李倩倩　張釗　胡浩　郁金泰　譚蘭

[摘要] 目的 評估骨橋蛋白（OPN）是否可以作為阿爾茨海默?。ˋD）的早期生物標(biāo)志物。方法 根據(jù)臨床診斷和生物標(biāo)志物水平，將納入人群分為AD組、輕度認(rèn)知功能障礙（MCI）+β-淀粉樣蛋白（Aβ）陽性組（MCI Aβ+組）、MCI+Aβ陰性組（MCI Aβ-組）、認(rèn)知正常（CN）+Aβ陽性組（CN Aβ+組）及CN⁺Aβ陰性組（CN Aβ-組），利用協(xié)方差分析比較OPN的組間差異。應(yīng)用相關(guān)性分析檢驗非癡呆人群（包括MCI及CN）腦脊液（CSF）中OPN與AD相關(guān)生物標(biāo)志物及海馬體積的相關(guān)性。結(jié)果 MCI Aβ⁺組和AD組病人CSF中OPN水平均顯著高于CN Aβ-組（H=15.473，P<0.01）。在橫向分析中，非癡呆人群CSF中OPN水平與Aβ₄₂水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.265，P<0.01），與總tau（t-tau）及磷酸化tau（p-tau）水平呈正相關(guān)（r=0.527、0.309，P<0.01）。在縱向分析中，非癡呆人群CSF中OPN水平與Aβ₄₂及海馬體積的變化率呈負(fù)相關(guān)（r=-0.129、-0.151，P<0.05），與t-tau和p-tau的變化率呈正相關(guān)（r=0.315、0.271，P<0.01）。結(jié)論 CSF OPN水平在AD早期階段升高，并且與AD早期病理改變相關(guān)，是AD潛在的早期生物標(biāo)志物。

[關(guān)鍵詞]骨橋蛋白質(zhì);阿爾茨海默病;生物標(biāo)記

[中圖分類號]R745.7 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號]2096-5532（2022）03-0383-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2022.58.052

ASSOCIATION BETWEEN CEREBROSPINAL FLUID OSTEOPONTIN AND ALZHEIMERS DISEASE

LI Qianqian， ZHANG Zhao， HU Hao， YU Jintai， TAN Lan

（Department of Neurology， Qingdao Municipal Hospital， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

[ABSTRACT] Objective To investigate whether osteopontin （OPN） can be used as an early biomarker for Alzheimers di-sease （AD）.?Methods Based on clinical diagnosis and levels of biomarkers， the subjects enrolled were divided into AD group， mild cognitive impairment （MCI）+β-amyloid （Aβ）-positive group （MCI Aβ⁺group）， MCI⁺Aβ^-negative group （MCI Aβ^-group）， cognitive normal （CN）+Aβ^-positive group （CN Aβ⁺group）， and CN+Aβ-negative group （CN Aβ^- group）， and a cova-riance analysis was used to compare the difference in OPN between groups. A correlation analysis was used to investigate the correlation of OPN in cerebrospinal fluid （CSF） with AD-related biomarkers and hippocampal volume in the non-dementia population （the population with MCI or CN）.?Results The MCI Aβ⁺group and the AD group had a significantly higher level of OPN in CSF than the CN Aβ^-group （H=15.473，P<0.01）. In the cross-sectional analysis of the non-dementia population， OPN level in CSF was negatively correlated with Aβ₄₂level （r=-0.265，P<0.01） and positively correlated with the levels of total tau （t-tau） and phosphorylated tau （p-tau） （r=0.527，0.309;P<0.01）. In the longitudinal analysis of the non-dementia population， OPN level in CSF was negatively correlated with the rates of change of Aβ₄₂and hippocampal volume （r=-0.129，-0.151;P<0.05） and was positively correlated with the rates of change in t-tau and p-tau （r=0.315，0.271;P<0.01）.?Conclusion There is an increase in the level of OPN in CSF in the early stage of AD， which is associated with early pathological changes of AD， and therefore， it can be used as a potential early biomarker for AD.

[KEY WORDS] osteopontin; Alzheimer disease; biomarkers

阿爾茨海默?。ˋD）是一種以腦脊液（CSF）蛋白（包括β-淀粉樣蛋白（Aβ）和tau蛋白）改變、進行性腦萎縮及認(rèn)知功能下降為特征的慢性神經(jīng)退行性疾病[1]。目前AD還沒有有效的治療藥物[2]。因此，應(yīng)加強AD癡呆的早期診斷和預(yù)測。骨橋蛋白（OPN）是一種細(xì)胞因子，參與多種生理和病理過程[3-5]。先前的研究結(jié)果顯示，OPN在人類及動物的AD中都起著重要的作用[6-7]。有動物研究結(jié)果顯示，不管是在基因還是蛋白水平上，APP/PS1KI小鼠的OPN水平均有顯著升高[8]。在AD小鼠腦組織中，OPN染色強度與Aβ負(fù)荷呈顯著正相關(guān)，OPN在AD病人大腦皮質(zhì)中的表達(dá)也顯著增加[6]。SIMONSEN等[9]使用CSF樣本進行蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果顯示，從輕度認(rèn)知功能障礙（MCI）進展到AD的病人OPN的磷酸化C末端片段水平比認(rèn)知狀態(tài)穩(wěn)定的病人高。上述研究均提示OPN參與了AD的發(fā)生和發(fā)展。然而，OPN與AD早期病理改變之間關(guān)系的研究較少。故本研究通過比較不同臨床診斷和生物標(biāo)志物水平人群OPN水平的差異，分析OPN與AD生物標(biāo)志物的相關(guān)性，來進一步探討OPN是否可以作為AD的早期生物標(biāo)志物。

1資料和方法

1.1數(shù)據(jù)來源

分析使用的數(shù)據(jù)來自ADNI數(shù)據(jù)庫（https：//adni.loni.usc.edu）。ADNI是一項縱向多中心研究，旨在探索開發(fā)用于AD早期診斷及病情監(jiān)測的臨床、影像表現(xiàn)和生物標(biāo)記物等，其參與者來自美國及加拿大的57個地區(qū)。ADNI獲得了所有參與機構(gòu)的地區(qū)倫理委員會的批準(zhǔn)，以及所有研究參與者的書面知情同意。本文研究對象來自ADNI-1隊列。

1.2研究對象及分組

本研究納入了同時含有CSF OPN（或者血漿OPN）、年齡、性別、受教育年限、診斷、APOE ε4攜帶狀態(tài)及CSF核心AD生物標(biāo)志物等信息的受試者，并在分析中采用平均值±3倍標(biāo)準(zhǔn)差的方法排除OPN值異常的受試者。根據(jù)CSF Aβ₄₂濃度將受試者分為Aβ陽性（Aβ₄₂≤192 ng/L）和Aβ陰性（Aβ₄₂>192 ng/L）組[10]。鑒于Aβ陰性的AD病人有誤診可能，將這部分人群也排除。最終納入的含有CSF OPN 數(shù)據(jù)的人群包括91例對照、149例MCI病人和65例AD病人;含有血漿OPN 數(shù)據(jù)的人群包括58例對照、194例MCI病人和98例AD病人;含有神經(jīng)影像學(xué)數(shù)據(jù)的人群包括82例對照及117例MCI病人。 根據(jù)臨床診斷和生物標(biāo)志物水平，將納入人群分為AD組、MCI+Aβ陽性組（MCI Aβ⁺組）、MCI+Aβ陰性組（MCI Aβ^-組）、認(rèn)知正常（CN）+Aβ陽性組（CN Aβ⁺組）及 CN+Aβ陰性組（CN Aβ^-組）。

1.3CSF及血漿生物標(biāo)志物檢測

CSF及血漿樣本根據(jù)ADNI生物標(biāo)志物核心實驗室標(biāo)準(zhǔn)操作程序進行處理、分裝和儲存。Aβ₄₂、總tau（t-tau）和磷酸化tau（p-tau）及OPN的檢測方法參見相關(guān)文獻(xiàn)[10]。本研究納入了基線及12、24、36、48和60個月時CSF中Aβ₄₂、t-tau和p-tau的檢測數(shù)據(jù)，并納入了CSF及血漿中OPN的基線檢測數(shù)據(jù)。

1.4海馬體積測量

使用1.5 T磁共振成像系統(tǒng)采集腦結(jié)構(gòu)圖像，使用freesurfer軟件 （https：//surfer.nmr.mgh.athe-rard.edu/）對腦體積進行量化[11]。本研究納入了基線及6、12、18、24、36、48、60和72個月時的檢測數(shù)據(jù)，所使用的數(shù)據(jù)為左右海馬的平均體積。

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用R軟件（版本3.5.3）來分析數(shù)據(jù)。分類變量的組間比較采用卡方檢驗;連續(xù)變量的組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗和協(xié)方差分析。在橫向分析（對基線數(shù)據(jù)進行分析）中，首先用Spearmans相關(guān)分析初步檢驗非癡呆人群（包括MCI及CN）CSF和血漿中OPN水平與CSF中Aβ₄₂、t-tau、p-tau水平及海馬體積的相關(guān)性，然后進行多元線性回歸分析，進一步檢驗OPN與CSF中Aβ₄₂、t-tau、p-tau水平和海馬體積的關(guān)系。在回歸分析中，連續(xù)反應(yīng)變量首先要經(jīng)Kolmogorov-Smirnov檢驗是否符合正態(tài)分布，如不符合正態(tài)分布，則通過Box-Cox變換來滿足近似正態(tài)性。在縱向分析中，使用線性混合模型計算非癡呆人群CSF中Aβ₄₂、t-tau、p-tau水平和海馬體積的縱向變化率，再進一步與OPN進行Spearmans相關(guān)分析。在進行協(xié)方差分析、回歸分析以及線性混合模型分析時均對年齡、性別、受教育程度、診斷和APOE ε4攜帶狀態(tài)進行校正。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組臨床資料比較

各組APOE ε4攜帶狀態(tài)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ²=84.924，P<0.01）。各組CSF中Aβ₄₂、t-tau、p-tau水平以及海馬體積比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（H=44.037～192.050，P<0.01）。MCI Aβ⁺和AD組病人CSF OPN水平均顯著高于CN Aβ-組（H=15.473，P<0.01）。各組年齡、性別及受教育程度比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

2.2各組CSF OPN比較

以CN Aβ-組為對照，將年齡、性別、受教育程度和APOE ε4攜帶狀態(tài)等研究表明與AD有關(guān)的因素納入到協(xié)方差分析中來調(diào)整混雜。結(jié)果顯示，AD及MCI Aβ⁺組CSF OPN水平均顯著高于CN Aβ-組（F=12.329、12.291，P<0.01），而MCI Aβ-及CN Aβ⁺組CSF OPN水平與CN Aβ-組比較差異無顯著性（P>0.05）。

2.3CSF OPN與核心AD生物標(biāo)志物的相關(guān)性

2.3.1橫向分析在非癡呆人群、MCI組及CN組中，CSF OPN與CSF t-tau水平均呈正相關(guān)（r=0.404～0.574，P<0.01）。在非癡呆人群以及MCI組中，CSF OPN均與CSF Aβ₄₂水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.265、-0.256，P<0.01），與CSF p-tau水平呈正相關(guān)（r=0.309、0.399，P<0.01）。但在CN組中，CSF OPN與CSF Aβ₄₂及CSF p-tau水平均無相關(guān)性（P>0.05）。

進一步的多元線性回歸分析顯示，非癡呆人群CSF中OPN與Aβ₄₂、t-tau和p-tau水平均顯著相關(guān)（β=-0.004、0.020、0.006，P<0.05）。亞組分析顯示，MCI組CSF中OPN與t-tau及p-tau水平顯著相關(guān)（β=0.025、0.013，P<0.01），而與Aβ₄₂水平無相關(guān)性（P>0.05）;CN組CSF中OPN與t-tau水平顯著相關(guān)（β=0.013，P<0.01），而與Aβ₄₂及p-tau水平無相關(guān)性（P>0.05）。

2.3.2縱向分析在非癡呆人群中，高的基線CSF OPN水平與CSF中p-tau和t-tau水平的快速升高相關(guān)（r=0.271、0.315，P<0.01），并且與CSF Aβ₄₂水平的快速下降相關(guān)（r=-0.129，P<0.05）。亞組分析顯示，MCI組高的CSF OPN水平與CSF中p-tau水平的快速升高相關(guān)（r=0.357，P<0.01）;CN組高的CSF OPN水平與CSF中Aβ₄₂水平的快速下降相關(guān)（r=-0.217，P<0.05），并與t-tau水平的快速升高相關(guān)（r=0.366，P<0.01）。

2.4血漿OPN與核心AD生物標(biāo)志物的相關(guān)性

在非癡呆人群中，血漿OPN的水平與CSF中Aβ₄₂、t-tau和p-tau的基線水平均無相關(guān)性（P>0.05），與CSF中p-tau、t-tau及Aβ₄₂的變化率也均無相關(guān)性（P>0.05）。

2.5OPN與海馬體積的相關(guān)性

橫向分析顯示，在非癡呆人群中，CSF和血漿中OPN水平與海馬體積均無相關(guān)性（P>0.05）;縱向分析顯示，CSF OPN水平的升高與海馬體積加速萎縮相關(guān)（r=-0.151，P<0.05），而血漿OPN水平與海馬體積變化無關(guān)（r=0.068，P>0.05）。

3討論

目前的醫(yī)療技術(shù)尚不能逆轉(zhuǎn)AD的疾病進程。近年來眾多關(guān)于AD疾病修飾治療藥物的臨床試驗最終也以失敗告終。與此同時，眾多的流行病學(xué)研究結(jié)果表明AD是可以預(yù)防的，可以通過利用保護因素并控制危險因素來降低疾病的發(fā)生率。因此，有助于AD早期診斷的生物標(biāo)志物對疾病防治有重要意義。業(yè)已證實，OPN參與了AD的發(fā)生及發(fā)展。本文研究結(jié)果顯示，AD和MCI Aβ⁺組的CSF OPN水平均明顯高于CN Aβ^-組。這與AD病人CSF OPN水平顯著高于CN組這一先前研究結(jié)果相一致[12-13]。提示CSF OPN水平增高可作為診斷或者識別AD高危人群的指標(biāo)。本研究及先前的一項研究均未顯示AD病人和對照組之間血清OPN濃度差異有顯著性[12]。然而，另一項研究表明，新近診斷AD病人的血漿OPN濃度顯著高于CN組[13]。這種不一致可能是由于血漿OPN更容易受到其他因素的影響，如骨重塑、傷口愈合、癌癥生物學(xué)反應(yīng)、血管紊亂和炎癥性疾病[14-15]。因此，血漿OPN與AD的關(guān)系需要更多的研究來進一步探討。

以往的研究表明，AD核心生物標(biāo)志物Aβ₄₂、p-tau和t-tau也是AD早期病理改變的生物標(biāo)志物，均已被納入到ATN診斷體系中[16]。因此，本研究探討了OPN與這些生物標(biāo)志物的關(guān)系，以進一步研究OPN是否參與AD的早期病理改變。本研究結(jié)果顯示，在非癡呆人群中，CSF OPN與CSF中Aβ₄₂、p-tau和t-tau水平顯著相關(guān)，提示CSF OPN與AD的早期病理改變相關(guān)。此外，縱向分析顯示，高的CSF OPN水平與CSF中t-tau和p-tau水平的加速升高以及CSF中Aβ₄₂水平的加速下降顯著相關(guān)。雖然之前并沒有類似的研究報道，但是先前的研究仍然可以為本研究提供證據(jù)支持。有動物研究表明，OPN在APP/PS1KI小鼠中表達(dá)上調(diào)[8];并且有研究發(fā)現(xiàn)，在AD模型中OPN是巨噬細(xì)胞參與Aβ清除的關(guān)鍵免疫調(diào)節(jié)因子[6]。此外，有尸檢研究結(jié)果顯示，OPN在AD病人大腦錐體神經(jīng)元中的表達(dá)增加[7]。還有研究結(jié)果顯示，從MCI進展到AD病人的CSF OPN表達(dá)增加[13]。上述研究表明，CSF OPN可能通過影響AD的早期病理改變參與AD的發(fā)生發(fā)展。

本文研究結(jié)果還顯示，在非癡呆人群中，基線CSF OPN水平與海馬萎縮的速率有關(guān)。先前有研究證實，通過MRI評估的腦萎縮是AD相關(guān)神經(jīng)變性的有效標(biāo)志[17]。CSF OPN水平與海馬體積的變化率呈負(fù)相關(guān)，提示CSF OPN促進AD相關(guān)神經(jīng)退行性變。綜合以上研究結(jié)果，CSF OPN可能通過參與Aβ和tau病理改變而影響海馬結(jié)構(gòu)。OPN影響AD發(fā)生的途徑很復(fù)雜，其確切的機制還有待進一步研究。

綜上所述，CSF OPN在AD早期階段水平升高，并且與AD早期病理改變相關(guān)，本研究進一步證明了CSF OPN是AD潛在的早期生物標(biāo)志物，具有監(jiān)測AD病理進展和判斷預(yù)后的潛力。該生物標(biāo)志物可能對AD臨床研究、藥物開發(fā)等具有一定的作用。

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（本文編輯馬偉平）