劉玫秋　陳曦　姜宏

[摘要]目的 探討不同月齡A53T小鼠小腸組織中α-突觸核蛋白（α-syn）表達(dá)變化。方法 取3月齡和6月齡的野生型（WT）小鼠和A53T小鼠的小腸組織，利用蛋白免疫印跡法和免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)α-syn的表達(dá)水平。結(jié)果 與同月齡WT組小鼠相比，3月齡、6月齡A53T組小鼠小腸組織α-syn表達(dá)量顯著增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3.107、2.955，P<0.05）;6月齡A53T組小鼠小腸組織α-syn表達(dá)量比3月齡A53T組小鼠增加21.71%，兩組相比差異具有顯著性（F=2.836，P<0.05）。免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示，與同月齡WT組小鼠相比，A53T組小鼠小腸組織α-syn表達(dá)量顯著增高;6月齡A53T組小鼠小腸組織α-syn表達(dá)量明顯高于3月齡A53T組。結(jié)論 A53T小鼠小腸組織α-syn表達(dá)量高于同月齡WT小鼠，且其小腸組織α-syn表達(dá)量隨年齡增長(zhǎng)而增加。

[關(guān)鍵詞]帕金森病;α突觸核蛋白;小鼠，突變型;小腸

[中圖分類號(hào)]R338.7 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號(hào)]2096-5532（2022）03-0349-04

EXPRESSION OF α-SYNUCLEIN IN THE SMALL INTESTINE OF A53T MICE WITH DIFFERENT AGES IN MONTHS

LIU Meiqiu， CHEN Xi， JIANG Hong

（State Key Discipline： Physioloy （in Incubation）， Department of Physiology， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

[ABSTRACT] Objective To investigate the expression of α-synuclein （α-syn） in the small intestine of A53T mice with different ages in months.?Methods The small intestine tissue samples were collected from wild-type （WT） mice and A53T mice with an age of 3 and 6 months， and Western blotting and immunofluorescence assay were used to measure the expression level of α-syn.Results Compared with the WT mice with the same age， the A53T mice had a significant increase in the expression of α-syn in the small intestine （F=3.107，2.955;P<0.05）， and the expression level of α-syn was increased significantly by 21.70% in the A53T mice aged 6 months compared with those aged 3 months （F=2.836，P<0.05）. Immunofluorescence assay showed that compared with the WT mice with the same age， the A53T mice had a significant increase in the expression of α-syn in the small intestine， and the A53T mice aged 6 months had a significantly higher expression level of α-syn than those aged 3 months.?Conclusion A53T mice have a higher expression level of α-syn in the small intestine than WT mice with the same age， and the expression level of α-syn in the small intestine increases with age in A53T mice.

[KEY WORDS] Parkinson disease; alpha-synuclein; mice， mutant strains; intestine， small

帕金森?。≒D）是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，臨床表現(xiàn)主要包括靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩、肌強(qiáng)直和姿勢(shì)步態(tài)障礙等[1]。PD主要病理特征是黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元的進(jìn)行性喪失以及路易小體的出現(xiàn)。路易小體由異常聚集的α-突觸核蛋白（α-syn）所形成。α-syn是一種小分子酸性蛋白質(zhì)，主要表達(dá)于突觸前末端，在PD致病中的關(guān)鍵作用已被廣泛證實(shí)[2]。α-syn在細(xì)胞內(nèi)聚集，可促進(jìn)線粒體損傷，破壞溶酶體和高爾基體等，并增加細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的易感性，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞死亡[3-6]。

研究結(jié)果表明，PD病人非運(yùn)動(dòng)癥狀出現(xiàn)比運(yùn)動(dòng)癥狀提前10～20年，胃腸功能障礙是PD最常見的非運(yùn)動(dòng)癥狀，嚴(yán)重影響著病人的生活質(zhì)量[7-9]。根據(jù)BRAAK等[10-11]的學(xué)說(shuō)，α-syn的聚集可能始于外周（包括腸神經(jīng)系統(tǒng)），并由外周沿迷走神經(jīng)向中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳播。在PD的不同階段，α-syn在腸中的表達(dá)量可能會(huì)不同程度地影響胃腸功能。A53T小鼠是攜帶人A53T突變型α-syn基因的PD模型小鼠。在體內(nèi)，基因突變誘導(dǎo)的α-syn的高表達(dá)可導(dǎo)致路易小體的形成和黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的丟失[12-13]。純合子的A53T小鼠從6月齡開始表現(xiàn)出PD的運(yùn)動(dòng)癥狀，并表現(xiàn)出更早和更嚴(yán)重的胃腸運(yùn)動(dòng)功能下降。但是，在運(yùn)動(dòng)癥狀出現(xiàn)之前小鼠胃腸道中α-syn的表達(dá)是否已有改變尚不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)觀察了α-syn在3月齡和6月齡的A53T小鼠小腸中的表達(dá)變化。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

野生型（WT）小鼠購(gòu)于北京維通利華公司;A53T小鼠（B6;C3-Tg（PrnpSNCA*A53T）83Vle/J）購(gòu)自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所。兩種小鼠均按照SPF級(jí)別標(biāo)準(zhǔn)，飼養(yǎng)于溫度為（22±2）℃、濕度為（50±10）%、12 h晝夜循環(huán)光照的安靜環(huán)境中，可自由飲水、進(jìn)食。選用3月齡和6月齡A53T純合子轉(zhuǎn)基因小鼠和WT小鼠，每組4只。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑

α-syn抗體、Beta tubulin抗體購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology公司;NFH抗體購(gòu)于美國(guó)Santa公司;山羊抗兔和山羊抗鼠抗體購(gòu)于英國(guó)Thermo Fisher Scientific公司;PVDF膜、ECL發(fā)光液均購(gòu)于美國(guó)Millipore公司;山羊血清購(gòu)于中國(guó)Solarbio公司;DAPI染液購(gòu)于中國(guó)Roche公司;冷凍切片包埋劑購(gòu)于日本TaKaRa公司;Triton X-100購(gòu)于韓國(guó)Biosharp公司;Tween-20購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。

1.3蛋白免疫印跡法檢測(cè)小鼠小腸組織中α-syn蛋白表達(dá)

將小鼠麻醉后，取其鄰近十二指腸的空腸1 cm。向裝有小腸組織的EP管內(nèi)加入300 μL組織裂解液，用研磨器充分研磨，在冰上進(jìn)行裂解，靜置30 min后，在4 ℃下以1 200 r/min離心20 min，吸取上清置于新的EP管中，采用BCA法檢測(cè)蛋白濃度。按照每孔20 μg蛋白計(jì)算上樣量，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳（80 V、30 min，120 V、60 min）后，電轉(zhuǎn)到0.22 μm的PVDF膜上，加100 g/L脫脂奶粉于室溫?fù)u床孵育2 h;加入相應(yīng)的一抗（α-syn滴度為1∶1 000，Beta tubulin滴度為1∶10 000），4 ℃搖床孵育過(guò)夜（時(shí)間>16 h），用TBST溶液洗3次，每次10 min;分別加入山羊抗兔和山羊抗鼠（滴度均為1∶10 000）的HRP-IgG二抗并室溫孵育1.5 h，然后使用TBST溶液洗3次，每次10 min。ECL發(fā)光液顯影后用Image J軟件讀取條帶灰度值，對(duì)α-syn表達(dá)水平進(jìn)行分析。

1.4免疫熒光實(shí)驗(yàn)

取小鼠近十二指腸的空腸1 cm，放入40 g/L多聚甲醛內(nèi)浸泡1周，之后將小腸分別置于200 g/L和300 g/L蔗糖溶液中梯度沉糖。將沉糖處理后的小腸于冷凍切片機(jī)上切成15 μm厚的冷凍切片，并貼到多聚賴氨酸處理過(guò)的病理級(jí)別載玻片上，在常溫下晾干（24 h）。用0.01 mol/L的PBS清洗包埋劑，然后用體積分?jǐn)?shù)0.1的山羊血清封閉2 h;加入α-syn（滴度1∶250）和NFH（滴度1∶500）一抗4 ℃孵育過(guò)夜，用0.01 mol/L PBST溶液洗3次，每次10 min;分別加入山羊抗兔（滴度1∶500）和山羊抗鼠（滴度1∶500）的二抗并室溫孵育1.5 h，然后用0.01 mol/L PBST溶液洗3次，每次10 min。封片，加入體積分?jǐn)?shù)0.7的甘油后蓋上蓋玻片，晾干后進(jìn)行熒光觀察。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以x±s表示，不同月齡WT小鼠和A53T小鼠小腸組織α-syn表達(dá)比較采用析因設(shè)計(jì)的方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1不同月齡WT和A53T小鼠小腸組織α-syn表達(dá)比較

蛋白免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，與同月齡WT組小鼠相比，3月齡、6月齡A53T組小鼠小腸組織α-syn表達(dá)量顯著增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3.107、2.955，P<0.05）;6月齡A53T組小鼠小腸的α-syn表達(dá)量比3月齡A53T組小鼠增加21.71%，兩組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2.836，P<0.05）。說(shuō)明A53T小鼠小腸組織α-syn的表達(dá)遠(yuǎn)高于WT小鼠，6月齡A53T小鼠小腸組織α-syn的表達(dá)高于3月齡A53T小鼠。見表1。

2.2免疫熒光檢測(cè)不同月齡WT和A53T小鼠小腸組織α-syn表達(dá)

免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與同月齡WT組小鼠相比，3月齡、6月齡A53T組小鼠小腸組織α-syn表達(dá)量顯著增高;6月齡A53T組小鼠小腸組織α-syn表達(dá)量明顯高于3月齡A53T組小鼠。見圖1。

3討論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)蛋白免疫印跡和免疫熒光方法證實(shí)，與同月齡的WT小鼠相比較，3月齡和6月齡A53T小鼠小腸組織α-syn表達(dá)顯著增加，且隨年齡的增長(zhǎng)，A53T小鼠小腸組織α-syn的表達(dá)增加。

PD是一種多系統(tǒng)受累的神經(jīng)退行性疾病，其臨床癥狀不僅包括運(yùn)動(dòng)癥狀，還包括便秘、胃排空延遲、唾液分泌過(guò)多、吞咽困難、惡心以及嗅覺(jué)障礙、抑郁和睡眠障礙等非運(yùn)動(dòng)癥狀[8]。其中，胃腸道功能障礙是PD發(fā)展過(guò)程中一種常見非運(yùn)動(dòng)癥狀[14]。2003年，BRAAK等的學(xué)說(shuō)認(rèn)為，腸道中的α-syn可向中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳播，最初傳播到舌咽和迷走神經(jīng)背側(cè)運(yùn)動(dòng)核以及嗅球，隨后逐漸傳播到中腦黑質(zhì)區(qū)，最終達(dá)到皮質(zhì)層[15]。由于在PD病人的疾病早期已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了腸道中α-syn的異常沉積，故推測(cè)腸神經(jīng)系統(tǒng)可能是α-syn的一個(gè)起始病理位點(diǎn)。α-syn主要位于Meissner和Auerbachs神經(jīng)叢的腸神經(jīng)元中[16-18]。最近的研究結(jié)果還表明，多種危險(xiǎn)因素可能單獨(dú)或共同導(dǎo)致α-syn在腸道表達(dá)的增加，例如腸道菌群、腸道炎癥和腸神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞功能障礙等[19-21]。了解腸道中的α-syn是如何開始聚集的，將有助于治療胃腸功能障礙，并可能有助于預(yù)防或延緩PD的發(fā)生和發(fā)展。

與PD相關(guān)的特異性遺傳突變首先發(fā)現(xiàn)于1997年，其中A53T點(diǎn)突變屬于常染色體顯性遺傳，該突變引起的PD通常具備早發(fā)性以及病情進(jìn)展迅速等特點(diǎn)[22-23]。α-syn第53位的丙氨酸被蘇氨酸替代后，能促進(jìn)可溶性的α-syn寡聚體或原纖維的形成，并可以作為種子促進(jìn)α-syn在神經(jīng)元之間的傳播。在轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，表達(dá)人突變型α-syn的A53T轉(zhuǎn)基因小鼠應(yīng)用最為廣泛。過(guò)度表達(dá)人A53T突變型α-syn的小鼠隨年齡增長(zhǎng)會(huì)表現(xiàn)出嚴(yán)重的運(yùn)動(dòng)障礙以及α-syn病[14，24]。研究發(fā)現(xiàn)，在A53T小鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元和脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的細(xì)胞質(zhì)中存在包裹體，包裹體中包含人α-syn和硝基化的α-syn，并且運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元在A53T小鼠中耗竭可達(dá)75%[13，25]。有研究通過(guò)檢測(cè)A53T純合子小鼠的食物攝入量、結(jié)腸動(dòng)力以及結(jié)腸和回腸環(huán)形肌的收縮活動(dòng)發(fā)現(xiàn)，3月齡純合子A53T小鼠的進(jìn)食量與非轉(zhuǎn)基因小鼠相比雖然無(wú)明顯變化，但腸道運(yùn)輸時(shí)間比非轉(zhuǎn)基因小鼠延遲2 h左右，同時(shí)結(jié)腸和回腸環(huán)形肌運(yùn)動(dòng)反應(yīng)幅度也明顯下降;6月齡純合子A53T小鼠的胃腸道運(yùn)輸功能逐漸降低，腸道運(yùn)輸時(shí)間延遲超過(guò)3 h，與此同時(shí)，結(jié)腸和回腸環(huán)形肌運(yùn)動(dòng)反應(yīng)幅度進(jìn)一步降低[26-27]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，3月齡A53T小鼠小腸組織α-syn的表達(dá)已經(jīng)較同月齡WT小鼠出現(xiàn)明顯增加，6月齡A53T小鼠小腸組織α-syn表達(dá)亦比3月齡A53T小鼠增加。這說(shuō)明小腸組織α-syn和PD的胃腸功能障礙可能存在聯(lián)系。A53T小鼠在3月齡出現(xiàn)結(jié)腸動(dòng)力障礙時(shí)，并未出現(xiàn)PD的運(yùn)動(dòng)癥狀，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中也未出現(xiàn)α-syn的病理性聚集，甚至到6月齡時(shí)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)也未有α-syn的病理性聚集[26]，但事實(shí)上此時(shí)腸道中的α-syn已經(jīng)增加。因此，腸內(nèi)α-syn的表達(dá)量可能作為PD的一項(xiàng)早期診斷指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為此提供了數(shù)據(jù)支持。

綜上所述，在未出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)癥狀的3月齡A53T小鼠小腸中組織有α-syn的表達(dá)增加，并且隨年齡增長(zhǎng)，A53T小鼠小腸組織α-syn表達(dá)也增加。

[參考文獻(xiàn)]

[1]KANSARA S， TRIVEDI A， CHEN S， et al. Early diagnosisand therapy of Parkinsons disease： can disease progression be curbed[J]？ Journal of Neural Transmission （Vienna， Austria：1996）， 2013，120（1）：197-210.

[2]DEHAY B， BOURDENX M， GORRY P， et al. Targeting α-synuclein for treatment of Parkinsons disease： mechanistic and therapeutic considerations[J].? The Lancet Neurology， 2015，14（8）：855-866.

[3]STEFANIS L， LARSEN K E， RIDEOUT H J， et al. Expression of A53T mutant but not wild-type alpha-synuclein in PC12 cells induces alterations of the ubiquitin-dependent degradation system， loss of dopamine release， and autophagic cell death[J].? The Journal of Neuroscience， 2001，21（24）：9549-9560.

[4]GOSAVI N， LEE H J， LEE J S， et al. Golgi fragmentation occurs in the cells with prefibrillar alpha-synuclein aggregates and precedes the formation of fibrillar inclusion[J].? The Journal of Biological Chemistry， 2002，277（50）：48984-48992.

[5]HSU L J， SAGARA Y， ARROYO A， et al. Alpha-synuclein promotes mitochondrial deficit and oxidative stress[J]. The American Journal of Pathology， 2000，157（2）：401-410.

[6]OSTREROVA N， PETRUCELLI L， FARRER M， et al. alpha-Synuclein shares physical and functional homology with 14-3-3 proteins[J].? The Journal of Neuroscience， 1999，19（14）：5782-5791.

[7]POIRIER A A， AUB? B， C?T? M， et al. Gastrointestinal dysfunctions in Parkinsons disease： symptoms and treatments[J].? Parkinsons Disease， 2016， 2016：6762528.

[8]LEE H M， KOH S B. Many faces of Parkinsons disease： non-motor symptoms of Parkinsons disease[J].? Journal of Movement Disorders， 2015，8（2）：92-97.

[9]STIRPE P， HOFFMAN M， BADIALI D， et al. Constipation： an emerging risk factor for Parkinsons disease[J]？ European Journal of Neurology， 2016，23（11）：1606-1613.

[10]BRAAK H， DEL TREDICI K， R?B U， et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinsons disease[J].? Neuro-biology of Aging， 2003，24（2）：197-211.

[11]BRAAK H， GHEBREMEDHIN E， R?B U， et al. Stages in the development of Parkinsons disease-related pathology[J].? Cell and Tissue Research， 2004，318（1）：121-134.

[12]KAHLE P J， NEUMANN M， OZMEN L， et al. Subcellular localization of wild-type and Parkinsons disease-associated mutant alpha-synuclein in human and transgenic mouse brain[J].? The Journal of Neuroscience： the Official Journal of the Society for Neuroscience， 2000，20（17）：6365-6373.

[13]LU J Q， SUN F Y， MA H， et al. Comparison between α-synuclein wild-type and A53T mutation in a progressive Par-kinsons disease model[J].? Biochemical and Biophysical Re-search Communications， 2015，464（4）：988-993.

[14]MARTINEZ-MARTIN P. The importance of non-motor disturbances to quality of life in Parkinsons disease[J].? Journal of the Neurological Sciences， 2011，310（1-2）：12-16.

[15]RIETDIJK C D， PEREZ-PARDO P， GARSSEN J， et al. Exploring Braaks hypothesis of Parkinsons disease[J].? Frontiers in Neurology， 2017，8：37.

[16]ZHONG C B， CHEN Q Q， HAIKAL C， et al. Age-dependent alpha-synuclein accumulation and phosphorylation in the ente-ric nervous system in a transgenic mouse model of Parkinsons disease[J].? Neuroscience Bulletin， 2017，33（5）：483-492.

[17]WANG W W， SONG N， JIA F， et al. Genomic DNA levels of mutant alpha-synuclein correlate with non-motor symptoms in an A53T Parkinsons disease mouse model[J].? Neurochemistry International， 2018，114：71-79.

[18]WANG L， MAGEN I， YUAN P Q， et al. Mice overexpres-sing wild-type human alpha-synuclein display alterations in colonic myenteric ganglia and defecation[J].? Neurogastroentero-logy & Motility， 2012，24（9）：e425-e436. doi：10.1111/j.1365-2982.2012.01974.x.

[19]SCHEPERJANS F， AHO V， PEREIRA P A B， et al. Gut microbiota are related to Parkinsons disease and clinical phenotype[J].? Movement Disorders， 2015，30（3）：350-358.

[20]DEVOS D， LEBOUVIER T， LARDEUX B， et al. Colonic inflammation in Parkinsons disease[J].? Neurobiology of Di-sease， 2013，50：42-48.

[21]CLAIREMBAULT T， LECLAIR-VISONNEAU L， NEUNLIST M， et al. Enteric glial cells： new players in Parkinsons disease[J]？ Movement Disorders， 2015，30（4）：494-498.

[22]HIGUCHI S， ARAI H， MATSUSHITA S， et al. Mutation in the alpha-synuclein gene and sporadic Parkinsons disease， Alzheimers disease， and dementia with lewy bodies[J].? Experimental Neurology， 1998，153（1）：164-166.

[23]LOTANKAR S， PRABHAVALKAR K S， BHATT L K. Biomarkers for Parkinsons disease： recent advancement[J].? Neuroscience Bulletin， 2017，33（5）：585-597.

[24]MARTIN L J. Parkinsons disease-synuclein transgenic mice develop neuronal mitochondrial degeneration and cell death[J].? Journal of Neuroscience， 2006，26（1）：41-50.

[25]LUK K C， LEE V M. Modeling Lewy pathology propagation in Parkinsons disease[J].? Parkinsonism & Related Disorders， 2014，20（Suppl 1）：S85-S87.

[26]ROTA L， PELLEGRINI C， BENVENUTI L， et al. Constipation， deficit in colon contractions and alpha-synuclein inclusions within the colon precede motor abnormalities and neurodegeneration in the central nervous system in a mouse model of alpha-synucleinopathy[J].? Translational Neurodegeneration， 2019，8：5.

[27]CHAUDHURI K R， HEALY D G， SCHAPIRA A H. Non-motor symptoms of Parkinsons disease： diagnosis and ma-nagement[J].? The Lancet Neurology， 2006，5（3）：235-245.

（本文編輯馬偉平）