(gòu)自杭州柏恒科技有限公司；電泳儀(DYY-6C)購(gòu)自北京市六一儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離與純化 將采集回的瘤胃液在無(wú)菌操作臺(tái)中用紗布過(guò)濾，經(jīng)過(guò)濾后的瘤胃液用生理鹽水進(jìn)行101、102、103、104、105、106、107、108、109倍的稀釋?zhuān)坎冀臃N于高壓滅菌后的NA培養(yǎng)基中。 在厭氧超凈工作臺(tái)內(nèi)按照生長(zhǎng)情況培養(yǎng)12～24 h后，挑取疑似單個(gè)菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，重復(fù)此步驟3～4次，直到培養(yǎng)基內(nèi)出現(xiàn)單一菌落。

1.2.2 細(xì)菌的PCR鑒定 使用煮沸法提取細(xì)菌DNA。采用16S rDNA通用引物進(jìn)行細(xì)菌的PCR鑒定。引物序列為：27F：5′-AGAGTTTGATCCT-GGCTCAG-3′，1492R：5′-GGTTACCTTGTTAC-GACTT-3′[3]，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1 600 bp左右。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系25 μL：模板DNA 1 μL，PremixTaq12.5 μL,上、下游引物各1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸5 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，陽(yáng)性樣品送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中相應(yīng)序列進(jìn)行比對(duì)，采用Mega-X構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.3 細(xì)菌的生化特性鑒定 對(duì)分離菌進(jìn)行產(chǎn)蛋白酶、產(chǎn)淀粉酶、吲哚實(shí)驗(yàn)、甲基紅實(shí)驗(yàn)以及產(chǎn)硫化氫實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 生長(zhǎng)特性鑒定 將得到的菌株分別接種于LB培養(yǎng)基中，以接種菌液LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)0 h為空白對(duì)照，置于搖床內(nèi)37 ℃、150 r/min培養(yǎng)48 h。分別在0、2、4、6、8、10、12、16、18、24、36和48 h取培養(yǎng)液測(cè)定D600 nm值，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以培養(yǎng)液的D600 nm值為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.5 耐酸和耐堿試驗(yàn) 將分離菌用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，取100 μL的菌液加5 mL的生理鹽水，將其pH分別調(diào)至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和7.0、7.5、8.0、8.5，分別測(cè)定分離菌的耐酸和耐堿特性。每組3個(gè)重復(fù)，以pH為橫坐標(biāo)，以培養(yǎng)液的D600 nm值為縱坐標(biāo)繪制菌株生長(zhǎng)曲線。

1.2.6 耐膽鹽試驗(yàn) 在5 mL的生理鹽水內(nèi)分別加入0、0.025、0.050、0.075、0.100 g的膽鹽，使其膽鹽濃度分別達(dá)到0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%共5個(gè)梯度，再加入100 μL經(jīng)LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后的菌液。每組3個(gè)重復(fù)，放置搖床培養(yǎng)24 h后測(cè)其D600 nm值，測(cè)定其對(duì)酸堿膽鹽的耐受程度。以膽鹽濃度作為橫坐標(biāo)，培養(yǎng)液D600 nm值為縱坐標(biāo)分別繪制菌株生長(zhǎng)曲線。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)菌的分離及鑒定

采集回來(lái)的奶牛瘤胃液經(jīng)涂布、提純、擴(kuò)培后，分別得到20個(gè)顏色單一、形態(tài)相同、生長(zhǎng)狀況良好的單一菌落。20株分離菌的16S rDNA序列擴(kuò)增產(chǎn)物大小均為1 600 bp左右(圖1)，與預(yù)期結(jié)果一致。序列測(cè)定和比對(duì)結(jié)果顯示，20株分離菌屬于7種不同的菌。在7株不同菌中各選擇1株(分別為L(zhǎng)7、C2、K7、S7、M7、F7和T7)進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 相似性與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析

相似性分析結(jié)果表明，S7與嗜麥芽窄食單胞菌(登錄號(hào)：KU726007.1)的相似性達(dá)到100%，T7與吉氏庫(kù)特菌屬Kurthiapopuli(登錄號(hào)：NR_144587.1)的相似性達(dá)到98.8%，M7與馬鏈球菌(登錄號(hào)：DQ294304.1)的相似性達(dá)到98.6%，L7與解淀粉芽孢桿菌(登錄號(hào)： KC441795.1)的相似性達(dá)到100%，K7與枯草芽孢桿菌(登錄號(hào)：JQ229801.1)的相似性達(dá)到49.5%，F(xiàn)7與弗氏酸檸檬桿菌(登錄號(hào)：AB734052.1)的相似性達(dá)到100%，C2與地衣芽孢桿菌(登錄號(hào)：AB008509.1)的相似性達(dá)到81.2%(圖2)。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果(圖3)與相似性分析結(jié)果一致，初步判定S7、T7、M7、L7、K7、F7和C2分別為嗜麥芽窄食單胞菌、吉氏庫(kù)特菌、馬鏈球菌、解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、弗氏酸檸檬桿菌和地衣芽孢桿菌。

M，DL2000 DNA Marker；1～9，分離株M，DL2000 DNA Marker；1-9,Isolates圖1 部分分離菌16S rDNA PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 16S rDNA PCR amplification results of partial isolates

圖2 16S rDNA相似性比對(duì)結(jié)果Fig.2 Similarity comparison results of 16S rDNA

圖3 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree

2.3 生化特性結(jié)果

由表1可知，7株分離菌中僅有C2和T7在吲哚實(shí)驗(yàn)反應(yīng)中為陽(yáng)性，證明其有分解色氨酸的能力；K7、M7和F7株有產(chǎn)蛋白酶能力；在甲基紅實(shí)驗(yàn)中僅有C2和F7為陽(yáng)性，說(shuō)明其有分解糖原產(chǎn)生酸性產(chǎn)物的能力；7株分離菌均有產(chǎn)淀粉和分解硫氨基酸的能力。

表1 生化特性結(jié)果

2.4 生物特性結(jié)果

2.4.1 分離菌生長(zhǎng)曲線 如圖4所示，將7株菌在37 ℃震蕩搖床內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)培，取0 h時(shí)的D600 nm值作為基準(zhǔn)，當(dāng)培養(yǎng)到達(dá)8 h，除K7外，其余6株菌的D600 nm值均上升，細(xì)菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在24 h時(shí)為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期頂峰，隨后進(jìn)入平臺(tái)期。而K7菌株在37 ℃培養(yǎng)下，4 h后，濃度開(kāi)始快速升高，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，而在36 h時(shí)為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期頂峰，隨后進(jìn)入平臺(tái)期。

圖4 分離菌生長(zhǎng)曲線Fig.4 Growth curve of the isolated bacteria

2.4.2 耐酸性結(jié)果 如圖5所示，7株菌在pH=3.0時(shí)生長(zhǎng)情況均不是很好。而當(dāng)pH調(diào)至4.0時(shí)，K7和M7的生長(zhǎng)情況明顯好轉(zhuǎn)，其D600 nm值達(dá)到1.284和1.351，分別達(dá)到其最大分光度的72%和70%。而S7、C2和F7菌株在pH=4.0時(shí)的生長(zhǎng)情況依舊沒(méi)有太大的改善，說(shuō)明這3株菌對(duì)酸性的耐受性較弱。

2.4.3 耐堿性結(jié)果 由圖6可知，C2在pH=7.0時(shí)D600 nm值在7株菌中最高，基本與最適生長(zhǎng)情況下的存活率相當(dāng)。而L7在pH=8.0時(shí)的D600 nm值雖在7株菌最低，但卻達(dá)到了其自身生長(zhǎng)的最大值。S7在pH=7.5時(shí)D600 nm值達(dá)到了其自身的最大值，當(dāng)pH進(jìn)一步升高時(shí)，其生長(zhǎng)受到了明顯的抑制的作用，說(shuō)明其對(duì)堿的耐受性較弱。

2.4.4 耐膽鹽試驗(yàn)結(jié)果 由圖7可知，T7在不同膽鹽濃度的情況下的D600 nm值的趨勢(shì)最為平緩，說(shuō)明該菌對(duì)膽鹽的耐受能力較強(qiáng)。C2的趨勢(shì)也較為平緩，而M7和S7的曲線趨勢(shì)較陡峭，以M7的曲線變化趨勢(shì)最為明顯。S7在膽鹽濃度達(dá)到1.5%時(shí)，其D600 nm值為1.629，而膽鹽濃度為0時(shí)其D600 nm值為1.802。證明該2種菌對(duì)膽鹽較為敏感，不易在高濃度膽鹽的條件下存活。

圖5 耐酸性曲線圖Fig.5 Acid resistance curve

圖6 耐堿性曲線圖Fig.6 Alkali resistance curve

圖7 耐膽鹽曲線圖Fig.7 Bile salt tolerance curve

3 討 論

本試驗(yàn)通過(guò)采集10頭健康奶牛瘤胃液進(jìn)行稀釋涂布篩選和提純等，然后通過(guò)16S rDNA測(cè)序鑒定確定了7種分離菌。根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)和相似性分析基本可以確定L7為解淀粉芽孢桿菌。且通過(guò)生化實(shí)驗(yàn)可得知，L7能夠產(chǎn)淀粉酶，這與王世偉等[4]對(duì)解淀粉芽孢桿菌進(jìn)行的產(chǎn)酶能力結(jié)果相符。L7還有較強(qiáng)的耐堿性和膽鹽不耐受性。這也與張曉靜等[5]的試驗(yàn)結(jié)果相同。

C2可確定為地衣芽孢桿菌，在近幾年作為飼料添加劑被廣泛應(yīng)用，如周振峰[6]在奶牛飼料中添加地衣芽孢桿菌，獲得了較好的臨床效果。研究表明飼用地衣芽孢桿菌具有頡頏腸道病原菌，維護(hù)和調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡的作用，增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體的抗病力和免疫力，可有效提高飼料轉(zhuǎn)化率，可作為抗生素的替代產(chǎn)品[7]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，C2對(duì)堿性耐受性較強(qiáng)，對(duì)膽鹽也有很強(qiáng)的耐受性，與張菊等[8]對(duì)地衣芽孢桿菌的酸堿性研究結(jié)果相似,說(shuō)明該菌在后續(xù)的研究中可能難以實(shí)現(xiàn)在腸道內(nèi)定植。

K7為枯草芽孢桿菌，枯草芽孢桿菌為飼料中最常見(jiàn)的微生物添加劑，沒(méi)有危害性，且可以改善飼料的適口性和腸道的淋巴系統(tǒng)[9]。在本試驗(yàn)中可以看出其有較強(qiáng)的耐酸性，與盧冰霞等[10]的研究結(jié)果相符，也與其可以通過(guò)口腔進(jìn)入瘤胃內(nèi)活動(dòng)相印證[11]。

本研究結(jié)果表明，分離菌F7為弗氏酸檸檬桿菌、T7為吉氏庫(kù)特菌、S7為嗜麥芽窄食單胞菌、M7為馬鏈球菌。弗氏檸檬酸桿菌群、吉氏庫(kù)特菌、嗜麥芽窄食單胞桿菌和馬鏈球菌是動(dòng)物體內(nèi)常見(jiàn)的致病菌。弗氏檸檬酸桿菌是人和動(dòng)物體內(nèi)的正常菌群[12]，雖然在一般情況下不會(huì)造成機(jī)體感染癥狀，但當(dāng)其菌群失調(diào)或寄生環(huán)境改變時(shí)，會(huì)導(dǎo)致如腹瀉、胰腺炎、腹膜炎和肺炎等[13-15]。本研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)7對(duì)酸堿性以及膽鹽都較為敏感，可通過(guò)該方法對(duì)其進(jìn)行有效抑制。馬鏈球菌屬于蘭氏分群的C群β溶血鏈球菌,是引起馬腺疫[16]的主要原因，且能夠引起上呼吸道黏膜炎癥和扁桃體發(fā)炎等疾病，由于感染部位的不同，也可能會(huì)引起乳房炎發(fā)生[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，分離菌M7在弱酸情況下生長(zhǎng)狀態(tài)較好，強(qiáng)酸時(shí)受到明顯抑制，與孫丹嵐等[18]的研究結(jié)果相符。在后續(xù)的研究中，可以通過(guò)改善動(dòng)物體內(nèi)的酸堿度從而對(duì)馬鏈球菌進(jìn)行抑制。

本研究結(jié)果表明，T7和S7分別為吉氏庫(kù)特菌和嗜麥芽窄食單胞桿菌，而這兩種菌在之前的研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)，這2株菌對(duì)酸的耐受程度較弱，在pH降低至4.0時(shí)已經(jīng)有了較為明顯的抑制作用。可為以后在針對(duì)這2株菌引發(fā)疾病時(shí)，提供一定的解決思路。且S7對(duì)膽鹽的耐受性也較弱，可以通過(guò)提高膽鹽濃度來(lái)達(dá)到對(duì)該菌株的抑制作用。

功能菌在動(dòng)物體內(nèi)發(fā)揮著毋庸置疑的作用，而功能菌在疾病治療中仍然存在一些問(wèn)題需要解決。如是否可以在體內(nèi)長(zhǎng)期存在、是否占有固定的生態(tài)位、是否可以通過(guò)分離培養(yǎng)及鑒定的方法將特定動(dòng)物體內(nèi)原有生態(tài)位上的功能菌進(jìn)行大量繁殖，通過(guò)轉(zhuǎn)化提高動(dòng)物產(chǎn)品，以此用作動(dòng)物的日常保健及疾病的治療，這可能會(huì)成為未來(lái)科學(xué)化養(yǎng)殖的一個(gè)焦點(diǎn)。本研究通過(guò)對(duì)瘤胃源功能益生菌的研究，充分了解各種菌的特性，為以后利用復(fù)合益生菌制劑[19]、促進(jìn)瘤胃中微生物繁衍，維持瘤胃內(nèi)的微生態(tài)平衡，提高對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化利用率，促進(jìn)飼料的進(jìn)一步消化和營(yíng)養(yǎng)吸收，增強(qiáng)奶牛抵抗能力，降低奶?；疾÷?，起到基礎(chǔ)的保障作用[20]。

4 結(jié) 論

本研究從奶牛瘤胃液中分離出了7種細(xì)菌，分別為嗜麥芽窄食單胞菌、吉氏庫(kù)特菌、馬鏈球菌、解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、弗氏酸檸檬桿菌和地衣芽孢桿菌。分離菌M7和K7對(duì)酸有較強(qiáng)的耐受性，而S7、C2和F7對(duì)酸性較為敏感，C2對(duì)堿的耐受性最強(qiáng)，而T7對(duì)膽鹽的耐受性最強(qiáng)，S7對(duì)膽鹽最不耐受。