王仕穎　孫崇崇　鄭丹雯　王曉雯　陳文芳

[摘要]目的 探討寶藿苷Ⅰ對1-甲基-4-苯基吡啶離子（MPP⁺）誘導SH-SY5Y人神經母細胞瘤細胞損傷保護作用及雌激素受體（ER）特異性阻斷劑ICI 182，780的阻斷效應。方法 將SH-SY5Y細胞接種于96孔板，用不同濃度（0.01、0.10、1.00、10.00、20.00 μmol/L）寶藿苷Ⅰ預保護24 h，加1 mmol/L MPP⁺作用24 h，用四甲基偶氮唑藍（MTT）法檢測細胞存活率。將SH-SY5Y細胞分為對照組、MPP⁺組、MPP⁺+寶藿苷Ⅰ組、MPP⁺+寶藿苷Ⅰ+ICI 182，780組和寶藿苷Ⅰ組，用免疫印跡法檢測各組細胞SymbolaA@-突觸核蛋白表達。結果0.10、1.00 μmol/L寶藿苷Ⅰ能夠對抗MPP⁺誘導的SH-SY5Y細胞存活率降低，而10.00和20.00 μmol/L寶藿苷Ⅰ會加重細胞的損傷（F=51.070，q=5.453～13.650，P<0.01）。與對照組比較，MPP⁺組α-突觸核蛋白表達明顯上調（F=7.913，q=5.709，P<0.01）;0.10 μmol/L寶藿苷Ⅰ預保護能明顯降低MPP⁺誘導的α-突觸核蛋白表達上調（q=3.485，P<0.05），此作用可以被ICI 182，780阻斷（q=4.350，P<0.05）;單獨應用寶藿苷Ⅰ對α-突觸核蛋白的表達無明顯影響。結論 寶藿苷Ⅰ能夠抑制MPP⁺誘導的SH-SY5Y細胞損傷，其機制可能與ER信號途徑有關。

[關鍵詞]寶藿苷Ⅰ;1-甲基-4-苯基吡啶;受體，雌激素;細胞保護;神經母細胞瘤

[中圖分類號]R338.2 [文獻標志碼]A [文章編號]2096-5532（2022）03-0337-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2022.58.120

PROTECTIVE EFFECT OF BAOHUOSIDE Ⅰ AGAINST SH-SY5Y CELL DAMAGE INDUCED BY 1-METHYL-4-PHENYLPYRIDINIUM

WANG Shiying， SUN Chongchong， ZHENG Danwen， WANG Xiaowen， CHEN Wenfang

（Department of Phy-siology and Pathophysiology， School of Basic Medicine， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

[ABSTRACT] Objective To investigate the protective effect of baohuoside Ⅰ against human neuroblastoma SH-SY5Y cell damage induced by 1-methyl-4-phenylpyridinium （MPP⁺） and the blocking effect of ICI 182，780， a specific estrogen receptor （ER） blocker.

Methods SH-SY5Y cells were inoculated into 96-well plates， pre-protected with different concentrations of baohuoside Ⅰ （0.01， 0.10， 1.00， 10.00， and 20.00 μmol/L） for 24 h， and then treated with 1 mmol/L MPP⁺for another 24 h， and MTT assay was used to measure cell viability. SH-SY5Y cells were divided into control group， MPP⁺group， MPP⁺+baohuoside Ⅰ group， MPP⁺+baohuoside Ⅰ+ICI 182，780 group， and baohuoside Ⅰ group， and Western blotting was used to measure the protein expression of α-synuclein in each group.Results Baohuoside Ⅰ at the concentrations of 0.10 and 1.00 μmol/L exerted a protective effect against the MPP⁺-induced reduction in SH-SY5Y cell viability， while baohuoside Ⅰ at the concentrations of 10.00 and 20.00 μmol/L aggravated cell damage （F=51.070，q=5.453-13.650，P<0.01）. Compared with the control group， the MPP⁺group had a significant increase in the protein expression of α-synuclein （F=7.913，q=5.709，P<0.01）， while pre-protection with 0.10 μmol/L baohuoside Ⅰ significantly inhibited the upregulation of α-synuclein induced by MPP⁺（q=3.485，P<0.05）， which was blocked by ICI 182，780 （q=4.350，P<0.05）， and baohuoside Ⅰ treatment alone had no significant effect on the protein expression of α-synuclein.

Conclusion Baohuoside Ⅰ can inhibit MPP⁺-induced SH-SY5Y cell damage， which may be associated with the ER signaling pathway.

[KEY WORDS] baohuosideⅠ;? 1-methyl-4-phenylpyridinium;? receptors， estrogen; cytoprotection; neuroblastoma

帕金森病（PD）是第二大常見的神經退行性疾病，主要病理表現(xiàn)為黑質致密部多巴胺（DA）能神經元的選擇性死亡[1]。研究結果表明，SymbolaA@-突觸核蛋白（SymbolaA@-synuclein）的過表達和錯誤折疊與PD的發(fā)展密切相關，它在病理狀態(tài)下易聚集形成不溶性的纖維蛋白沉淀，導致神經元變性死亡[2]。淫羊藿是一種傳統(tǒng)中草藥，在中國被廣泛用于治療骨質疏松癥、補腎壯陽、改善學習記憶功能等[3-5]。寶藿苷Ⅰ是淫羊藿的主要藥理活性成分之一，多項研究已經證實寶藿苷Ⅰ具有豐富的藥理作用，如抗腫瘤、抗骨質疏松等[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)，寶藿苷Ⅰ可以通過抗氧化減輕大鼠的神經元損傷，還能夠通過雌激素受體（ER）抑制破骨細胞的分化和骨的吸收[8-9]。但是寶藿苷Ⅰ對DA能神經元的損傷是否具有保護作用尚未見報道。本研究應用1-甲基-4-苯基吡啶離子（MPP⁺）損傷人神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞，探討寶藿苷Ⅰ對MPP⁺誘導神經細胞損傷的保護作用及其可能機制?，F(xiàn)將結果報告如下。

1材料與方法

1.1實驗材料

實驗所用SH-SY5Y細胞購自中國科學院上海細胞庫;寶藿苷Ⅰ購自上海同田生物技術有限公司，用二甲基亞砜（DMSO）配制成0.10 μmol/L溶液;MPP⁺購自Sigma公司，用磷酸鹽緩沖液配制成濃度10 mmol/L的溶液;ER特異性阻斷劑ICI 182，780購自Sigma公司;四甲基偶氮唑藍（MTT）購自Duchefa公司;DMEM高糖培養(yǎng)液和胎牛血清購自BI公司;青霉素/鏈霉素儲存液購自北京索萊寶科技有限公司;PAGE凝膠快速制備試劑盒購自雅酶公司;兔抗α-synuclein抗體和兔抗β-actin抗體購自CST公司;山羊抗兔IgG-HRP二抗購自雅酶公司;ECL發(fā)光液購自Vazyme公司。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng)SH-SY5Y細胞分別接種于96孔板和6孔板內，加入含體積分數(shù)0.10胎牛血清、100 kU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液，在37 ℃、體積分數(shù)0.05 CO₂條件下進行培養(yǎng)。

1.2.2MTT方法檢測細胞活力該實驗分為對照組（A組）、MPP+組（B組）、MPP++0.01 μmol/L寶藿苷Ⅰ組（C組）、MPP++0.10 μmol/L寶藿苷Ⅰ組（D組）、MPP++1.00 μmol/L寶藿苷Ⅰ組（E組）、MPP++10.00 μmol/L寶藿苷Ⅰ組（F組）、MPP++20.00 μmol/L寶藿苷Ⅰ組（G組）。將SH-SY5Y細胞接種于96孔板，用不同濃度寶藿苷Ⅰ（前2組不用寶藿苷Ⅰ處理，后5組寶藿苷Ⅰ濃度分別為0.01、0.10、1.00、10.00、20.00 μmol/L）處理24 h，再加1 mmol/L 的MPP⁺（對照組除外）作用24 h，棄掉96孔板內的培養(yǎng)液，加5 g/L的MTT 20 μL，置37 ℃培養(yǎng)箱內孵育4 h;再將MTT輕輕吸出，每孔加入100 μL的DMSO溶解沉淀，室溫避光搖床孵育10 min，待沉淀完全溶解后，用酶標儀讀取光密度值，計算細胞存活率，根據(jù)細胞存活率篩選出寶藿苷Ⅰ的最佳用藥濃度。

1.2.3免疫印跡法（Western blot）檢測α-synuclein的表達用6孔板培養(yǎng)細胞，該實驗分為對照組、MPP⁺組、MPP⁺+寶藿苷Ⅰ組、MPP++寶藿苷Ⅰ+ICI 182，780組、寶藿苷Ⅰ組。對照組和MPP+組的細胞分別給予體積分數(shù)0.001的DMSO和1 mmol/L 的MPP⁺處理;MPP⁺+寶藿苷Ⅰ組細胞先應用0.10 μmol/L的寶藿苷Ⅰ預保護24 h，再給予1 mmol/L的MPP⁺作用24 h;MPP++寶藿苷Ⅰ+ICI 182，780組先應用1.00 μmol/L的ICI 182，780處理1 h，再給予寶藿苷Ⅰ和MPP⁺處理;寶藿苷Ⅰ組給予0.10 μmol/L寶藿苷Ⅰ作用48 h。藥物處理細胞后，棄去細胞培養(yǎng)液，每孔加入裂解液（lysis∶PMSF=99∶1）100 μL，冰上裂解30 min后用細胞刮刮下蛋白，收集至1.5 mL的EP管中。在4 ℃下以12 000 r/min離心20 min，離心后取上清80 μL，使用BCA法測蛋白濃度。每組取15 μg蛋白上樣并進行電泳，電泳完成后轉膜，轉膜條件為300 mA、90 min。應用50 g/L脫脂奶粉將膜封閉1 h，加入α-synuclein、β-actin一抗，4 ℃搖床孵育過夜，再加入HRP標記山羊抗兔IgG二抗孵育1 h，使用ECL發(fā)光液顯影檢測。應用Image J軟件進行分析，目的蛋白的表達以α-synuclein與β-actin灰度值的比值表示。

1.3統(tǒng)計學處理

應用Graph Pad Prism 5.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理。實驗數(shù)據(jù)以x±s形式表示，多組比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），并應用Newman-Keuls法進行兩兩比較。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1不同濃度寶藿苷Ⅰ對MPP+誘導的細胞存活率的影響

MTT檢測結果顯示，各組細胞存活率比較差異有顯著性（F=51.070，P<0.01）。組間兩兩比較，應用MPP⁺處理后，SH-SY5Y細胞存活率明顯下降（q=3.751，P<0.05）;0.10、1.00 μmol/L寶藿苷Ⅰ可有效對抗MPP⁺誘導SH-SY5Y細胞存活率下降（q=5.549、5.453，P<0.01），且寶藿苷Ⅰ在0.10 μmol/L時效果最顯著;而10.00和20.00 μmol/L的寶藿苷Ⅰ則會加重MPP+誘導的細胞損傷（q=6.408、13.650，P<0.01）。故選用0.10 μmol/L的寶藿苷Ⅰ進行后續(xù)實驗。見表1。

2.2寶藿苷Ⅰ對MPP⁺誘導的SH-SY5Y細胞α-synuclein蛋白表達的影響

Western blot結果顯示，各組細胞α-synuclein蛋白表達比較差異有顯著性（F=7.913，P<0.01）。組間兩兩比較，與對照組相比，MPP⁺組SH-SY5Y細胞中α-synuclein蛋白表達水平明顯增高（q=5.709，P<0.01）;而MPP⁺+寶藿苷Ⅰ組細胞中α-synuclein蛋白表達水平較MPP⁺組明顯降低（q=3.485，P<0.05）;ICI 182，780預處理可以阻斷寶藿苷Ⅰ的神經保護作用（q=4.350，P<0.05）;寶藿苷Ⅰ單獨應用對α-synuclein蛋白的表達無明顯影響。見圖1。

3討論

PD主要的病理改變?yōu)槁芬仔◇w的堆積和黑質致密帶DA能神經元的變性死亡，其機制與α-synuclein的聚集有關[2，10-12]。Parkin蛋白通過與神經突觸素-1相互作用引起α-synuclein的泛素化，從而促進路易小體的形成[13]。研究表明，過度表達的α-synuclein可抑制囊泡內吞而影響神經傳遞過程，并且通過破壞DA的合成、儲存、回收、再攝取和流出而導致PD[14]。

近年來，大量研究已證實傳統(tǒng)中草藥活性成分可以改善PD模型的病理進程[15]。本課題組前期的工作已證實，淫羊藿主要活性成分淫羊藿苷、淫羊藿素可通過ER途徑發(fā)揮其對DA能神經元的保護作用。寶藿苷Ⅰ作為淫羊藿總黃酮的重要活性成分，具有多種藥理作用。在鵝膏蕈氨酸誘導的腦功能障礙大鼠模型中，寶藿苷Ⅰ可以通過絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號傳導對抗鵝膏蕈氨酸誘導的認知缺陷[16]。在過氧化氫（H₂O₂）誘導的高度分化的大鼠神經元PC12細胞模型中，寶藿苷Ⅰ通過減弱細胞內活性氧的產生、線粒體損傷和激活糖原合酶激酶-3β來抑制H₂O₂誘導的細胞死亡[17]。此外，在側腦室注射脂多糖所致急性神經炎癥的大鼠模型中，寶藿苷Ⅰ預處理不僅能抑制小膠質細胞和星形膠質細胞的活化，還可以通過抑制TOLL樣受體4（TLR4）/髓樣分化因子88（MyD88）/核因子κB（NF-κB）通路顯著逆轉多種炎癥因子的表達[18]。為探討寶藿苷Ⅰ對DA能神經元的保護作用及其機制，本研究利用MPP⁺誘導SH-SY5Y細胞損傷，觀察寶藿苷Ⅰ是否能發(fā)揮神經保護作用。結果顯示，0.10、1.00 μmol/L寶藿苷Ⅰ能明顯對抗MPP⁺對SH-SY5Y細胞損傷，而10.00、20.00 μmol/L寶藿苷Ⅰ對SH-SY5Y細胞具有毒性作用;0.10 μmol/L寶藿苷Ⅰ預保護可以顯著抑制MPP⁺誘導的α-synuclein表達上調。在本課題組前期的研究中，ER激動劑17β-雌二醇（E2）能夠明顯降低MPP+的毒性作用，但E2作為一種雌激素，長期使用可對人體產生嚴重的副作用。因此，從傳統(tǒng)中藥中尋找具有類雌激素樣作用且副作用相對更小的植物雌激素，對中國傳統(tǒng)中藥的推廣應用具有重要意義。已有研究表明，寶藿苷Ⅰ可以通過ER依賴性途徑在刺激大鼠骨肉瘤UMR-106細胞增殖、堿性磷酸酶活性和NF-κB受體活化因子配體基因表達等方面發(fā)揮與雌激素相似的骨保護作用[19]。為進一步探討寶藿苷Ⅰ神經保護作用是否與ER信號途徑有關，本研究觀察了ER特異性阻斷劑ICI 182，780對寶藿苷Ⅰ神經保護作用的阻斷效應，結果顯示寶藿苷Ⅰ對α-synuclein蛋白表達的抑制作用可被ICI 182，780所阻斷。以上結果表明，寶藿苷Ⅰ通過激活雌激素信號途徑抑制MPP+誘導的α-synuclein蛋白表達上調，發(fā)揮保護DA能神經元的作用。

綜上所述，寶藿苷Ⅰ能夠抑制MPP⁺誘導的SH-SY5Y細胞損傷，其機制可能與ER信號途徑有關。本文結果為研究寶藿苷Ⅰ神經保護作用的靶點和可能機制提供了新的實驗依據(jù)。

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（本文編輯馬偉平）