弭寶彬 謝玲玲 張竹青 肖 偉 周火強

（湖南省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所， 長沙 410125）

冬瓜（(Thunb.) Cogn., 2n=24） 是葫蘆科重要蔬菜作物，其營養(yǎng)豐富，兼具藥用和保健功效，是健康的高鉀低鈉食品。冬瓜耐貯運性好、貨架期長、產(chǎn)量高，已成為調(diào)節(jié)市場周年均衡供應的主要蔬菜之一。種質(zhì)資源是性狀研究和育種的重要材料，盡管我國是冬瓜的次生起源中心，但經(jīng)多年的栽培和選擇，造成冬瓜遺傳基礎比較狹窄。誘變可快速獲得大量突變體，甲基磺酸乙酯（ethyl methane sulfonate，EMS）是一種負面效應較小的高效烷化誘變劑，誘變效率較高，常用于種質(zhì)資源的創(chuàng)制。湖南省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所冬瓜課題組利用EMS誘變冬瓜高世代（6代）自交純合系‘DZ163’，在M代中獲得一系列突變體，并構建了國內(nèi)第一個冬瓜EMS突變體庫。將突變體材料自交純合2代后得到4個穩(wěn)定遺傳的材料，分別是瓜長變短、瓜色變淺（高類黃酮）、植株整株黃化（溫敏黃化）、多卷須。這一系列的突變材料，為研究冬瓜重要性狀遺傳規(guī)律、基因快速定位克隆及功能研究提供了重要的材料基礎，同時也為新品種的選育提供基因資源。

1 瓜長變短突變體

篩選獲得果實瓜長變短突變體，經(jīng)多代自交，獲得穩(wěn)定遺傳的突變體M-13（圖1）。瓜長變短突變體與野生型冬瓜對比發(fā)現(xiàn)，在瓜長度、瓜橫徑、瓜瓤腔及單瓜質(zhì)量等果實品質(zhì)方面存在極顯著性差異（＜ 0.01）。將瓜長變短突變體與野生型冬瓜材料‘DZ163’進行雜交，獲得了F代后代，自交后獲得F群體以及BCP和BCP等6世代遺傳分析群體。F群體性狀不分離，瓜長長度為中親值偏長，F(xiàn)群體正常瓜長和短瓜比例符合3∶1的分離比 （= 2.073），回交群體1∶1分離（= 0.417），說明瓜 長變短性狀受單基因隱性核基因控制。利用BSA和KASP基因分型技術獲得了冬瓜變短候選基因。

圖1 突變體（Mut）與野生型（WT）瓜型差異

2 瓜色變淺（高類黃酮）

經(jīng)自交4代后篩選獲得瓜色變淺（高類黃酮含量）性狀突變單株（圖2），對瓜色變淺的突變體與野生型進行正交、反交構建 F代遺傳分析群體，同時對其F分別進行雙親回交構建回交群體。通過遺傳群體的性狀調(diào)查和卡方檢測，發(fā)現(xiàn) F代群體瓜色正常與瓜色變淺3∶1分離（= 0.091），回交群體1∶1分離（= 0.033），符合孟德爾獨立遺傳規(guī)律，表明瓜色變淺性狀為單隱性核基因控制性狀。

圖2 冬瓜果實野生型“WT”（左）和突變型“Mut”（右）

3 植株黃化突變（溫敏黃化）

黃化突變體M-7在整個生育前期表現(xiàn)為黃色，后期從底部慢慢恢復（圖3），通過光合特征測定及葉片透射電鏡觀察，突變體葉綠素含量低于野生型，葉綠體數(shù)量也少于野生型，光合特征和葉綠體超微結構與野生型差異明顯。此外，該突變體黃化性狀受溫度影響較大，隨著栽培溫度增高，植株表型由黃色轉變?yōu)辄S綠色至淺綠色，趨于與野生型顏色一致，為研究溫敏型植株黃化提供了良好的材料。遺傳分析表明該突變體黃化性狀為核基因單基因隱性遺傳，利用BSA和KASP基因分型技術獲得了植株黃化候選基因。

圖3 黃化突變體植株（Mut）和野生型（WT）的表型差異

4 多卷須突變體

將篩選的多卷須突變體進行M代自交，獲得穩(wěn)定遺傳的突變體。多卷須突變體與野生型植株對比發(fā)現(xiàn)，正常卷須為每節(jié)間著生一節(jié)，兩分叉或三分叉，而突變體每節(jié)著生卷須4-5節(jié)，且分叉達到6-7次（圖4），植株卷須的生長會耗費大量營養(yǎng)，多卷須突變體的生長勢比野生型較弱，單瓜重較輕，收獲指數(shù)下降。多卷須突變體與野生型冬瓜材料‘DZ163’進行雜交，獲得了F代后代，F(xiàn)代自交后獲得F群體以及BCP和BCP等6世代遺傳分析群體。F群體性狀不分離，卷須發(fā)育正常，F(xiàn)群體正常卷須和多卷須比例符合3∶1的分離比（= 2.073），說明多卷須性狀受單基因隱性核基因 控制。

圖4 野生型與多卷須突變體形態(tài)結構差異 （左野生型WT，右突變體Mut）

5 討論

利用誘變技術進行資源創(chuàng)新、育種是一種行之有效的方法。誘變方法主要分為生物誘變、物理誘變和化學誘變，化學誘變法是利用各種化學試劑進行誘變，這些化學誘變劑可高效的產(chǎn)生多種遺傳物質(zhì)突變類型，得到多種變異類型，主要包括烷化劑、疊氮化物、亞硝基化合物和抗生素等。甲基磺酸乙酯（ethyl methanesulfonate, EMS）是一種單功能烷化劑，是植物誘變中最常用的高效化學誘變劑之一，由于其在體內(nèi)可以轉變成缺電子的活潑中間產(chǎn)物，容易與堿基上的N原子和磷酸基團發(fā)生親核取代反應，使DNA結構改變，因此被廣泛用作優(yōu)質(zhì)作物新材料創(chuàng)制的化學誘變劑。EMS化學誘變技術已經(jīng)在甜瓜、小麥、水稻、玉米、 西瓜、黃瓜等多種作物上取得理想的誘變效果，獲得了一些基因型改變的作物，對作物功能基因組學研究和新品種創(chuàng)制及擴大選育起著重要的推動作用。

瓜長變短突變體是研究果實性狀重要的突變材料之一。冬瓜果實發(fā)育分為不同的時期，可分為子房發(fā)育期、細胞分裂期和細胞膨大期這三個階段。果實大小，受果實長度、果橫徑及果形指數(shù)等影響，果實形狀一定程度上由子房的形狀決定，并影響果實發(fā)育過程的長度和橫徑等，早期的細胞分裂活動決定了細胞數(shù)量，進而影響果實的大小與重量。冬瓜果實形態(tài)豐富多樣，作為重要的瓜類蔬菜，果實性狀一直是冬瓜育種研究的重點，而果實形狀亦是評價冬瓜外觀品質(zhì)的一個重要指標。但在實際生產(chǎn)中，畸形瓜、果實長度過短或過長以及果形不一致等影響商品品質(zhì)的問題時常發(fā)生。要解決這些現(xiàn)實問題，需要對影響果實形態(tài)建成的重要基因進行克隆，并且對調(diào)控果實發(fā)育的分子機制進行深入研究，研究冬瓜果形建成機制，不僅為冬瓜或葫蘆科果形發(fā)育研究提供理論參考，也可促進冬瓜等葫蘆科作物育種工作。

瓜色變淺突變體的表型鑒定發(fā)現(xiàn)，在生長發(fā)育階段中，突變體的莖、葉及花的顏色均淺于野生型親本材料。多項物質(zhì)含量測定結果表明，突變體果實表皮類黃酮含量顯著高于野生型，而其類胡蘿卜素含量及濃度均無顯著差異。利用MutMap及dCASP基因分型技術初步定位了冬瓜瓜色變淺（高類黃酮）候選基因。果皮顏色是由相對復雜的遺傳機制控制，為高度可變的數(shù)量性狀，主要取決于類黃酮、花色苷和葉綠素的含量和組成。開展果皮顏色調(diào)控的研究，定位和克隆相關調(diào)控果皮顏色的候選基因，揭示果皮顏色的形成及其基因互作網(wǎng)絡，分析其作用機制，不僅有助于選育多樣的冬瓜品種，促進冬瓜品種多樣化研究，同時還可以為解析果實發(fā)育及其代謝物提供理論依據(jù)，因而具有重要的產(chǎn)業(yè)和科學意義。

植物的光合作用能力和效率取決于光合色素的生物合成和葉綠體的發(fā)育。葉色形成與葉綠體發(fā)育和光合色素密切相關。近年來，已經(jīng)在高等植物中鑒定了許多葉色突變體，如白菜、小麥、谷子等，它們是研究光合色素的生物合成和用于高光合效率的選擇性育種材料。目前，關于冬瓜黃化突變的基因尚未被克隆，控制冬瓜植株黃化性狀的分子機制研究知之甚少，不同溫度脅迫下冬瓜植株葉綠體發(fā)育的分子機制未見報道。分析溫敏黃化基因的表達調(diào)控機制對研究葉綠體發(fā)育分子機理、改良光高效優(yōu)異種質(zhì)資源，降低雜交種子生產(chǎn)成本具有重要意義。

卷須是瓜類蔬菜及其他攀援類植物具有的一種線狀結構的特殊器官，通過螺旋狀生長纏繞到其他物體上，為植株提供攀援的能力，從而使攀援植物能生長到更廣泛的地方，以獲得更多的生存空間，提高光合作用效率，促進傳花授粉等。在人工栽培冬瓜等葫蘆科作物時, 主要通過人工綁蔓來進行精細管理，為了減少生能量的浪費， 避免給管理帶來困難，常將卷須摘除。合理株型是高產(chǎn)品種的基礎形態(tài)特征，株型改良是作物品種的改良的一個重要方面，培育完全沒有卷須的冬瓜品種，是冬瓜株型改良育種的重要方向之一。

瓜長變短的分子調(diào)控機理解析能為冬瓜和葫蘆科作物在果形調(diào)控提供理論參考，也可為冬瓜育種提供基因資源，目前利用此資源配制的中長型（65 cm）出口型冬瓜組合表現(xiàn)優(yōu)異，為緩解目前市場缺少該類型優(yōu)良冬瓜品種的現(xiàn)狀提供選擇。瓜色變淺（高類黃酮含量）突變體，為揭示果皮顏色的形成及基因互作網(wǎng)絡，并分析作用機制提供研究材料，對選育目標果皮顏色和豐富冬瓜品種類型具有重要的產(chǎn)業(yè)和科學意義。整株黃化突變體對研究溫度調(diào)控葉綠體的發(fā)育、改良光高效優(yōu)異種質(zhì)資源等方面具有重要意義。多卷須突變體可為采用基因編輯創(chuàng)制沒有卷須的冬瓜新種質(zhì)提供基因資源。

優(yōu)良品種是冬瓜產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要的支撐，而種質(zhì)資源是育種工作的基礎。然而，相對于其他蔬菜作物，冬瓜材料遺傳背景較窄，嚴重的限制了冬瓜新材料的創(chuàng)制和優(yōu)質(zhì)資源的擴大選育。采用EMS誘變冬瓜，可獲得一系列點突變的種質(zhì)資源，使之出現(xiàn)新的性狀，在短時間內(nèi)獲得大量的變異材料，大大豐富已有的冬瓜種質(zhì)資源，加快冬瓜育種進程，是創(chuàng)制冬瓜新資源、選育新品種和開展遺傳研究的有效途徑。