張文云 張兵 羅劍芳 何健 容寶珊 艾勇 何廷剛 張藍月

探究由甘草苷、當歸、花椒、苦參、連翹、波爾多樹葉、齊墩果酸、二苯乙烯苷植物組合物對雄激素性脫發(fā)小鼠的改善效果。首先利用5 mg/kg 丙酸睪酮處理小鼠背部脫毛，建立脂溢性脫發(fā)模型，并將 C57BL/6J 小鼠隨機分為6組，即空白組、模型組、米諾地爾組、5%組合物組、15%組合物組、45%組合物組，分別在脫毛區(qū)涂抹相對應的處理物質。通過 HE 組織學觀察小鼠終毛與毳毛的比例，免疫組化測定皮膚中 TGF-β1和 TNF-α的含量， ELISA 測定皮膚組織中二氫睪酮和5ɑ-還原酶的含量。結果表明，相對于模型組，植物組合物都可以提高小鼠終毛/毳毛比例，降低小鼠體內 TGF-β1和 TNF-α的蛋白表達量和小鼠皮膚中二氫睪酮和5α-還原酶的含量。因此，該植物提取組合物對于雄激素性脫發(fā)有一定的緩解能力，能夠提高終毛/毳毛比例，可以為開發(fā)預防雄激素性脫發(fā)植物組合物的日用品提供一定理論指導。

關鍵詞：植物組合物；毛發(fā)生長；5ɑ-還原酶。

雄激素性脫發(fā)（androgenic alopecia， AGA），又稱為脂溢性脫發(fā)（Seborrheic alopecia， SA），是一種主要發(fā)病群體為20～40歲的男性，呈年輕化發(fā)展趨勢，備受關注[1，2]。AGA 發(fā)病表現為頭發(fā)密度進行性減少、頭發(fā)油膩、頭部皮膚瘙癢、多屑等，對患者的日常生活和思想情緒等造成嚴重影響。AGA 的產生是多種內在和外在因素共同作用的結果，其中主要因素是由家族遺傳易感染患病性和機體頭皮毛囊處局部雄激素（Testosterone，T） 與雌激素（Estrogen，E2） 的代謝平衡失調造成[3-5]。作用機理在目前的研究來看，T 是一種男性機體體內主要的雄性激素，在5α-還原酶介導代謝作用下生成二氫睪酮（Dihydrotestosterone，DHT），其中 T 和 DHT 都可與雄激素受體（Androgen receptor，AR） 結合，但 AR 與 DHT 的選擇結合性比 T 高，所以 AGA 與5α-還原酶活性有相當重要的關系，最后雄激素受體復合物進入到細胞核與染色質結合，使終毛向毫毛轉化的相關基因活化，大量分泌 TGF-β1和 TNF-α，進而誘發(fā)毛囊微型化，導致頭部發(fā)生脫發(fā)。從目前的研究發(fā)現它的發(fā)病機理與 T 及其代謝產物 DHT 濃度水平、頭部頭皮毛囊單位的Ⅱ型5ɑ-還原酶活性與數量和 AR 的活性水平有直接的相關性[6-10]。

針對誘發(fā)機理，在目前治療雄激素性脫發(fā)的手段主要是藥物治療和毛發(fā)移植。藥物治療的藥物類型主要有5ɑ-還原酶抑制劑、AR 阻斷劑、抗 T 藥、鉀離子通道開放劑和 E2類藥物等，但這些藥物很可能過分干擾機體正常分泌代謝物質，致使機體容易出現不良反應，常有一定程度的多毛癥、性功能障礙等，并且不能完全治愈，也無法誘導毛囊再生提高毛囊數量和生長能力[10]。因此尋找一種安全有效、副作用小、可以有效平衡頭部頭皮毛囊 T 與 E2的平衡、使用方便的植物提取物十分重要。我國中草藥眾多，其中當歸、苦參、齊墩果酸、二苯乙烯苷等中藥都有證實對 AGA 有一定的緩解效果[11-13]。所以本實驗建立小鼠雄激素性脫發(fā)模型，測試由甘草苷、當歸、連翹、苦參、花椒、波爾多樹葉、齊墩果酸、二苯乙烯苷組成的植物提取物對 AGA 的調控效果，并找出適合促進毛囊再生的植物提取物組合物，為緩解脫發(fā)的植物提取物的日用品的開發(fā)提供一定的理論指導。

1 材料和方法

1.1. 動物

鼠齡為5周齡的雄性 C57BL/6J 小鼠，60只，等級 SPF 級，體重位于22-24g，購于廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心，合格證號：SCXK（粵）20130034。

1.2.實驗耗材

中藥組合物（甘草苷、當歸、花椒、苦參、連翹、波爾多樹葉、齊墩果酸、二苯乙烯苷）、丙酸睪酮注射液（1 mL：25 mg，10支/盒）、5%米諾地爾酊（綿竹，四川美大康華康藥業(yè)有限公司），耳標、1 mL 射器（若干）、4%多聚甲醛、HE 試劑（無水乙醇、二甲苯、蘇木素-伊紅染液、組化液、氨水、性樹膠）、小鼠雙氫睪酮（DHT）ELISA 試劑盒（貨號 SMK3267A，江蘇酶標生物科技有限公司）、小鼠5α-還原酶（5AR） ELISA 試劑盒（貨號 SMK5986A，江蘇酶標生物科技有限公司）、Anti-TGFB1 Rabbit pAb（貨號 GB13028，免疫組化稀釋度1：50，武漢賽維爾生物科技有限公司）。

1.3.實驗分組、造模與涂抹

將60只 C57BL/6J 小鼠平均隨機分為6組，即空白組、模型組、米諾地爾組、5%組合物組、15%組合物組、45%組合物組。在造模前，適應性飼養(yǎng)所有小鼠于溫度

（23±2）℃，濕度（54±10）%的環(huán)境中，自由飲食、飲水一周。一周后進行造模，對空白組和非空白組的小鼠背部分別給予皮下注射生理鹽水和5mg/kg 丙酸睪酮，并持續(xù)4周，每天一次。

實驗給藥4周觀察小鼠毛發(fā)生長情況，建模成功后，進行后續(xù)實驗處理，在每只小鼠的背部皮膚上，模型組和空白組采取涂抹0.9%氯化鈉水溶液，米諾地爾組涂抹5%米諾地爾酊0.2mL/d，組合物組涂抹對應濃度的植物提取物組合物，每日1次，周期4周。

1.4.HE 組織學觀察

處理28天后，快速處死小鼠，取各組每只小鼠背部脫發(fā)區(qū)約1cm×1cm 大小的皮膚，置生理鹽水中充分漂洗殘余血液，鋪展于濾紙上，室溫晾干，用錫箔紙上包好放入裝有4%多聚甲醛溶液的離心管中進行組織固定。固定24至48小時后，將皮膚組織取出，依次放入75%、85%、90%、95%、100%乙醇和二甲苯1、二甲苯2中脫水。然后將皮膚組織置于包埋機中進行包埋，包埋后得到的蠟塊進行石蠟切片脫蠟、蘇木精-伊紅染色和脫水封片。在100倍顯微鏡視野下，平均3個不重疊的視野下，觀察小鼠毛囊形態(tài)學變化，利用 Image- Pro Plus 測量毛囊長度及其大小，統(tǒng)計生長期毛囊數量與休止期毛囊數量比值（A/T）。

1.5.免疫組化檢測對小鼠皮膚中TGF-β1和TNF-α的含量測試

每只小鼠取材2.0cm×0.8cm 長條狀皮膚，與1.4中相同方法處理皮膚組織，按照 Anti-TGFβ1 Rabbit pAb的使用方法進行免疫組化實驗來判斷小鼠皮膚中 TGF-β1和 TNF-α的表達情況。由于二氨基聯苯胺（DAB） 是辣根過氧化物酶（HRP） 的底物，在 HRP 的催化下，DAB 產生棕色沉淀。因此，可以通過觀察小鼠組織切片是否呈現棕色來判斷是否存在DHT 或5α-還原酶。使用 Image- Pro Plus 軟件測量免疫組化染色后的小鼠皮膚 tyrosinase、 VEGF、β-catenin 的 IOD 值，收集數據，計算其均值。

1.6.ELISA 測定皮膚組織中二氫睪酮（DHT）和5ɑ-還原酶的含量

將每只小鼠經解剖采集的小鼠組織，制備組織勻漿，按 ELISA 試劑盒說明書上的方法測定各組小鼠組織中 DHT 和5α-還原酶含量，記錄數據，求其均值。

1.7.統(tǒng)計學分析方法

采用 GraphPad Prism 繪制柱狀圖并用軟件中的單因素方差檢驗對數據進行顯著性比較，以 P<0.05，*表示有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1. 毛囊形態(tài)學觀察

與模型組對比，空白組視野內終毛占總發(fā)量較大，且毛囊密度較高，毳毛在視野中幾乎沒有，具有顯著性差異。與其他組對比，模型組總體毛囊密度小，數量少，毳毛占總毛發(fā)較多，表明造模成功。對于米諾地爾組，顯微視野中，終毛占總發(fā)量較大，毳毛占比較小。在各組合物組中終毛/毳毛值比值最高的是15%組合物組，毛囊密度高，視野里基本都是終毛，毳毛數量較少，具體見圖1，圖2。

2.2.小鼠皮膚中 TGF-β1和 TNF-α的含量

本實驗表明雄激素可誘導小鼠對應細胞合成及分泌 TGF-β1，導致小鼠體內的 TGF-β1的含量提高，致使小鼠頭部毛囊角質形成細胞表現出增殖受抑制作用的表現。分析本次實驗各組數據，如圖3，在經過造模后，與模型組對比，空白組中的 TGF-β1含量有了明顯的降低（P ＜0.01），隨后經過給藥實驗米諾地爾和5%組合物與模型組相比能夠極顯著抑制 TGF-β1的表達（P ＜0.01）。此外， 15%組合物組和45%組合物組也能顯著地抑制 TGF-β1的表達（P ＜0.05）。

本實驗表明雄激素可誘導小鼠對應細胞合成及分泌 TNF-α，導致小鼠體內的 TNF-α的含量提高，致使小鼠頭部毛囊角質形成細胞表現出增殖受抑制作用的表現。在經過造模后，與模型組對比，空白組中的 TNF-α含量有了明顯的降低（P ＜0.01），隨后經過實驗米諾地爾組、15%組合物和45%組合物與模型組相比能夠極顯著有效降低 TNF-α的表達（P ＜0.01）； 5%組合物組能顯著降低小鼠體內的 TNF-α含量（P ＜0.05），見圖4。

2.3.皮膚組織中 DHT 的含量研究

根據本次 ELISA 對皮膚組織中 DHT 的含量數據可知，經過造模以后，模型組、米諾地爾組和5%、15%、45%組合物組小鼠皮膚組織中的 DHT 含量與空白組相比較都有明顯升高；而給藥以后，米諾地爾組和5%、15%、45%組合物組小鼠皮膚組織中的 DHT 含量與模型組相比都有不同程度的下降，見圖5。

根據本次 ELISA 對皮膚組織中5α-還原酶的實驗數據可知，與模型組相比，空白組小鼠中5α-還原酶的濃度顯著降低（P ＜0.05）；與模型組相比，米諾地爾和5%和15%的低濃度組合物組緩解雄激素性脫發(fā)的效果但不存

在統(tǒng)計學差異，且這三組的緩解能力效果相當，改善并降低了5α-還原酶在小鼠頭部皮膚組織中濃度含量，而高濃度45%組合物組提高了小鼠皮膚組織中的5α-還原酶的含量，見圖6。

3討論

AGA 是由機體體內 T 與 E2 的平衡失調上升，大量T 在 5α- 還原酶介導作用下轉化為 DHT，進而致使大量DHT 與小鼠體內的 AR 結合，提高 TGF-β1 和 TNF-α 的蛋白表達，誘發(fā)小鼠毛囊微型化，導致頭部發(fā)生脫發(fā)，甚至是永久性脫發(fā) [14-19]。所以本研究將測定小鼠毛囊生長情況和體內的 TNF-α、TGF-β1、DHT 和 5α- 還原酶的濃度情況來評價該天然植物提取組合物對小鼠的雄激素脫發(fā)的藥物緩解效果。

本實驗探究通過向小鼠注射睪酮進而誘導小鼠建立雄激素脫發(fā)模型，并采取 HE 組織學觀察，發(fā)現終毛占比低，毛囊密度減少，表明小鼠模型建立成功（P<0.01）。實驗結果顯示，通過毛囊形態(tài)學觀察可知，相對于模型組，各濃度組合物組都能夠有效改善睪酮導致的毛囊減小和減少現象，提高小鼠終毛/毳毛的比例，其中15%組合物組比其他兩組的預防緩解效果更好。從分子水平觀察實驗數據，相對于模型組，組合物組小鼠體內 TGF-β1的含量下降情況，各濃度組合物組都有一定緩解效果（5%組合物組，P<0.01；其他處理組，P<0.05），明顯具有顯著性差異，且對比米諾地爾組，5%組合物組表現出的緩解效果更好。在 TNF-α的含量濃度下降研究中，相對于模型組，各濃度組合物組表現出良好的預防緩解效果（5%組合物組，P<0.05；其他處理組，P<0.01），具有顯著性差異，能夠有效地大量降低小鼠體內的 TNF-α含量，其中45%組合物組相對于米諾地爾組和其他組合物組表現緩解病癥效果更好。在 ELISA 測定小鼠皮膚組織中 DHT 和5α-還原酶的含量實驗數據，相對于模型組，我們發(fā)現該低濃度天然植物提取組合物和對小鼠體內的 DHT 含量和5α-還原酶的含量水平有一定的下降效果，高濃度的組合物可以提高小鼠體內的 DHT 含量和5α-還原酶的含量水平，但與模型組相比無顯著性差異。

4結論

本實驗結果顯示由甘草苷、當歸、連翹、苦參、花椒、波爾多樹葉、齊墩果酸、二苯乙烯苷組成的組合物通過抑制小鼠皮膚細胞有關 TGF-β1和 TNF-α的蛋白代謝生成，進而抑制小鼠的終毛向毳毛轉化的相關基因活化，最終達到緩解雄激素性脫發(fā)的目的，與米諾地爾表現出的臨床表現類似，所以我們推測其和米諾地爾的作用機理有些許相似，比如增加局部血供，促進毛細血管開放等等，作用機制還需進一步研究。在運用方面，可以為研究針對雄激素脫發(fā)的天然植物洗發(fā)水方面提供理論參考。

參考文獻

[1]李榮群，卜夏威，景佐.中藥生發(fā)擦劑治療雄激素性脫發(fā)的實驗研究[J].中華中醫(yī)藥學刊，2013， 31（3）：552-554.

[2] Rousso DE， Kim SW. A review of medical and surgical treatment options for androgenetic alopecia[J]. JAMA Facial Plast Surg， 2014， 16（6）：444-50.

[3]孫建林，呂新翔.雄激素性脫發(fā)的發(fā)病機制與治療進展[J].內蒙古醫(yī)科大學學報，2020， 42（1）：106-108+112.

[4] Redlersilke，Messenger andrew G，Betz regina C. Genetics and other factors in the aetiologyof? female pattern hair loss[J]. Exp Dermatol， 2017， 26：510-517.

[5] Heilmann S， Kiefer AK， Fricker N， et al. Androgenetic alopecia： identification of four genetic risk loci and evidence for the contribution of WNT signaling to its etiology[J]. J Invest Dermatol， 2013， 133（6）：1489-96.

[6] Randall. Androgens and hair growth[J]. Dermatologic Therapy， 2010， 21（5）：314-328.

[7] Yip L， Rufaut N， Sinclair R. Role of genetics and sex steroid hormones in male androgenetic alopecia and female pattern hair loss： an update of what we now know[J]. Australas J Dermatol， 2011， 52（2）：81-8.

[8]左海峰，王遵來，葛超，等．整脊手法治療胸椎小關節(jié)紊亂研究進展[J]．風濕病與關節(jié)炎， 2016， 5（6）：69-72.

[9]周顯忠，陸周華．黃帝內經[M]．重慶：西南師范大學出版社，1993：.

[10] Kaufman KD. Androgen metabolism as it affects hair growth in androgenetic alopecia[J]. Dermatol Clin， 1996， 14：697-711.

[11] Huh S， Lee J， Jung E， et al. A cell-based system for screening hair growth-promoting agents[J]. Arch Dermatol Res， 2009， 301（5）：381-5.

[12] ?zkur E， Altunay K， Leblebici C， et al. Adalimumab-induced scalp psoriasis with severe alopecia[J]. Dermatol Ther， 2019， 32（5）：13033.

[13]付國強，馬鵬程.治療雄激素性脫發(fā)藥物的研究進展[J].國外醫(yī)學.皮膚性病學分冊，2000（2）：68-72.

[14]廖金鳳.齊墩果酸對小鼠雄激素性脫發(fā)治療作用的研究[D].瀘州醫(yī)學院，2013.

[15]楊頂權，劉云貞，鞠海，等.生發(fā)酊聯合當歸苦參丸治療雄激素源性脫發(fā)的臨床觀察[J].世界中西醫(yī)結合雜志，2010， 5（4）：327-329+332.

[16]劉仁毅.淺談脊柱骨錯縫理論及其臨床治療[J].實用中西醫(yī)結合臨床 ， 2005， （06）：62-63.

[17]張瑛．男性脫發(fā)癥病變毛囊與正常毛囊的差異性研究[D].上海：第二軍醫(yī)大學，2016.

[18] RIEDEL- BAIMA B， RIEDEL A. Female pattern hair loss may be triggered by low oestrogen to androgen ratio [J]. Endocrine Regulations， 2008， 42（1）：13-16.

[19]吳橋芳 ， 范衛(wèi)新.米諾地爾治療雄激素性禿發(fā)的機制和劑型研究進展[J].臨床皮膚科雜志 ， 2018， 47（02）：128-131.