張靜嫻　陳蕾蕾　謝俊霞

[摘要] 目的 研究鐵過載試劑對(duì)過表達(dá)α-突觸核蛋白（α-syn）誘發(fā)iPC12細(xì)胞內(nèi)鈣離子增多的影響。方法 用多西環(huán)素（DOX）處理iPC12細(xì)胞48 h，誘導(dǎo)其高表達(dá)α-syn。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、DOX組、DOX+枸櫞酸鐵胺（FAC）組和DOX+去鐵胺（DFO）組。對(duì)照組用細(xì)胞培養(yǎng)液處理48 h;DOX組用DOX處理48 h;DOX+FAC組給予DOX預(yù)處理24 h后，用FAC處理24 h;DOX+DFO組給予DOX預(yù)處理24 h后，用DFO處理24 h。通過檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度評(píng)估細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)。結(jié)果 與DOX組相比，DOX+FAC組細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高（F=43.84，q=4.074，P<0.05），DOX+DFO組細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度無明顯變化（q=1.430，P>0.05）。結(jié)論 鐵過載可加劇α-syn過表達(dá)誘發(fā)的細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平升高。

[關(guān)鍵詞]鐵;α突觸核蛋白;PC12細(xì)胞;鈣

[中圖分類號(hào)]R338.2[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A[文章編號(hào)]2096-5532（2022）03-0361-03

doi：10.11712/jms.2096-5532.2022.58.102

EFFECT OF IRON ON INTRACELLULAR CALCIUM INCREASE IN IPC12 CELLS INDUCED BY OVEREXPRESSION OF α-SYNUCLEIN

ZHANG Jingxian， CHEN Leilei， XIE Junxia

（Institute of Brain Science and Diseases， Qingdao University， Shandong Provincial Key Laboratory of Pathogenesis and Prevention of Neurological Disorders， Shandong Provincial Collaborative Innovation Center for Neurodegenerative Disorders， Qingdao 266071， China）

[ABSTRACT] Objective To investigate the effect of the iron-overload reagent on intracellular calcium increase in iPC12 cells induced by the overexpression of α-synuclein （α-syn）.?Methods iPC12 cells were treated with doxycycline （DOX） for 48 h to induce the high expression of α-syn. In the experiment， cells were divided into control group， DOX group， DOX+ferric ammonium citrate （FAC） group， and DOX+desferrioxamine （DFO） group. The control group was treated with cell culture fluid for 48 h. The DOX group was treated with DOX for 48 h. The DOX+FAC group was treated with FAC for 24 h after DOX pretreatment for 24 h. The DOX+DFO group was treated with DFO for 24 h after DOX pretreatment for 24 h. Cellular calcium homeostasis was assessed by detecting the intracellular calcium concentration.?Results Compared with the DOX group， the intracellular calcium concentration in the DOX+FAC group was significantly increased （F=43.84，q=4.074，P<0.05）， and no significant change was found in the intracellular calcium concentration in the DOX+DFO group （q=1.430，P>0.05）.?Conclusion Iron overload can aggravate the increase in intracellular calcium concentration induced by the overexpression of α-syn.

[KEY WORDS] iron; alpha-synuclein; PC12 cells; calcium

作為全球第二位的神經(jīng)退行性疾病，帕金森?。≒D）病理特點(diǎn)是黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元丟失，且殘存的細(xì)胞內(nèi)存在以α-突觸核蛋白（α-syn）聚集體為主的路易小體并伴有鐵沉積[1-3]。研究表明，寬尖峰動(dòng)作電位、自主起搏電活動(dòng)、胞漿鈣振蕩和較低的鈣緩沖能力是黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元區(qū)別于其他神經(jīng)元的重要生理特征，而這種差異可能是PD黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元選擇性丟失的重要原因[4-5]。PD中鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)可以通過增加超氧化物和活性氧的產(chǎn)生使氧化應(yīng)激水平升高，而氧化應(yīng)激增加是PD中多巴胺能神經(jīng)元死亡的機(jī)制之一[6-8]。引起PD中鈣穩(wěn)態(tài)失衡可能與α-syn聚集和鐵沉積有關(guān)，但具體機(jī)制尚未完全闡明[9-11]。有研究顯示，聚集形式的α-syn和枸櫞酸鐵銨（FAC）均可以使原代神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)中鈣離子增加[9-12]。最近研究表明，經(jīng)錯(cuò)誤折疊后寡聚體形式的α-syn可使細(xì)胞膜完整性破壞，細(xì)胞內(nèi)鈣離子增多并誘發(fā)鐵死亡[11]。然而，鐵過載能否加劇α-syn誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)鈣離子增多這一過程，目前尚不清楚。本研究擬應(yīng)用多西環(huán)素（DOX）誘導(dǎo)iPC12細(xì)胞高表達(dá)α-syn，并在該細(xì)胞模型上探討FAC對(duì)過表達(dá)α-syn誘發(fā)iPC12細(xì)胞內(nèi)鈣離子增多的影響?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)所用的iPC12細(xì)胞系為穩(wěn)轉(zhuǎn)外源（人）SNCA（A53T）PC12細(xì)胞系，PC12細(xì)胞系是大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤分化細(xì)胞株;DMEM高糖培養(yǎng)液和胰蛋白酶購于Hyclone公司;胎牛血清購于依科賽公司;馬血清和GENETIXIN購于Gibco公司;FAC、去鐵銨（DFO）、鈣比色測(cè)定試劑盒和DOX均購于Sigma公司;潮霉素B購于賽默飛公司;磷酸酶抑制劑（04906837001）購于羅氏公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)非無菌器具均高壓滅菌烘干后使用。待所用培養(yǎng)液在37 ℃水浴鍋中預(yù)熱后，將液氮凍存的細(xì)胞取出，迅速放置在37 ℃水浴鍋中，快速搖晃至完全融開，將全部細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至10 mL已預(yù)熱的完全培養(yǎng)液中，吹打均勻后以1 000 r/min離心5 min。離心后棄上清液，用5 mL完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，然后轉(zhuǎn)移至25 cm3的培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶放在細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)（37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO₂）。每4～5 d傳代1次，傳代3次后以1×10⁸/L接種于六孔板中，每孔加2 mL完全培養(yǎng)液。細(xì)胞匯合度達(dá)70%～80%時(shí)進(jìn)行后續(xù)處理。

1.3實(shí)驗(yàn)分組及處理

為觀察鐵過載對(duì)iPC12細(xì)胞內(nèi)鈣離子的影響，將細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、DOX組、DOX+FAC組和DOX+DFO組。對(duì)照組用細(xì)胞培養(yǎng)液處理48 h，DOX組用2 mg/L的DOX處理48 h，DOX+FAC組細(xì)胞先給予2 mg/L的DOX處理24 h后再用100 μmol/L的FAC處理24 h，DOX+DFO組給予2 mg/L的DOX處理24 h后再用100 μmol/L的DFO處理24 h。

1.4細(xì)胞內(nèi)鈣離子測(cè)定

六孔板藥物處理完畢，負(fù)壓吸取上清后，使用0.01 mol/L的PBS潤(rùn)洗1次，吸凈液體，每孔加入100 μL細(xì)胞裂解液，置冰上裂解半小時(shí)后，用刮板盡可能將細(xì)胞刮下，并轉(zhuǎn)移至1.5 mL的EP管中，4 ℃下以12 000 r/min離心30 min后，吸取85 μL上清。鈣比色測(cè)定試劑盒平衡至室溫后，將標(biāo)準(zhǔn)品用雙蒸水稀釋至每孔0、0.4、0.8、1.2、1.6和2.0 μg。每孔加入待測(cè)樣本40 μL，然后用雙蒸水補(bǔ)足至體積50 μL。在標(biāo)準(zhǔn)品孔和待測(cè)樣本孔中分別加入90 μL顯色試劑，然后每孔加入60 μL鈣緩沖試劑，輕輕混勻后在37 ℃環(huán)境中避光孵育15 min。用酶標(biāo)儀（SpectraMax M5，Molecular Devices）在波長(zhǎng)575 nm處測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣本的吸光度值。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用Graph Pad Prism軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料結(jié)果以x±s表示，多組之間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1鐵過載對(duì)過表達(dá)α-syn誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)鈣離子增多的影響

對(duì)照組、DOX組和DOX+FAC組的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度分別為（0.192±0.007）、（0.237±0.005）和（0.292±0.017）mmol/L（n=3），3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=43.84，P<0.05）。與對(duì)照組相比較，DOX組細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=3.187，P<0.05）;與DOX組相比，DOX+FAC組細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度進(jìn)一步升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=4.074，P<0.05）。提示FAC可加劇過表達(dá)α-syn誘發(fā)的細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平升高。

2.2DFO對(duì)過表達(dá)α-syn誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)鈣離子增多的影響

對(duì)照組、DOX組和DOX+DFO組的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度分別為（0.192±0.007）、（0.237±0.005）和（0.216±0.020）mmol/L（n=3），3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=5.97，P<0.05）。與DOX組相比較，DOX+DFO組細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度無明顯變化（q=1.430，P>0.05）。提示DFO對(duì)過表達(dá)α-syn誘發(fā)的細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平升高無明顯影響。

3討論

鈣是細(xì)胞內(nèi)調(diào)控重要生命活動(dòng)的第二信使，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的低鈣濃度（100 nmol/L）是細(xì)胞信號(hào)中靈敏激活鈣級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵[13]。已有研究結(jié)果表明，PD中鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)可以通過增加α-syn聚集和線粒體氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷[6，14]。一方面，鈣除了調(diào)控α-syn分泌外，還可以與其C端結(jié)合，引起非淀粉樣成分結(jié)構(gòu)域變化，促進(jìn)β-折疊結(jié)構(gòu)形成，從而促進(jìn)α-syn聚集體的形成[14-15];另一方面，鈣信號(hào)可以通過增加超氧化物和活性氧的水平來破壞線粒體復(fù)合體Ⅰ和Ⅲ[16]。

鈣促進(jìn)α-syn聚集后，聚集的α-syn可以作用于細(xì)胞膜，導(dǎo)致鈣離子內(nèi)流，也可以引起細(xì)胞氧化損傷[11]。鐵沉積作為PD的顯著病理特征，不僅可以促進(jìn)α-syn聚集，還可以增加氧化應(yīng)激水平[17-18]。鐵過載在神經(jīng)元細(xì)胞上可以通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的Ryanodine受體，增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子的水平[12]。雖然α-syn聚集和鐵沉積分別會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平升高，但卻鮮有研究報(bào)道二者共同作用對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的影響。本研究結(jié)果表明，鐵過載可以加劇α-syn誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增高，但是鐵和α-syn共同作用引起鈣離子變化的機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果還表明，DFO對(duì)過表達(dá)α-syn誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣離子增多無明顯影響。推測(cè)這可能是由于DFO不能進(jìn)入細(xì)胞，無法有效阻斷鐵激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上Ryanodine受體引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子增多的過程。黑質(zhì)致密帶多巴胺能神經(jīng)元自主起搏電活動(dòng)主要依賴于L型鈣通道的Cav1.3亞型[19]。而且有文獻(xiàn)報(bào)道，早期PD病人大腦中Cav1.3/Cav1.2的表達(dá)比值增加[20]。由上述研究可知，L型電壓門控通道在PD的鈣穩(wěn)態(tài)失衡中至關(guān)重要。因此，接下來的研究可進(jìn)一步探索鐵和α-syn引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子增多時(shí)L型電壓門控通道的變化，這為后續(xù)研究PD中鈣穩(wěn)態(tài)失衡機(jī)制提供了新的思路。但PD中鈣穩(wěn)態(tài)失衡的具體機(jī)制以及PD中異常鈣離子如何流動(dòng)還有待進(jìn)一步研究探討。

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（本文編輯馬偉平）