王冰菁　張惠琴　謝俊霞　王俊

[摘要] 目的 探討枸櫞酸鐵銨（FAC）對未分化MO3.13少突膠質(zhì)細(xì)胞鐵代謝相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。方法 將MO3.13細(xì)胞分為對照組和FAC組。對照組給予細(xì)胞培養(yǎng)液處理，F(xiàn)AC組用加入100 μmol/L FAC的細(xì)胞培養(yǎng)液處理。處理24 h后采用蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測兩組細(xì)胞轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1（TfR1）和鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（FPN1）的表達(dá)水平。結(jié)果 與對照組相比，F(xiàn)AC組細(xì)胞TfR1表達(dá)水平降低（t=2.695，P<0.05），F(xiàn)PN1表達(dá)水平無明顯變化（t=0.210，P>0.05）。結(jié)論 FAC可引起少突膠質(zhì)細(xì)胞TfR1表達(dá)降低，而FPN1表達(dá)不變。

[關(guān)鍵詞]鐵;少突神經(jīng)膠質(zhì);受體，轉(zhuǎn)鐵蛋白;轉(zhuǎn)鐵蛋白類

[中圖分類號]R338.2[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A[文章編號]2096-5532（2022）03-0367-03

doi：10.11712/jms.2096-5532.2022.58.100

EFFECT OF FERRIC AMMONIUM CITRATE ON THE EXPRESSION OF IRON METABOLISM-RELATED PROTEINS IN OLIGODENDROCYTES

WANG Bingjing， ZHANG Huiqin， XIE Junxia， WANG Jun

（Department of Physiology， School of Basic Medicine， Medical College of Qingdao University， Qingdao 266071， China）

[ABSTRACT] Objective To investigate the effect of ferric ammonium citrate （FAC） on the expression of iron metabolism-related proteins in undifferentiated MO3.13 oligodendrocytes.?Methods MO3.13 cells were divided into control group and FAC group. The cells in the control group were treated with a cell culture medium， and those in the FAC group were treated with the cell culture medium containing 100 μmol/L FAC. After treatment for 24 hours， Western blotting was used to measure the expression levels of transferrin receptor 1 （TfR1） and ferroportin 1 （FPN1） in both groups.?Results Compared with the control group， the FAC group had a significant reduction in the expression level of TfR1 （t=2.695，P<0.05） and had no significant change in the expression of FPN1 （t=0.210，P>0.05）.?Conclusion FAC can reduce the expression of TfR1 in oligodendrocytes， while the expression of FPN1 remains unchanged.

[KEY WORDS] iron; oligodendroglia; receptors， transferrin; transferrins

帕金森病（PD）被認(rèn)為是世界上第二常見的神經(jīng)退行性疾病，其主要病理特征是黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元的缺失[1]。近年來，隨著磁共振成像技術(shù)的進(jìn)步，越來越多的證據(jù)表明，PD病人黑質(zhì)中的鐵沉積增加[2-3]。鐵是一種過渡金屬，在生物圈中廣泛分布參與電子轉(zhuǎn)移的化學(xué)反應(yīng)，對正常細(xì)胞功能至關(guān)重要。在鐵、亞鐵和三價(jià)鐵之間的氧化還原循環(huán)存在于生命所必需的各種反應(yīng)中[4]。過量的鐵會產(chǎn)生有害的活性氧。在大腦中，鐵對于維持神經(jīng)組織的高代謝和能量需求至關(guān)重要，并且還參與髓鞘合成、神經(jīng)遞質(zhì)合成和代謝[5-6]。生成髓鞘的少突膠質(zhì)細(xì)胞維持著大腦中最高的鐵濃度[7-8]。少突膠質(zhì)細(xì)胞中含有大量的鐵結(jié)合蛋白，如鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白[9]。已有實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，在小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，高鐵引起二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1表達(dá)下調(diào)，鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（FPN1）表達(dá)上調(diào)[10]。然而高鐵環(huán)境對少突膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鐵代謝相關(guān)蛋白的影響目前仍不清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在探討枸櫞酸鐵銨（FAC）對MO3.13少突膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鐵代謝相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

MO3.13少突膠質(zhì)細(xì)胞購于上海拜力生物科技有限公司。DMEM高糖培養(yǎng)液、胎牛血清購于以色列BI公司，胰酶購于美國Hyclone公司，F(xiàn)AC購于美國Sigma公司，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1（TfR1）抗體和FPN1抗體均購于Abcam公司，HRP-IgG標(biāo)記的二抗購于Absin公司，BCA蛋白定量檢測試劑盒購于TherGmo公司，PVDF膜、ECL發(fā)光液均購于美國Millipore公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2實(shí)驗(yàn)分組及處理

將未分化的MO3.13少突膠質(zhì)細(xì)胞以6×10⁴/cm²密度接種于6孔板，每孔加入2 mL細(xì)胞混懸液培養(yǎng)。為了觀察鐵過載對TfR1和FPN1表達(dá)的影響，將細(xì)胞隨機(jī)分為對照組和FAC組。FAC組用加入100 μmol/L FAC的細(xì)胞培養(yǎng)液處理24 h，對照組用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液處理。

1.3蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測TfR1和FPN1蛋白表達(dá)

藥物處理結(jié)束以后，收集6孔板內(nèi)細(xì)胞蛋白，應(yīng)用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度，按照每孔總蛋白20 μg計(jì)算每個(gè)樣本的上樣量。蛋白經(jīng)電泳（80 V、30 min和120 V、90 min）、轉(zhuǎn)膜（300 mA、90 min）后，用100 g/L的脫脂奶粉室溫封閉1.5 h，再分別加入FPN1（1∶1 000）、TfR1（1∶1 000）和β-actin（1∶10 000）抗體，4 ℃搖床上孵育過夜，然后用TBST溶液洗膜3次（每次10 min），加入山羊抗兔（1∶10 000）的HRP-IgG二抗室溫孵育1 h，再用TBST溶液洗膜3次（每次10 min），以ECL發(fā)光液顯影后用Image J軟件分析條帶灰度值。結(jié)果以TfR1和FPN1與β-actin的灰度值比值表示。實(shí)驗(yàn)重復(fù)8次。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，結(jié)果以x±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有顯著性。

2結(jié)果

蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示，F(xiàn)AC組細(xì)胞TfR1表達(dá)水平明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.695，P<0.05），而兩組細(xì)胞FPN1表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.210，P>0.05）。見表1。

3討論

許多神經(jīng)退行性疾病的特點(diǎn)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)或周圍神經(jīng)系統(tǒng)特定區(qū)域的局部鐵積累[11]。鐵的積累最終可能超過鐵的儲存能力，從而氧化還原活性鐵促進(jìn)氧化應(yīng)激[12]。細(xì)胞內(nèi)鐵主要用于線粒體合成血紅素和鐵硫簇。鐵也參與DNA合成，核糖核苷酸還原酶是鐵依賴性酶，可在真核生物中催化脫氧核糖核苷酸的合成[13]。

少突膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘形成細(xì)胞，除了維持髓鞘的功能外，該細(xì)胞還維持軸突的完整性，支持軸突代謝，幫助神經(jīng)元存活[14-15]。神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞在許多方面都需要鐵，包括電子傳遞、還原型輔酶Ⅱ活性的維持、軸突髓鞘形成以及作為參與神經(jīng)遞質(zhì)合成的幾種酶的輔助因子[16]。細(xì)胞內(nèi)鐵含量主要取決于鐵吸收和釋放蛋白的表達(dá)，TfR1被認(rèn)為是少突膠質(zhì)細(xì)胞生存、生長和成熟的必要條件[17]。TfR1通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用介導(dǎo)細(xì)胞對鐵的攝取，并在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞中高度表達(dá)[18]。少突膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞通過FPN1途徑介導(dǎo)鐵外排[19]。參與腦細(xì)胞鐵輸出的蛋白質(zhì)缺失或表達(dá)減少可能導(dǎo)致大腦中鐵的過度積累和神經(jīng)退行性變，而FPN是哺乳動物中唯一已知的輸出細(xì)胞內(nèi)鐵的蛋白質(zhì)[20-21]。哺乳動物的鐵代謝受鐵調(diào)節(jié)蛋白（IRPs）的調(diào)節(jié)，IRPs表達(dá)降低，則TfR1表達(dá)降低，F(xiàn)PN1表達(dá)增加，反之亦然[22]。同時(shí)細(xì)胞FPN1的表達(dá)還受到鐵調(diào)素（hepcidin）的影響，hepcidin介導(dǎo)FPN1的細(xì)胞內(nèi)吞，hepcidin表達(dá)增加，則FPN1表達(dá)降低[23]。Hepcidin的表達(dá)主要由鐵或炎癥刺激誘導(dǎo)，鐵的攝入刺激hepcidin表達(dá)防止高鐵血癥和進(jìn)一步的膳食鐵吸收[24-25]。已有研究表明，在6-羥基多巴胺處理的小膠質(zhì)細(xì)胞中，二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1和IRP1表達(dá)增加，hepcidin表達(dá)降低，F(xiàn)PN1表達(dá)無明顯變化，F(xiàn)PN1無明顯變化可能與IRP1表達(dá)增加和hepcidin表達(dá)降低有關(guān)[26]。而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，未分化的MO3.13少突膠質(zhì)細(xì)胞用100 μmol/L FAC處理后TfR1蛋白表達(dá)下降，F(xiàn)PN1蛋白表達(dá)不變，F(xiàn)PN1蛋白表達(dá)不變可能與hepcidin表達(dá)增多和IRP1表達(dá)下降共同調(diào)節(jié)有關(guān)。

綜上所述，高鐵環(huán)境下少突膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)TfR1表達(dá)下降，F(xiàn)PN1表達(dá)不變，鐵轉(zhuǎn)入降低，鐵轉(zhuǎn)出不變，以防止細(xì)胞鐵聚集。本文結(jié)果為PD的治療提供了新的思路和靶點(diǎn)。

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（本文編輯馬偉平）