王寶寶，金 行，鮮鈺涵，馮宏盛，高鳳山

(大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，大連 116622)

主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex,MHC)是位于細胞表面能夠識別抗原并調(diào)節(jié)免疫功能的糖蛋白[1]。豬的MHC又稱為豬白細胞抗原(swine leukocyte antigen,SLA)。SLA分為三類，分別是SLAⅠ、SLAⅡ和SLA Ⅲ[2]。其中，SLAⅠ類基因主要負責(zé)遞呈內(nèi)源性抗原肽，并引起細胞免疫[3]。SLAⅠ類分子包括輕鏈和重鏈，輕鏈由單一態(tài)性的β2微球蛋白(β2 microglobulin,β2m)組成[4]，重鏈包含SLA-1、SLA-2和SLA-3三類具有多態(tài)性的功能基因座，其中SLA-1與SLA-3均比SLA-2在信號肽的起始部位少3個氨基酸，即21個氨基酸[5]。然而，SLA-1在3個功能基因中多態(tài)性最強[6]。SLA-1基因是SLAⅠ類分子重鏈分子，包括細胞質(zhì)區(qū)、穿膜區(qū)和胞外區(qū)。其中，胞外區(qū)包括α1、α2和α3亞區(qū)，每個亞區(qū)大約含有90個氨基酸。α1和α2構(gòu)成抗原多肽結(jié)合槽(peptide-binding groove)，結(jié)合8～10個氨基酸的多肽[7]，這些多肽在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)被SLA-1重鏈結(jié)合，然后經(jīng)高爾基體加工修飾，形成正確的折疊，最后遞呈到細胞表面被CD8+T淋巴細胞識別，引起細胞毒性T淋巴細胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答[8-9]。根據(jù)SLA-1體內(nèi)遞呈抗原多肽的原理，許多學(xué)者開始在體外表達SLA-1，研究其體外結(jié)合抗原多肽的機理，并篩選抗原多肽，以進行病毒表位多肽疫苗的研制[10-11]。然而，由于SLA-1基因存在多態(tài)性，在SLA-1基因的選擇和抗原表位的篩選方面還沒有建立統(tǒng)一的標準。在此情況下，選擇一種具有代表性的SLA-1基因及其生物材料，既能方便獲得又易于進行后續(xù)基因功能研究顯得尤為必要。

本試驗所用豬腎上皮細胞15(PK15)，其父母代源自1955年美國Stice提供的成年豬腎細胞PK-2a，后被ATCC收藏(CCL-33)[12]。該細胞能夠穩(wěn)定傳代， 培養(yǎng)技術(shù)成熟， 細胞株容易獲得， 是目前應(yīng)用最廣泛的豬源傳代細胞系之一， 可以作為細胞免疫研究的工具， 在多個研究領(lǐng)域已得到了廣泛的應(yīng)用[13-14]。國外學(xué)者從轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平分別證明了PK15細胞能夠表達SLAⅠ類分子[15-16]，SLA-1為SLAⅠ類分子功能基因之一，推測該基因在PK15細胞表達。目前，國內(nèi)對PK15細胞SLA-1在基因水平系統(tǒng)的研究鮮見報道，尤其是對于該基因詳細的序列信息、分子進化特點、氨基酸變異及分子結(jié)構(gòu)特征還缺乏系統(tǒng)研究。本課題組前期研究已經(jīng)建立了PK15細胞穩(wěn)定傳代和培養(yǎng)條件，并已經(jīng)證明輕鏈β2m在PK15細胞中穩(wěn)定表達[17]。在此基礎(chǔ)上，本試驗通過克隆PK15細胞的SLA-1基因序列，分析其基因特征和分子進化關(guān)系，解析其分子結(jié)構(gòu)特點，為下一步建立系統(tǒng)的PK15細胞SLA-1抗原表位篩選及開展其他相關(guān)結(jié)構(gòu)和功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

PK15細胞株購自中國微生物菌種保藏管理中心(產(chǎn)品編號：ATCC?CCL-33TM)；Solution Ⅰ、dNTP、AMV反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DL2000 DNA Marker、ExTaq酶、EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ均購自寶生物工程(大連)有限公司；Trizol購自Invitrogen公司；大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞由大連大學(xué)分子免疫實驗室保存；無水乙醇、氯仿、異丙醇、DEPC、低分子量蛋白Marker、DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、氨芐青霉素均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 引物設(shè)計及合成

參考GenBank中SLA-1基因序列(登錄號：AY459306)，使用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計其特異性引物，SLA-1-PK15-F:5′-CATGGGGCCT-GGAGCCCTCT-3′；SLA-1-PK15-R:5′-CTCAAC-TCCTCATGGCACCAATTAG-3′，產(chǎn)物大小為1 419 bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 SLA-1基因的克隆及測序

1.3.1 PK-15細胞總RNA提取及cDNA合成 復(fù)蘇凍存的PK15細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，傳代1次，調(diào)整細胞密度為1×105/mL，然后按照Gao等[18]的方法利用Trizol試劑盒提取總RNA。 最后將沉淀加入 20 μL 0.1% DEPC水溶解，在 60 ℃下孵育 5 min，-80 ℃保存。取 2 μL PK15細胞總RNA，分別加入2 μL的Oligo(dT)(15T)(100 mol/L)、2 μL AMV buffer、4 μL dNTP(2.5 mol/L)、1 μL AMV(10 U)，最后用0.1% DEPC水補至20 μL，42 ℃作用1 h進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2SLA-1基因的克隆及測序 以1.3.1合成的cDNA為模板，進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系50 μL：ExTaq酶0.25 μL，10×Buffer 5 μL，MgCl2Solution 2 μL，dNTP Mix 1 μL，cDNA 2 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O補足體系。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，64 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。用膠回收試劑盒回收目的基因PCR產(chǎn)物，然后參照高鳳山等[19]的方法將目的基因連接到pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞，過夜培養(yǎng)16 h后挑單克隆，按照堿裂解法提取質(zhì)粒，利用EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ進行雙酶切鑒定，陽性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.4 生物信息學(xué)分析

用Genetyx 9.0進行序列分析，序列登錄入GenBank BankIt (https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov)。序列多重比較及分子進化樹用DNAMAN 5.2.2 (Lynnon BioSoft Co.，LTD)和Mega 5.0 軟件(Mega Software Co.，Ltd)的Neighbor-Joining 法分析繪制。將PK15細胞SLA-1蛋白胞外區(qū)氨基酸序列與GenBank和IPD Database代表性的SLA-1序列胞外區(qū)通過Multalin (http:∥multalin.toulouse.inra.fr/multalin/)[20]進行多重序列比較，并分析二級結(jié)構(gòu)特征。以蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(PDB)中已解析的動物MHCⅠ蛋白的三維結(jié)晶結(jié)構(gòu)(3D)為模板，利用http:∥www.expasy.org/swissmod/SWISS-MODEL.htl同源模建SLA-1蛋白的三維結(jié)構(gòu)，Rasmol分析其結(jié)構(gòu)特征，推測其功能[18]。

2 結(jié) 果

2.1 SLA-1基因的擴增與克隆

從PK15細胞提取總RNA后，RT-PCR擴增結(jié)果如圖1A所示，擴增條帶約在1 400 bp位置，與理論值1 419 bp相符。重組質(zhì)粒的雙酶切結(jié)果顯示，插入基因大小約1 400 bp，與PCR擴增大小一致(圖1B)。

2.2 SLA-1基因序列測定及分析

陽性克隆經(jīng)生物公司測序，序列經(jīng)Genetyx 9.0分析，證實PK15細胞SLA-1基因大小為1 419 bp，其中2-1 087 bp為編碼區(qū)，共編碼361個氨基酸，信號肽為21個氨基酸(圖2)，符合SLA-1基因特征。 序列提交到GenBank BankIt，獲得登錄號：OK321186。

2.3 SLA-1*PK15系統(tǒng)進化樹分析

系統(tǒng)進化分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SLA-1*PK15與SLA-1*wxd(中國梅山豬)和SLA-1*0401(中國巴馬小型豬)進化關(guān)系最近，而與SLA-1*lr02(丹麥長白豬)及SLA-1*0509(中國西藏野豬)進化關(guān)系較遠(圖3)。

M，DL2000 DNA Marker；1、2，SLA-1基因RT-PCR產(chǎn)物樣品；3，重組質(zhì)粒；4，重組質(zhì)粒雙酶切鑒定M,DL2000 DNA Marker;1 and 2,RT-PCR products of SLA-1 gene;3,Recombinant plasmid;4,Identification of recombinant plasmid by double digestion圖1 RT-PCR擴增SLA-1基因(A)和重組質(zhì)粒雙酶切檢測(B)Fig.1 Detection of SLA-1 gene amplified by RT-PCR (A) and recombinant plasmids by double digestion (B)

第一個堿基A(加陰影部分)為非編碼基因，為了便于編碼區(qū)翻譯，核苷酸計數(shù)從第2個核苷酸開始The first base A is a non-coded gene.In order to translate the coding region more easily,the numbering nucleotide was changed to the second nucleotide圖2 PK15細胞SLA-1基因氨基酸序列分析Fig.2 Amino acid sequence analysis of SLA-1 gene in PK15 cells

圖3 SLA-1基因編碼氨基酸進化樹分析Fig.3 Phylogenetic tree analysis of amino acids encoded by SLA-1 gene

2.4 PK15細胞SLA-1蛋白胞外區(qū)氨基酸比較及二級結(jié)構(gòu)分析

為了分析PK15細胞SLA-1蛋白胞外區(qū)氨基酸特征，將SLA-1與分子進化樹中具有代表性的SLA-1進行胞外區(qū)氨基酸比對，同時進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PK15細胞SLA-1與其他SLA-1蛋白胞外區(qū)主要變異位點均存在于α1區(qū)和α2區(qū)，α3區(qū)的變異位點較少。其中，α1區(qū)的變異位點最集中，3個連續(xù)變異氨基酸位置有6個，包括R17-R21、P42-M44、Q53-E58、D61-E63、R65-A71和T73-V76；α2區(qū)3個連續(xù)變異氨基酸區(qū)域只有2個，包括C100-L102和W147-E152。與其他SLA-1蛋白相比較，SLA-1 PK15細胞蛋白不存在特征性的氨基酸變異位點。 二級結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，PK15細胞SLA-1蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋和β-折疊為主，α1區(qū)具有1個α-螺旋和4個β-折疊，α2區(qū)具有4個α-螺旋和4個β-折疊。α3區(qū)主要以β-折疊為主，存在9個β-折疊(圖4)。

2.5 PK15細胞SLA-1蛋白同源建模及三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

以已解析的動物MHCⅠ三級結(jié)構(gòu)為模板，將PK15細胞SLA-1進行同源建模，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PK15細胞SLA-1蛋白具有SLA class Ⅰ典型的三級結(jié)構(gòu)，α1區(qū)和α2區(qū)構(gòu)成抗原多肽結(jié)合區(qū)，包括側(cè)面的α-螺旋，底部由8個反向平行的β-折疊構(gòu)成。α3區(qū)主要由β-折疊和部分無規(guī)則卷曲構(gòu)成(圖5)。

圖4 SLA-1蛋白胞外區(qū)氨基酸多重比較及二級結(jié)構(gòu)分析Fig.4 Multiple comparison of amino acids of extracellular domain and analysis of secondary structure of SLA-1 protein

圖5 SLA-1蛋白同源建模三級結(jié)構(gòu)Fig.5 Tertiary structure of SLA-1 protein by homology modeling

3 討 論

豬SLA-1主要功能為抗原遞呈，識別抗原并誘導(dǎo)細胞免疫,而起抗原遞呈功能的主要部位為SLA-1的胞外區(qū)[21]。近年來，SLA-1基因在抗原多態(tài)性、基因表達、分子進化以及抗原遞呈等方面的研究取得了較大的進展[11,18,22]。然而，由于SLA-1基因多態(tài)性的存在，對SLA-1基因功能方面的研究尤其是在抗原遞呈和表位篩選方面存在標準不統(tǒng)一、缺乏有效參照的問題。PK15細胞是一個穩(wěn)定的傳代細胞系，具有建立標準的SLA-1基因功能研究細胞模型的潛在應(yīng)用價值。因此，對于探究SLA-1基因是否在PK15細胞穩(wěn)定存在，并對該基因進行克隆、序列分析等涉及其生物信息學(xué)研究具有十分重要的意義。

本試驗通過查閱文獻及在前期研究[23]的基礎(chǔ)上，從PK15細胞中成功克隆得到SLA-1基因，經(jīng)序列分析證實該基因信號肽含有21個氨基酸，符合SLA-1基因特征，與Chardon等[5]報道一致，說明SLA-1基因在PK15細胞中穩(wěn)定存在。進一步的序列比對和分子進化樹分析證實SLA-1*PK15與SLA-1*wxd(中國梅山豬)和SLA-1*0401(中國巴馬小型豬)進化關(guān)系最近，而與SLA-1*lr02(丹麥長白豬)及SLA-1*0509(中國西藏野豬)進化關(guān)系較遠，揭示今后以PK15細胞進行SLA-1抗原表位篩選后，表位肽功能試驗可選擇的動物具有了參考標準。PK15細胞SLA-1蛋白胞外區(qū)及二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，SLA-1無特征性變異氨基酸，揭示PK15細胞SLA-1蛋白可以作為一個普適性的功能基因研究抗原遞呈或表位篩選，有利于獲得普適性的抗原表位，用于表位疫苗研制[24]。另外，胞外區(qū)的多重比較結(jié)果表明，SLA-1的α1區(qū)有6個主要的氨基酸變異區(qū)，α2區(qū)有2個主要的抗原變異位點區(qū)，為今后進行抗原表位的設(shè)計和表位篩選提供了數(shù)據(jù)。同源模建分析PK15細胞SLA-1蛋白的三級結(jié)構(gòu)結(jié)果顯示，PK15細胞SLA-1蛋白呈現(xiàn)典型的SLA classⅠ的結(jié)構(gòu)特征，具有完整的抗原多肽結(jié)合槽，與Pan等[25]報道的豬SLA-1晶體結(jié)構(gòu)相似，因此可推測該基因具有良好的抗原多肽結(jié)合功能。

4 結(jié) 論

本研究從PK15細胞中成功克隆了SLA-1基因，獲得了該基因序列并提交GenBank獲得登錄號:OK321186，闡明了該基因的分子進化關(guān)系，并證實該基因具有普適性的分子結(jié)構(gòu)特征及良好的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)特征，為今后系統(tǒng)開展PK15細胞系SLA-1基因結(jié)構(gòu)和功能的研究奠定了基礎(chǔ)。