陳如一，黃 妍，徐文靜，趙鑫鈺，夏道宗

基于MAPK信號(hào)通路研究艾柱燃燒產(chǎn)物減輕藍(lán)光誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞損傷的作用機(jī)制

陳如一，黃 妍，徐文靜，趙鑫鈺，夏道宗*

浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310053

探討艾柱燃燒產(chǎn)物（moxa smoke extract，MSE）對(duì)藍(lán)光誘導(dǎo)人視網(wǎng)膜色素上皮（adult retinal pigment epithelium-19，ARPE-19）細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其作用機(jī)制。體外培養(yǎng)ARPE-19細(xì)胞，CCK-8法檢測(cè)不同質(zhì)量濃度（0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、5.00、10.00、50.00、100.00、150.00 μg/mL）MSE對(duì)ARPE-19細(xì)胞活力的影響。設(shè)置對(duì)照組、對(duì)照＋MSE高劑量組、藍(lán)光組、藍(lán)光＋葉黃素組、藍(lán)光＋MSE低劑量組和藍(lán)光＋MSE高劑量組。對(duì)照組和藍(lán)光組加入空白培養(yǎng)基，其余4組分別加入相應(yīng)的含藥培養(yǎng)基干預(yù)24 h后，除對(duì)照組以及對(duì)照＋MSE高劑量組外，各組均在藍(lán)光（430 nm，96.1 W/m2）下刺激1 h。建立ARPE-19細(xì)胞損傷模型后，采用乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）法檢測(cè)質(zhì)膜完整性；采用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平；采用試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激指標(biāo)丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）水平和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、過氧化氫酶（catalase，CAT）以及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性；采用Western blotting法檢測(cè)絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)。與對(duì)照組相比，MSE（0.25～4.00 μg/mL）對(duì)ARPE-19細(xì)胞活力沒有顯著影響。與藍(lán)光組相比，MSE可以顯著降低培養(yǎng)上清中的LDH活性（＜0.01），減輕質(zhì)膜損傷以及細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，調(diào)節(jié)MAPK信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白R(shí)as、磷酸化c-Raf（phosphorylated c-Raf，p-c-Raf）、磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（phosphorylated extracellular regulated protein kinase 1/2，p-Erk1/2）、磷酸化絲裂原活化的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（phosphorylated mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase 1/2，p-MEK1/2）和p-p38 MAPK表達(dá)（＜0.05、0.01），調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)SOD、CAT、GSH-Px活性以及GSH、MDA、ROS水平（＜0.05、0.01），改善ARPE-19細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)。MSE可能通過調(diào)控ROS介導(dǎo)的MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，對(duì)藍(lán)光誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷起保護(hù)作用。

艾柱燃燒產(chǎn)物；ARPE-19；藍(lán)光；氧化應(yīng)激；絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路

視頻終端視疲勞綜合征（visual display terminal symptom，VDTS）是一種使用智能手機(jī)、平板電腦等視頻終端進(jìn)行工作或?qū)W習(xí)時(shí)，出現(xiàn)不自覺的短暫性斜視或自覺的包括眼睛酸痛、視物模糊和眨眼頻繁等眼部癥狀的綜合征[1]。研究表明，視頻終端在使用過程中會(huì)產(chǎn)生大量藍(lán)光，進(jìn)而誘發(fā)視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelial，RPE）細(xì)胞產(chǎn)生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS），導(dǎo)致蛋白質(zhì)、脂質(zhì)以及核酸的氧化損傷和視網(wǎng)膜細(xì)胞形態(tài)的改變[2-4]。近年來，由于國(guó)家對(duì)新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）流行病的防控布控，區(qū)域之間的封鎖導(dǎo)致人們對(duì)數(shù)字設(shè)備的使用時(shí)長(zhǎng)急劇增加[5]，由此帶來的眼部健康問題亟待解決。本課題組前期研究表明，艾柱燃燒產(chǎn)物（moxa smoke extract，MSE）中的主要成分為苯酚（3.01%）、3-呋喃甲醇（2.77%）和豆甾醇（2.18%）等小分子化合物，具有較好的體外抗氧化作用[6]。然而，目前對(duì)于MSE保護(hù)成人視網(wǎng)膜色素上皮（adult retinal pigment epithelium-19，ARPE-19）細(xì)胞損傷的調(diào)控機(jī)制尚不明確。

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）是細(xì)胞內(nèi)激酶的成員之一，能夠感受并傳導(dǎo)外界環(huán)境的變化，進(jìn)而調(diào)節(jié)多種細(xì)胞生理過程。近來研究發(fā)現(xiàn)，MAPK信號(hào)通路能夠抑制由過氧化氫、白細(xì)胞介素-1β以及高濃度葡萄糖等因素誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞損傷，通過抑制p38 MAPK的表達(dá)對(duì)RPE細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用[7-9]。本研究通過制備藍(lán)光誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞損傷模型，以MAPK信號(hào)通路調(diào)控ROS生成，抑制ARPE-19細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷為切入點(diǎn)，探討MSE是否可通過調(diào)控ARPE-19細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡，減少氧化應(yīng)激損傷，從而發(fā)揮對(duì)ARPE-19細(xì)胞的保護(hù)作用。

1 材料

1.1 細(xì)胞

ARPE-19細(xì)胞購(gòu)自廣州吉妮歐生物科技有限公司。

1.2 藥物

艾柱（批號(hào)20190415）購(gòu)自浙江乾一生物科技有限公司；葉黃素（批號(hào)F10J10M92153）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。

1.3 試劑

CCK-8試劑盒（批號(hào)71011500）購(gòu)自白鯊生物科技有限公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，批號(hào)分別為20201119、20200815、20200819、20200820、20200822、20200820；ROS檢測(cè)試劑盒（批號(hào)061521210723）購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白定量試劑盒（批號(hào)030321210621）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Ras抗體、c-Raf抗體、磷酸化c-Raf（phosphorylated c-Raf，p-c-Raf）抗體、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinase 1/2，Erk1/2）抗體、磷酸化Erk1/2（phosphorylated Erk1/2，p-Erk1/2）抗體、絲裂原活化的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase 1/2，MEK1/2）抗體、磷酸化MEK1/2（phosphorylated MEK1/2，p-MEK1/2）抗體、p38 MAPK抗體、磷酸化p38 MAPK（phosphorylated p38 MAPK，p-p38 MAPK）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司，批號(hào)分別為5、1、10、28、24、2、18、9、13、8；熒光標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（批號(hào)C70428-05）、熒光標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體（批號(hào)C70124-05）購(gòu)自美國(guó)LI-COR公司。

1.4 儀器

RE52CS-1型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限公司）；W201B型數(shù)控恒溫水浴鍋（上海申勝生物技術(shù)有限公司）；BSA224S-CW型電子天平（德國(guó)Sartorius公司）；超凈臺(tái)、CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；5427R型高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；PL-LED100F型光源（北京普林塞斯科技有限公司）；數(shù)字式照度計(jì)（深圳聚茂源科技有限公司）；Synergy H1MFD型多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司）；Mini-PROTEAN Tetra System垂直電泳槽、PowerPacTM HC型高電流電源（美國(guó)Bio-Rad公司）；Odyssey CLx型雙色紅外激光成像系統(tǒng)（美國(guó)LI-COR公司）；ECLIPSE Ti-S型倒置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）；CytoFLEX流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman Coulter公司）。

2 方法

2.1 MSE的制備

稱取200 g艾柱于自制燃燒裝置中暗火燃燒，在吸收瓶中加入適量無水乙醇作為煙霧吸收溶劑，緩沖瓶與真空泵連接。通過調(diào)節(jié)循環(huán)水泵控制艾柱的燃燒速度，使艾煙能夠被充分吸收。將飽和的艾煙吸收溶劑過濾，減壓蒸餾直到無餾分餾出，得到MSE[6]。稱定質(zhì)量，用無水乙醇稀釋到35 mg/mL備用。

2.2 ARPE-19細(xì)胞培養(yǎng)和處理

ARPE-19細(xì)胞以含10%胎牛血清和100 U/mL青霉素/鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至70%～80%時(shí)用胰酶消化收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個(gè)/mL，鋪板/皿適應(yīng)12 h后，按照以下分組處理：對(duì)照組和藍(lán)光組更換新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)；對(duì)照＋MSE高劑量組和藍(lán)光＋MSE高劑量組，換用含2 μg/mL MSE的培養(yǎng)基培養(yǎng)；藍(lán)光＋MSE低劑量組，換用含1 μg/mL MSE的培養(yǎng)基培養(yǎng)；藍(lán)光＋葉黃素組換用含30 μmol/L葉黃素[10]的培養(yǎng)基培養(yǎng)。藥物預(yù)保護(hù)24 h后，根據(jù)Park等[11]方法稍作修改建立藍(lán)光誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞損傷模型：從CO2培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞恢復(fù)室溫，加入適量PBS補(bǔ)充光照導(dǎo)致的水分蒸發(fā)。在室溫下將對(duì)照和對(duì)照＋MSE高劑量組置于桌面避光放置，其余分組均置于桌面用LED藍(lán)光源（430 nm，96.1 W/m2）從正上方均勻光照1 h，即得藍(lán)光誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞損傷模型。

2.3 CCK8檢測(cè)細(xì)胞存活率

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ARPE-19細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個(gè)/mL，以每孔100 μL接種于96孔板中，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。設(shè)置空白組、對(duì)照組和給藥組（分別加入MSE至終質(zhì)量濃度為0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、5.00、10.00、50.00、100.00、150.00 μg/mL），孵育24 h后小心吸走培養(yǎng)液，加入預(yù)混的CCK8工作液（每100 μL新鮮基礎(chǔ)培養(yǎng)液＋10 μL CCK8），37 ℃避光孵育45 min，采用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度（）值，計(jì)算細(xì)胞存活率，以對(duì)細(xì)胞無毒性的質(zhì)量濃度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)用濃度范圍。

細(xì)胞存活率＝(MSE－空白)/(對(duì)照－空白)

2.4 LDH活性的測(cè)定

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ARPE-19細(xì)胞，接種于96孔板中，按照“2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組及處理后，收集上清液，按試劑盒說明書檢測(cè)細(xì)胞上清液中LDH活性。

2.5 MSE對(duì)藍(lán)光誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞形態(tài)的影響

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ARPE-19細(xì)胞，接種于6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，按照“2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組及處理后，小心吸走培養(yǎng)液，用PBS緩沖液清洗1遍，加入2 mL PBS緩沖液后，于倒置熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞狀態(tài)，并拍照記錄。

2.6 流式細(xì)胞術(shù)和倒置熒光顯微鏡觀察ARPE-19細(xì)胞ROS水平

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ARPE-19細(xì)胞，接種于6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，按照“2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組及處理后，小心吸走培養(yǎng)液，用PBS緩沖液清洗1遍，每孔加入1 mL用RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋的終濃度為20 μmol/L的DCFH-DA熒光染色液，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)60 min，小心吸走DCFH-DA熒光染色液，用PBS緩沖液清洗3遍，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA熒光探針，于倒置熒光顯微鏡下觀察各組ARPE-19細(xì)胞中ROS表達(dá)情況，并拍照記錄。隨后，收集ARPE-19細(xì)胞，加入0.4 mL PBS緩沖液混勻。冰浴避光，30 min內(nèi)在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞中ROS水平。

2.7 ARPE-19細(xì)胞中MDA、GSH水平及GSH-Px、CAT、SOD活性檢測(cè)

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ARPE-19細(xì)胞，接種于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，按照“2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組及處理后，收集細(xì)胞。ARPE-19細(xì)胞冰上勻漿后用于后續(xù)分析抗氧化參數(shù)。采用BCA法對(duì)各組細(xì)胞勻漿進(jìn)行蛋白定量。隨后，按照試劑盒說明書操作，SOD活性使用WST-1法檢測(cè)，CAT、GSH-Px活性使用可見光法測(cè)定，GSH水平使用微量酶標(biāo)法檢測(cè)，MDA水平測(cè)定使用硫代巴比妥酸法。

2.8 Western blotting檢測(cè)MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ARPE-19細(xì)胞，接種于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，按照“2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行分組及處理后，收集細(xì)胞。細(xì)胞裂解后提取總蛋白，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量，加入適量上樣緩沖液后，100 ℃恒溫金屬浴變性10 min，得到蛋白樣品。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，于5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h，分別加入Ras、c-Raf、p-c-Raf、Erk1/2、p-Erk1/2、MEK1/2、p-MEK1/2、p38和p-p38抗體（1∶1000），4 ℃冰箱內(nèi)搖床上孵育過夜，以GAPDH（1∶5000）作為內(nèi)參，3次TBST緩沖液洗膜后，加入熒光標(biāo)記的二抗（1∶10 000），室溫避光孵育2 h；3次TBST洗膜后，用Odyssey CLx 雙色紅外激光成像系統(tǒng)顯影成像，用Image J軟件分析條帶灰度值。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均采用Graphpad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理并作圖表示，統(tǒng)計(jì)變量以表示，多組間比較采用單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 MSE對(duì)ARPE-19細(xì)胞存活率的影響

不同質(zhì)量濃度的MSE處理ARPE-19細(xì)胞24 h，如圖1所示，0.25～4.00 μg/mL質(zhì)量濃度的MSE對(duì)細(xì)胞活力沒有顯著影響，說明MSE在0.25～4.00 μg/mL對(duì)ARPE-19細(xì)胞無細(xì)胞毒性；當(dāng)MSE質(zhì)量濃度超過4.00 μg/mL時(shí)，細(xì)胞活力明顯下降（＜0.05、0.01），說明超過4.00 μg/mL的質(zhì)量濃度不宜作為實(shí)驗(yàn)濃度，為了保持細(xì)胞處于最佳的活力，因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中MSE低、高劑量組分別設(shè)置為1、2 μg/mL。

與對(duì)照組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01

3.2 MSE對(duì)藍(lán)光誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞損傷的影響

在藍(lán)光（430 nm，96.1 W/m2）下光照ARPE-19細(xì)胞1 h，如圖2所示，高劑量的MSE對(duì)于對(duì)照組細(xì)胞并無顯著影響；而藍(lán)光組細(xì)胞上清液中LDH活性顯著升高（＜0.01）；給予30 μmol/L葉黃素之后LDH活性顯著下降（＜0.01）；給予MSE后，上清液中的LDH活性顯著下降（＜0.01），且呈劑量相關(guān)性。表明藍(lán)光誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞損傷模型成功成立，MSE對(duì)藍(lán)光誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞損傷有顯著的保護(hù)作用，且呈劑量相關(guān)性。

3.3 MSE對(duì)藍(lán)光誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

如圖3所示，對(duì)照組ARPE-19細(xì)胞之間具有明顯的網(wǎng)狀連接；與對(duì)照組相比，對(duì)照＋MSE高劑量組無顯著變化，網(wǎng)狀連接明顯；而藍(lán)光組中ARPE-19細(xì)胞間網(wǎng)狀連接明顯消失，細(xì)胞間距增大，呈分散趨勢(shì)，由此說明藍(lán)光照射對(duì)于ARPE-19細(xì)胞造成了損傷。與藍(lán)光組相比，隨著給予葉黃素以及MSE濃度的增大，細(xì)胞間的網(wǎng)狀連接得到保護(hù)，藍(lán)光＋MSE高劑量組基本接近對(duì)照組。表明MSE能夠顯著改善藍(lán)光誘導(dǎo)下受損的ARPE-19細(xì)胞形態(tài)。

A-對(duì)照組 B-對(duì)照＋MSE高劑量組 C-藍(lán)光組 D-藍(lán)光＋葉黃素組 E-藍(lán)光＋MSE低劑量組 F-藍(lán)光＋MSE高劑量組 與對(duì)照組比較：##P＜0.01；與藍(lán)光組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，下圖同

圖3 MSE對(duì)藍(lán)光誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞形態(tài)的影響 (×200)

3.4 MSE對(duì)藍(lán)光誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞ROS水平的影響

采用流式細(xì)胞儀，以DCFH-DA作為熒光探針對(duì)ARPE-19細(xì)胞內(nèi)ROS水平進(jìn)行檢測(cè)，如圖4所示，對(duì)照＋MSE高劑量組的ROS熒光水平較對(duì)照組顯著降低（＜0.01），說明MSE不僅針對(duì)受損細(xì)胞，對(duì)正常ARPE-19細(xì)胞亦具有一定的保護(hù)作用；而藍(lán)光組較對(duì)照組ROS水平顯著上升（＜0.01），且隨著MSE濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)ROS熒光水平顯著降低（＜0.01）；在給予葉黃素預(yù)保護(hù)24 h后，ARPE-19細(xì)胞中ROS熒光水平顯著降低（＜0.01）。倒置熒光顯微鏡下的結(jié)果（圖5）與上述結(jié)果一致。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MSE對(duì)藍(lán)光誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞中ROS水平的影響(, n = 3)

圖5 倒置熒光顯微鏡法檢測(cè)MSE對(duì)藍(lán)光誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞ROS水平的影響(×200)

3.5 MSE對(duì)藍(lán)光誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞MDA、GSH水平及GSH-Px、CAT、SOD活性的影響

如圖6所示，與對(duì)照組相比，對(duì)照＋MSE高劑量組MDA、GSH水平及GSH-Px、CAT、SOD活性未見明顯改變；藍(lán)光組細(xì)胞內(nèi)MDA水平顯著升高（＜0.01），GSH水平和GSH-Px、CAT、SOD抗氧化酶活性顯著下降（＜0.01）；與藍(lán)光組相比，MSE組細(xì)胞內(nèi)GSH水平和SOD、CAT、GSH-Px活性均顯著升高（＜0.05、0.01），MDA水平顯著降低（＜0.01），呈劑量相關(guān)性；給予葉黃素后，各項(xiàng)指標(biāo)均有所改善。

3.6 MSE對(duì)藍(lán)光誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞中MAPK通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖7所示，與對(duì)照組相比，對(duì)照＋MSE高劑量組細(xì)胞MAPK通路相關(guān)蛋白表達(dá)并無顯著差異；而經(jīng)藍(lán)光誘導(dǎo)后的ARPE-19細(xì)胞中的Ras、p-Raf、p-MEK1/2、p-Erk1/2、p-p38蛋白表達(dá)水平均顯著升高（＜0.01）；葉黃素能顯著降低細(xì)胞Ras、p-Raf、p-MEK1/2、p-Erk1/2、p-p38蛋白表達(dá)水平（＜0.01）；MSE組細(xì)胞上述蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.05、0.01），并呈劑量相關(guān)性。

圖6 MSE對(duì)藍(lán)光誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞中MDA、GSH水平及CAT、GSH-Px、SOD活性的影響(, n = 3)

圖7 MSE對(duì)藍(lán)光誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(, n = 3)

4 討論

本課題組前期研究已經(jīng)在體外驗(yàn)證了MSE較艾柱揮發(fā)油具有更好的抗氧化性能。為了闡明MSE保護(hù)藍(lán)光誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞損傷作用的具體機(jī)制，從其對(duì)抑制ARPE-19細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)以及MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)2方面的影響進(jìn)行探索。1985年，“氧化應(yīng)激”作為氧化還原生物學(xué)和醫(yī)學(xué)中的1個(gè)概念被正式提出，其有2部分組成：有氧代謝以氧化還原平衡穩(wěn)態(tài)的形式存在以及用專業(yè)的術(shù)語表達(dá)了這種平衡之間潛在的張力，即生物體的應(yīng)激反應(yīng)[12]。視網(wǎng)膜是人體中耗氧量最高的組織之一[13]。高強(qiáng)度的有氧代謝以及持續(xù)的光照都會(huì)誘導(dǎo)視網(wǎng)膜中產(chǎn)生過量的ROS[14-15]。研究證明，400～500 nm波長(zhǎng)的藍(lán)光可誘導(dǎo)RPE細(xì)胞產(chǎn)生過量的ROS[16]，過量的ROS與細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)反應(yīng)產(chǎn)生MDA，進(jìn)而破壞細(xì)胞膜完整性及流動(dòng)性，引起細(xì)胞膜損傷[17]。同時(shí)，過量的ROS會(huì)導(dǎo)致線粒體功能的破壞，此過程往往伴隨著細(xì)胞內(nèi)酶（包括LDH）的大量釋放，而與其他所有酶相比，LDH在這一過程中增加地更多[18]。因此，本研究通過檢測(cè)LDH活性證明了藍(lán)光暴露能夠誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞損傷模型。通過對(duì)藍(lán)光照射前后ARPE-19細(xì)胞形態(tài)學(xué)的觀察，進(jìn)一步確認(rèn)了藍(lán)光照射對(duì)ARPE-19細(xì)胞造成了損傷，使細(xì)胞間的網(wǎng)狀連接消失，細(xì)胞間距增大。研究證明，機(jī)體內(nèi)部的抗氧化防御的主要作用是由抗氧化酶實(shí)現(xiàn)的，而不是小分子的抗氧化物[12]。如在GSH-Px的催化下，GSH向ROS提供1個(gè)質(zhì)子以穩(wěn)定氧自由基，并轉(zhuǎn)換為氧化型谷胱甘肽（glutathione disulfide，GSSG）[19]。

葉黃素是一種在人類腦組織中占主導(dǎo)地位的類胡蘿卜素[20-21]，能夠自由地穿過血視網(wǎng)膜屏障[22]，并通過過濾高能短波的光線來減弱視網(wǎng)膜處的光化學(xué)損傷。葉黃素通過清除過量的ROS、超氧化物和羥基自由基，避免視網(wǎng)膜磷脂的過氧化，減少脂褐素的形成，進(jìn)而減輕光誘導(dǎo)的相關(guān)損傷[23]。以葉黃素為陽性對(duì)照藥物，本研究發(fā)現(xiàn)MSE能夠有效降低ARPE-19細(xì)胞中ROS和MDA水平，提高GSH水平；顯著提高細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶GSH-Px、CAT和SOD活性，MSE高劑量組在部分實(shí)驗(yàn)指標(biāo)上甚至優(yōu)于陽性對(duì)照藥物。由此推測(cè)MSE保護(hù)ARPE-19細(xì)胞免受藍(lán)光損傷的機(jī)制可能在于其中含有某種脂溶性成分能夠滲透血視網(wǎng)膜屏障，進(jìn)而恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)的氧化還原穩(wěn)態(tài)，提高細(xì)胞活力。

另一方面，由于方法學(xué)的重大進(jìn)展，將這種生物體內(nèi)的氧化還原轉(zhuǎn)換同磷酸化與去磷酸化信號(hào)聯(lián)系起來的重要性得到了充分的認(rèn)識(shí)[12]。MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)信號(hào)通路是最關(guān)鍵的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)途徑之一[24-25]。環(huán)境應(yīng)激會(huì)引起MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白活性的改變[26]，其激活狀態(tài)依賴相關(guān)蛋白激酶與其磷酸化蛋白的共同調(diào)節(jié)，這種調(diào)節(jié)是可逆的，機(jī)體會(huì)根據(jù)體內(nèi)環(huán)境的變化而進(jìn)行動(dòng)態(tài)調(diào)整，使其處于一種動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)[27]。Ras和Raf是最早被報(bào)道的癌蛋白[28-29]，Ras的激活會(huì)將Raf或Raf/MEK異二聚體募集到質(zhì)膜，隨后Raf和MEK組裝瞬時(shí)四聚體，通過背對(duì)背二聚化促進(jìn)Raf的激活[30]。Raf一旦被激活，就會(huì)對(duì)217和221位MEK1/2上絲氨酸殘基進(jìn)行磷酸化，進(jìn)一步導(dǎo)致Erk1/2的磷酸化[31]。本研究結(jié)果顯示，藍(lán)光組Ras、p-c-Raf/c-Raf、p-MEK1/2/MEK1/2、p-ERK1/2/ERK1/2及p-p38/p38均顯著高于對(duì)照組，說明氧化應(yīng)激導(dǎo)致了Ras、Raf、MEK1/2、Erk1/2、p38信號(hào)通路的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，這與以往的研究結(jié)果一致[32-33]。研究表明，UV誘導(dǎo)的Erk1/2-MAPK的激活是通過ROS的生成介導(dǎo)的[34]，ROS在激活Erk1/2-MAPK信號(hào)通路中起核心作用[35]。而MSE在有效降低藍(lán)光誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞中ROS含量的同時(shí)，顯著降低了Ras蛋白以及Raf、MEK1/2、Erk1/2、p38磷酸化蛋白的表達(dá)。這說明MSE可能是通過抑制ROS介導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)來保護(hù)藍(lán)光誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞損傷。

綜上，MSE對(duì)藍(lán)光誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞損傷具有顯著的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與改善細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)，抑制MAPK信號(hào)通路有關(guān)，然而藍(lán)光誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞損傷是否經(jīng)由鐵死亡途徑誘發(fā)，MSE能否在調(diào)節(jié)MAPK信號(hào)通路的基礎(chǔ)上進(jìn)一步通過核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）/胱氨酸/谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白溶質(zhì)載體家族7成員11（solute carrier family 7 member 11，SLC7A11，也稱為xCT）信號(hào)通路減輕ARPE-19細(xì)胞鐵死亡有待進(jìn)一步研究。本課題組將在今后繼續(xù)圍繞Nrf2/xCT信號(hào)通路結(jié)合分子對(duì)接技術(shù)對(duì)MSE中的藥效物質(zhì)成分展開研究，深入探討MSE基于調(diào)控Nrf2/xCT信號(hào)通路保護(hù)ARPE-19防治視疲勞的作用機(jī)制。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mechanism of moxa smoke extract on attenuating blue light induced ARPE-19 cell injury based on MAPK signaling pathway

CHEN Ru-yi, HUANG Yan, XU Wen-jing, ZHAO Xin-yu, XIA Dao-zong

School of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China

To investigate the effect and mechanism of moxa smoke extract (MSE) on blue light-induced ARPE-19 cells injury.ARPE-19 cells were cultured, and effect of MSE at different concentrations (0.25, 0.50, 1.00, 2.00, 4.00, 5.00, 10.00, 50.00, 100.00, 150.00 μg/mL) on viability of ARPE-19 cells was detected by CCK-8 method. Control group, control + MSE high-dose group, blue-light group, blue-light + lutein group, blue-light + MSE low-dose group and blue-light + MSE high-dose group were set. Blank medium was added to control group and blue light group, and corresponding drug-containing medium was added to the other four groups, after intervention for 24 h, except for control group and control + MSE high-dose group, all groups were stimulated under blue light (430 nm, 96.1 W/m2) for 1 h. After ARPE-19 cell injury model was established, integrity of plasma membrane was detected by lactate dehydrogenase (LDH) method; Morphological changes of cells were observed by inverted fluorescence microscope; Intracellular reactive oxygen species (ROS) level were detected by flow cytometry species; Kits were used to detect intracellular oxidative stress indicators malondialdehyde (MDA), glutathione (GSH) levels and glutathione peroxidase (GSH-Px), catalase (CAT) and superoxide dismutase (SOD) activities; Western blotting was used to detect mitogen-activated protein kinases (MAPK) signaling pathway-related proteins expressions.Compared with control group, MSE (0.25—4.00 μg/mL) had no significant effect on viability of ARPE-19 cells. Compared with blue light group, MSE significantly reduced LDH activity in culture supernatant (< 0.01), alleviated the damage of plasma membrane and cell morphological changes, regulated key proteins expressions of MAPK signaling pathway such as Ras, phosphorylated c-Raf (p-c-Raf), phosphorylated extracellular regulated protein kinase 1/2 (p-Erk1/2), phosphorylated mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase 1/2 (p-MEK1/2) and p-p38 MAPK (< 0.05, 0.01), regulated intracellular SOD, CAT, GSH-Px activities and GSH, MDA, ROS levels (< 0.05, 0.01), and improved the oxidative stress response of ARPE-19 cells.MSE may protect ARPE-19 cells from blue light-induced oxidative stress injury by regulating the expression of ROS-mediated MAPK signaling pathway-related proteins.

moxa smoke extract; ARPE-19 cells; blue light; oxidative stress; mitogen-activated protein kinases signaling pathway

R285.5

A

0253 - 2670(2022)11 - 3376 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.11.013

2022-02-09

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（82074085）；浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（LY21H280006）

陳如一（1996—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幩幚韺W(xué)。Tel: 15700068486 E-mail: 498996135@qq.com

夏道宗，博士生導(dǎo)師，教授，主要從事中藥藥理學(xué)研究。Tel: (0571)86633361 E-mail: xiadaozong@zcmu.edu.cn

[責(zé)任編輯 李亞楠]