官印瓏，周麗妍，王 輝，陳佳雨，明 建，李富華,*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，貴州 貴陽 550006）

國際糖尿病聯(lián)盟2019年的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，我國糖耐量受損人群位居世界第一。究其原因，可能是我國居民膳食精細(xì)化程度不斷提高，而膳食纖維的攝入量嚴(yán)重不足所致[1]。調(diào)查顯示僅有20%的國民達(dá)到膳食纖維的推薦攝入量[2]。研究發(fā)現(xiàn)，膳食纖維攝入量不足易引發(fā)肥胖癥、高血糖等慢性疾病[3-4]。

刺梨（Rosa roxburghiiTratt.）又稱刺莓果，因富含多種營養(yǎng)和生物活性物質(zhì)而成為藥食領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。刺梨果渣，作為刺梨加工的主要副產(chǎn)物，其優(yōu)質(zhì)膳食纖維含量占果實(shí)干質(zhì)量的23.8%、鮮質(zhì)量的4.2%，且該含量高于作為纖維來源食物3%的要求，屬于優(yōu)質(zhì)膳食纖維資源[5-6]。研究指出纖維原料中，可溶性膳食纖維（soluble dietary fiber，SDF）與不可溶性膳食纖維（insoluble dietary fiber，IDF）的質(zhì)量比接近1∶2時(shí)，可作為良好的食物添加劑，而刺梨果渣中SDF與IDF的含量比例滿足該要求[7-10]。因此，刺梨果渣膳食纖維的質(zhì)量極佳。目前有研究發(fā)現(xiàn)刺梨具有降低血糖的功能活性[11-12]。但刺梨果渣膳食纖維的降血糖活性以及經(jīng)物理改性后其結(jié)構(gòu)和活性的變化情況依然不清楚。

動(dòng)態(tài)高壓微射流（dynamic high pressure microfluidization，DHPM）作為一種以超高壓理論、流體力學(xué)理論、撞擊理論為基礎(chǔ)的新興高壓加工技術(shù)，在食品大分子的改性和超微化領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[13-14]。研究發(fā)現(xiàn)DHPM處理不僅可以改變膳食纖維的理化性質(zhì)如色澤、持水力、膨脹力、平均分子質(zhì)量和單糖組成等，還能夠改善膳食纖維的生理活性[15-18]。但在刺梨纖維改性后其理化性質(zhì)和降血糖功能之間的聯(lián)系依然有待挖掘。

因此，本研究重點(diǎn)探究刺梨果渣SDF與IDF的理化性質(zhì)和降血糖活性，以及DHPM改性處理對刺梨果渣SDF理化指標(biāo)和淀粉消化、葡萄糖擴(kuò)散調(diào)控作用的影響，為膳食纖維的DHPM改性處理在降血糖方面的應(yīng)用以及刺梨果渣的開發(fā)利用提供理論研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

刺梨果渣（含水率約10%）由貴州省生物技術(shù)研究所提供；耐高溫α-淀粉酶（活力≥20 000 U/mL）、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、胰淀粉酶（活力≥4 000 U/g）、3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）試劑、透析袋 南京都萊生物技術(shù)有限公司；葡萄糖 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氫氧化鈉、鹽酸、無水乙醇均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

高壓微射流納米均質(zhì)機(jī) 加拿大Microfluidics公司；FW100高速萬能粉碎機(jī) 天津泰斯特儀器有限公司；HR-1旋轉(zhuǎn)流變儀 美國TA公司；納米粒度及Zeta電位分析儀 英國馬爾文公司；全自動(dòng)比表面積及孔隙度分析儀 美國麥克默瑞提克公司；紫外-可見分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；F-2500熒光分光光度計(jì)日本日立公司；圓二色光譜儀 英國應(yīng)用光物理公司。

1.3 方法

1.3.1 膳食纖維提取

刺梨果渣經(jīng)FWl00高速萬能粉碎機(jī)粉碎后，過60～80 目篩后得到刺梨果渣粉，然后參考GB 5009.88ü2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中膳食纖維的測定》，提取膳食纖維。準(zhǔn)確稱取5.00 g刺梨果渣粉末于250 mL錐形瓶中，加入50 mL PBS（0.05 mol/L、pH 8.2）和25?μL?20 000 U/mL的耐高溫α-淀粉酶，95 ℃條件下水解40 min，所得水解液備用。在水解液中加入4 倍體積95%（體積分?jǐn)?shù)，下同）乙醇溶液，醇沉2 h后離心（3 000 r/min、10 min），沉淀物在55 ℃條件下熱風(fēng)烘干，即得全膳食纖維（total dietary fiber，TDF）。水解液經(jīng)離心（3 000 r/min、10 min）、過濾后收集濾液和濾渣，濾渣用70 ℃去離子水洗滌3 次，干燥后即得IDF；濾液中加入4 倍體積95%乙醇溶液，醇沉2 h后離心（3 000 r/min、10 min），離心所得沉淀物在55 ℃條件下熱風(fēng)烘干，即得SDF。

1.3.2 DHPM處理

DHPM處理參照文獻(xiàn)[18]并稍作修改。按料液比1∶25（m/V）將SDF樣品與0.05 mol/L pH 6.5的PBS充分混合均勻后進(jìn)行3 次高壓微射流納米均質(zhì)處理，上樣量為200 mL，壓力為100 MPa，處理后所得樣品即DHPM-SDF。

1.3.3 流變特性分析

用0.05 mol/L pH 6.5的PBS按照料液比1∶25（m/V）配制膳食纖維樣品分散體系，流變儀中上樣量為1 mL，選擇直徑25 mm的平板夾具進(jìn)行測量。間隙設(shè)置為50?μm，測定溫度為25 ℃。測試樣品溶液在剪切速率從0～100 s－1時(shí)的靜態(tài)剪切流變特性，結(jié)果以表觀黏度來表征。

1.3.4 平均粒徑測定

20 ℃條件下，以無水乙醇作為分散劑，配制質(zhì)量濃度為1 g/L的膳食纖維樣品懸浮液，攪拌均勻后，置于納米粒度及Zeta電位分析儀中測定平均粒徑，每個(gè)測試樣檢測3 次。

1.3.5 比表面積測定

采用全自動(dòng)比表面積及孔隙度分析儀測定樣品的比表面積。準(zhǔn)確稱量100 mg的膳食纖維樣品（IDF、SDF、TDF、DHPM-SDF），測試前經(jīng)80 ℃氮?dú)獯祾? h以除去吸附在樣品表面的水分。其中吸附使用氦氣為載氣，脫氣時(shí)間4 h。樣品吸附峰面積與已知比表面積的標(biāo)準(zhǔn)碳黑吸附峰面積對比，從而計(jì)算樣品的比表面積。

1.3.6 葡萄糖吸附能力測定

參照文獻(xiàn)[19]測定葡萄糖吸附能力。分別將1 g的膳食纖維樣品與100 mL 100 mmol/L葡萄糖溶液（以0.05 mol/L pH 6.5的PBS為溶劑）置于酶反應(yīng)器中混合均勻，以100 mL PBS為空白對照，以100 mL不含膳食纖維樣品的100 mmol/L葡萄糖溶液為葡萄糖對照組，37 ℃下反應(yīng)6 h。然后將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至離心管中，3 000 r/min離心15 min，取上清液，采用DNS法測定上清液中葡萄糖的濃度并換算為葡萄糖物質(zhì)的量。按式（1）計(jì)算葡萄糖吸附能力。

式中：m為膳食纖維纖維樣品質(zhì)量/g；n0為空白對照組的葡萄糖物質(zhì)的量/mmol；n1為樣品組葡萄糖物質(zhì)的量/mmol；n2為葡萄糖對照組的葡萄糖物質(zhì)的量/mmol。

1.3.7 抑制葡萄糖擴(kuò)散能力分析

膳食纖維抑制葡萄糖擴(kuò)散能力以葡萄糖透析延遲系數(shù)表示，參照文獻(xiàn)[20]進(jìn)行測定。分別將0.2 g膳食纖維樣品與10 mL 100 mmol/L葡萄糖溶液（溶劑為0.05 mol/L、pH 6.5的PBS）混勻后，裝入10 cm長的透析袋（直徑44 mm）中，透析液為200 mL蒸餾水，對照組為不含膳食纖維樣品的10 mL 100 mmol/L葡萄糖溶液，在37 ℃條件下透析5 h，分別在反應(yīng)30、60、90、120、150 min時(shí)，取一定量透析液，采用DNS法測定透析液中葡萄糖的濃度并換算為葡萄糖物質(zhì)的量，即不同條件下的葡萄糖擴(kuò)散能力，膳食纖維對葡萄糖透析延遲系數(shù)按式（2）計(jì)算。

式中：n0為對照組透析液中葡萄糖物質(zhì)的量/mmol；n1為樣品組透析液中葡萄糖物質(zhì)的量/mmol。

1.3.8 胰淀粉酶消化分析

胰淀粉酶消化分析參照文獻(xiàn)[20]。準(zhǔn)確稱取40 g馬鈴薯淀粉置于2 000 mL燒杯中，加入900 mL 0.05 mol/L pH 6.5的PBS，放入70 ℃水浴鍋中攪拌糊化30 min，最后加PBS定容至1 000 mL，得到40 g/L馬鈴薯淀粉溶液。量取10 mL馬鈴薯淀粉溶液（40 g/L），加入0.04 g胰淀粉酶，同時(shí)分別加入0.2 g SDF、IDF、TDF、DHPM-SDF混勻，裝入透析袋中，不添加膳食纖維提取物的混合體系為對照組。以200 mL蒸餾水為透析液，在37 ℃下透析3 h，分別在反應(yīng)時(shí)間為30、60、90、120、150 min時(shí)取一定量透析液，沸水浴加熱5 min，然后采用DNS法測定各透析液中葡萄糖物質(zhì)的量。

1.3.9 胰淀粉酶活力抑制分析

胰淀粉酶活力抑制分析參照文獻(xiàn)[20]。準(zhǔn)確量取50 mL馬鈴薯淀粉溶液（40 g/L），分別加入1.0 g膳食纖維提取物（IDF、SDF、TDF、DHPM-SDF）和4 mg胰淀粉酶，混勻，以不加膳食纖維的50 mL馬鈴薯淀粉溶液（含4 mg胰淀粉酶）為對照。在37 ℃下磁力攪拌反應(yīng)30 min，沸水浴加熱5 min。然后轉(zhuǎn)移至離心管中，3 500 r/min離心15 min，取上清液測定生成的葡萄糖物質(zhì)的量，分別按式（3）、（4）計(jì)算葡萄糖產(chǎn)生速率和淀粉酶活力抑制率。

式中：n0為對照組葡萄糖物質(zhì)的量/mmol；n1為樣品組葡萄糖物質(zhì)的量/mmol。

1.3.10 胰淀粉酶熒光猝滅分析

該APP是專門針對俄語專業(yè)四級備考而研發(fā)，內(nèi)含從2001年至2016年俄語專業(yè)四級考試的全部單選真題，針對性強(qiáng)。該APP的基本框架主要提供四個(gè)模式：背題模式、答題模式、針對練習(xí)、模擬考試，另外該APP還會(huì)提供專業(yè)詳細(xì)的解析和錯(cuò)題庫。錯(cuò)題庫可幫助用戶記錄錯(cuò)題并明確其知識薄弱點(diǎn)，然后進(jìn)行反復(fù)練習(xí)，從而提高做題正確率、鞏固知識體系。答題后錯(cuò)題收集歸檔，測評評分，統(tǒng)計(jì)不同板塊錯(cuò)題率，給出專項(xiàng)練習(xí)建議。該軟件不收取任何費(fèi)用，可以免費(fèi)下載（邱虹,王新萍,李軍，2018：18）。但該軟件依舊有不足之處，如在答題過程中不小心退出便只能重新開始學(xué)習(xí)該年份的真題。

胰淀粉酶熒光猝滅分析參照文獻(xiàn)[21]。用0.05 mol/L pH 6.5的PBS配制質(zhì)量濃度0.25 mg/mL的胰淀粉酶溶液，將10 mL的胰淀粉酶溶液分別與0.01 g的IDF、SDF、TDF、DHPM-SDF混勻，以不加膳食纖維樣品的10 mL胰淀粉酶液為對照，混合液在25 ℃下反應(yīng)30 min，然后沸水浴加熱5 min。3 500 r/min離心30 min，取上清液測定其中胰淀粉酶的熒光強(qiáng)度變化。熒光強(qiáng)度測定條件為：激發(fā)波長分別為280 nm和295 nm，熒光分光光度計(jì)的掃描速率為12 000 nm/min，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm，在波長范圍為300～500 nm內(nèi)記錄發(fā)射光譜，分辨率為2.0 nm。

1.3.11 胰淀粉酶的二級結(jié)構(gòu)分析

胰淀粉酶的二級結(jié)構(gòu)分析參照文獻(xiàn)[21]。用0.05 mol/L pH 6.5的PBS配制質(zhì)量濃度0.1 mg/mL的胰淀粉酶溶液。量取10 mL胰淀粉酶溶液置于離心管中，分別加入0.05 g IDF、SDF、TDF、DHPM-SDF，以不加膳食纖維樣品的10 mL胰淀粉酶液為對照，混勻后靜置5 min，過濾，取濾液進(jìn)行圓二色光譜分析。具體條件：分辨率為1 nm；掃描速率為100 nm/min；響應(yīng)時(shí)間為1 s；光柵狹縫為2 nm。胰淀粉酶對左、右旋圓偏振光的吸收率不同，測定其一定波長下吸光系數(shù)的差值Δε。通過Chirascan軟件對近紫外圓二色光譜圖進(jìn)行分析，計(jì)算α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲的相對含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Origin 8.0軟件作圖，采用SPSS 22軟件進(jìn)行單因素方差分析，通過Duncan’s多重比較顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同刺梨果渣膳食纖維的平均粒徑和比表面積

由表1可知，SDF的平均粒徑（1 196 nm）顯著低于其他膳食纖維樣品（P＜0.05），IDF和TDF的比表面積顯著低于SDF（P＜0.05），其中IDF比表面積最低，為2.98 m2/g。與SDF相比，DHPM-SDF平均粒徑增加了2.08 倍，DHPM-SDF的比表面積顯著降低（P＜0.05），說明DHPM處理可顯著改變SDF的平均粒徑和比表面積。根據(jù)Guo Xiaojuan等[22]的報(bào)道，這可能是因?yàn)镈HPM處理過程中產(chǎn)生瞬間巨大的壓力差，導(dǎo)致刺梨果渣膳食纖維物料顆粒從組織內(nèi)部發(fā)生爆裂、膨化，使得顆粒粒徑增加，比表面積減小。

表1 刺梨果渣膳食纖維樣品的平均粒徑和比表面積Table 1 Comparison of the average particle sizes and specific surface areas of dietary fibers from Rosa roxburghii Tratt. pomace

2.2 不同刺梨果渣膳食纖維的流變特性

由圖1可知，SDF和DHPM-SDF表觀黏度較小，IDF和TDF的表觀黏度很小，且與蒸餾水溶液沒有明顯差別。SDF組隨著剪切速率的增加，其表觀黏度呈下降趨勢，說明SDF溶液屬于非牛頓流體。在同一剪切速率下，經(jīng)過DHPM處理后SDF的表觀黏度明顯減小。根據(jù)Chen Huanhuan等[21]的報(bào)道，這可能是SDF在DHPM處理過程中，由于高剪切力和湍流力，造成了無序或有序的構(gòu)象轉(zhuǎn)變以及多糖分子鏈的斷裂，最終使得溶液黏度有所減小。

圖1 刺梨果渣膳食纖維樣品表觀黏度隨剪切速率的變化Fig. 1 Apparent viscosity of dietary fiber samples as a function of shear rate

2.3 不同刺梨果渣膳食纖維對葡萄糖的吸附作用

刺梨果渣SDF、IDF、TDF都具有吸附葡萄糖的能力，這表明刺梨果渣膳食纖維都有助于降低腸腔中葡萄糖的濃度，可作為降血糖產(chǎn)品開發(fā)的潛在優(yōu)良資源。如圖2所示，SDF對葡萄糖的吸附能力顯著低于其他膳食纖維（P＜0.05），其中，IDF葡萄糖的吸附能力是SDF的1.28 倍，而DHPM-SDF、IDF、TDF葡萄糖吸附能力沒有顯著性差異（P＞0.05）。類似的，楊晰茗等[23]發(fā)現(xiàn)食用菌IDF對葡萄糖吸附能力顯著高于食用菌SDF（P＜0.05）。與SDF相比，DHPM-SDF的葡萄糖吸附能力提高了28.13%，說明DHPM處理是提高SDF吸附葡萄糖的有效手段。Morales等[24]的研究表明，DHPM處理能夠增大SDF的顆粒粒徑和孔隙，這有助于截留葡萄糖分子，從而提高SDF對葡萄糖的吸附作用。

圖2 刺梨果渣膳食纖維樣品對葡萄糖的吸附能力Fig. 2 Glucose adsorption capacity of dietary fibers from Rosa roxburghii Tratt. pomace

2.4 不同刺梨果渣膳食纖維對葡萄糖擴(kuò)散的抑制作用

圖3 刺梨纖維對葡萄糖擴(kuò)散能力（A）和葡萄糖擴(kuò)散抑制力（B）的影響Fig. 3 Effects of dietary fibers from Rosa roxburghii Tratt. pomace on glucose diffusion (A) and glucose dialysis retardation index (B)

2.5 不同刺梨果渣膳食纖維對淀粉消化的影響

刺梨果渣膳食纖維對淀粉消化的抑制作用如圖4所示，與對照組相比，刺梨果渣膳食纖維樣品組的葡萄糖物質(zhì)的量明顯降低。在反應(yīng)時(shí)間150 min時(shí)，DHPM-SDF組透析液中葡萄糖的物質(zhì)的量最小，而SDF和IDF沒有明顯差異，說明SDF和IDF對淀粉消化抑制能力相近，而DHPM-SDF對淀粉消化抑制能力最大；與對照組相比，DHPM-SDF組透析液中葡萄糖物質(zhì)的量下降了約11.89%～23.19%。根據(jù)Zhang Hui等[26]的報(bào)道，推測膳食纖維抑制淀粉酶消化的原因可能是膳食纖維分子與胰淀粉酶發(fā)生相互作用，阻礙胰淀粉酶與底物的作用。根據(jù)Ma Mengmei等[27]的報(bào)道，超高壓微射流處理可使膳食纖維的孔隙率和功能基團(tuán)的裸露度增加，提高了其對淀粉酶的吸附能力以及活性位點(diǎn)結(jié)合能力，導(dǎo)致淀粉酶活力下降，最終使淀粉的消化速率降低。

圖4 刺梨果渣膳食纖維對淀粉消化的抑制作用Fig. 4 Inhibitory effects of dietary fibers from Rosa roxburghii Tratt.pomace on starch digestibility

2.6 不同刺梨果渣膳食纖維對胰淀粉酶熒光猝滅作用

當(dāng)胰淀粉酶與功能性物質(zhì)發(fā)生相互作用后，其熒光強(qiáng)度發(fā)生明顯降低，這稱為熒光猝滅作用。胰淀粉酶含有酪氨酸和色氨酸殘基，酪氨酸和色氨酸殘基是引起蛋白質(zhì)熒光的主要氨基酸殘基，在280 nm激發(fā)波長下主要是酪氨酸產(chǎn)生熒光，295 nm激發(fā)波長下主要是色氨酸產(chǎn)生熒光。

如圖5所示，胰淀粉酶溶液中加入刺梨果渣膳食纖維后，其熒光強(qiáng)度均明顯降低。說明TDF、IDF、SDF均能作用于胰淀粉酶的酪氨酸和色氨酸殘基。其中，TDF組的熒光強(qiáng)度最高，而SDF組最低，DHPM-SDF組熒光猝滅能力高于SDF組，這與圖4結(jié)果類似。膳食纖維分子與胰淀粉酶分子的主要結(jié)合位點(diǎn)是酶中的酪氨酸、色氨酸等氨基酸殘基，通過吸附胰淀粉酶而阻礙胰淀粉酶與底物的作用，最終降低淀粉的消化速率[28-29]。

圖5 在280 nm（A）和295 nm（B）激發(fā)波長下刺梨果渣膳食纖維對胰淀粉酶熒光猝滅的光譜圖Fig. 5 Influence of dietary fibers of Rosa roxburghii Tratt. pomace on emission spectra of pancreatic amylase at the excitation wavelengths of 280 nm (A) and 295 nm (B)

2.7 不同刺梨果渣膳食纖維對胰淀粉酶活力的影響

在有膳食纖維樣品存在的情況下，胰淀粉酶與淀粉的水解反應(yīng)維持30 min后，各樣品組胰淀粉酶對淀粉的水解速率（以葡萄糖產(chǎn)生速率表示）以及胰淀粉酶活力的變化如圖6所示，與對照組葡萄糖產(chǎn)生速率（109?μmol/h）相比，刺梨果渣膳食纖維（尤其是SDF和DHPM-SDF）干預(yù)組的葡萄糖產(chǎn)生速率顯著降低（P＜0.05），其中DHPM-SDF葡萄糖產(chǎn)生速率僅為97?μmol/h。IDF和TDF的淀粉酶活力抑制率分別約為4.40%、4.04%，SDF和DHPM-SDF的胰淀粉酶活力抑制率分別為7.63%、11.01%，SDF對胰淀粉酶活力的抑制能力是IDF的1.73 倍，DHPM-SDF對胰淀粉酶活力的抑制率最高，是SDF的1.44 倍，與圖4的結(jié)果一致。DHPM處理可能導(dǎo)致SDF粒徑和裸露的功能基團(tuán)數(shù)量增加，提高了SDF與胰淀粉酶活力位點(diǎn)的結(jié)合能力，并可能改變胰淀粉酶的空間二級結(jié)構(gòu)，使得胰淀粉酶與底物間作用減弱，胰淀粉酶活力下降，最終使得淀粉水解速率下降[27]。因此，進(jìn)一步分析在IDF、SDF、TDF、DHPM-SDF干預(yù)條件下胰淀粉酶二級結(jié)構(gòu)的變化。

圖6 刺梨果渣膳食纖維樣品對胰淀粉酶活力的影響Fig. 6 Effects of dietary fibers from Rosa roxburghii Tratt. pomace on pancreatic amylase activity

2.8 不同刺梨果渣膳食纖維對胰淀粉酶二級結(jié)構(gòu)影響

圖7 胰淀粉酶與刺梨果渣膳食纖維反應(yīng)后的近紫外圓二色光譜Fig. 7 Near UV-circular dichroism spectra of pancreatic amylase affected by dietary fibers from Rosa roxburghii Tratt. pomace

胰淀粉酶與刺梨纖維相互作用后的近紫外圓二色光譜如圖7所示。在各膳食纖維樣品干預(yù)下，胰淀粉酶二級結(jié)構(gòu)中的α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲的相對含量如表2所示，與對照組相比，各組樣品中胰淀粉酶α-螺旋和無規(guī)卷曲的相對含量總體上顯著下降（P＜0.05）。各組β-轉(zhuǎn)角相對含量的變化規(guī)律不明顯，與對照組相比，SDF與IDF組β-轉(zhuǎn)角的相對含量顯著減?。≒＜0.05）。與SDF組相比，DHPM-SDF組β-轉(zhuǎn)角相對含量增大，而α-螺旋、無規(guī)卷曲相對含量顯著減?。≒＜0.05）。

表2 胰淀粉酶與刺梨纖維作用后的二級結(jié)構(gòu)相對含量的變化Table 2 Changes in the secondary structure of pancreatic amylase affected by dietary fibers from Rosa roxburghii Tratt. pomace

整體而言，各組胰淀粉酶的α-螺旋相對含量由低到高依次為TDF＜IDF＜DHPM-SDF＜SDF＜對照組。α-螺旋相對含量的減小，說明酶與刺梨果渣膳食纖維作用后，其二級結(jié)構(gòu)不斷伸展，引發(fā)活性位點(diǎn)的暴露，從而更容易被酶抑制因子鈍化。IDF組α-螺旋相對含量下降幅度顯著高于SDF組（P＜0.05）。相比于SDF組，DHPM-SDF顯著降低胰淀粉酶的α-螺旋相對含量（P＜0.05）。各組胰淀粉酶的無規(guī)卷曲相對含量由低到高依次為DHPM-SDF＜SDF＜TDF＜IDF＜對照組。無規(guī)卷曲是指不能被歸入明確二級結(jié)構(gòu)的多肽區(qū)段，這類有序的非重復(fù)性結(jié)構(gòu)經(jīng)常構(gòu)成酶活性部位和其他蛋白質(zhì)特異的功能部位。相對于對照組，各膳食纖維干預(yù)組中胰淀粉酶的無規(guī)卷曲相對含量顯著減小，其中，SDF（降低37.5%），尤其是DHPM-SDF（降低39.8%）引發(fā)的胰淀粉酶無規(guī)卷曲的相對含量下降最為顯著（P＜0.05）。無規(guī)卷曲相對含量的減小可能是影響胰淀粉酶酶活力的主要二級結(jié)構(gòu)是無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，在與刺梨纖維作用后，其無規(guī)卷曲區(qū)段受到較強(qiáng)的影響，致使酶活力發(fā)生顯著性降低所致[30]。類似的，樊美慧[31]發(fā)現(xiàn)，酪氨酸酶與黃酮類化合物結(jié)合后，其酶活力降低、無規(guī)卷曲相對含量也發(fā)生顯著降低，并且分子模擬實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物與酪氨酸酶作用后，酶的無規(guī)卷曲構(gòu)象發(fā)生改變，底物進(jìn)入酶活性中心的通道受到了阻礙，最終導(dǎo)致酶活力受到抑制。故推測，刺梨果渣膳食纖維干預(yù)可能改變了胰淀粉酶的二級結(jié)構(gòu)，并最終導(dǎo)致其活性降低。此外，根據(jù)圖5、6的結(jié)果以及Ma Mengmei等[27]的報(bào)道，可推測DHPM處理使得SDF的粒徑、功能基團(tuán)的數(shù)量和裸露度均增加，DHPM-SDF與胰淀粉酶中酪氨酸、色氨酸等氨基酸殘基間相互作用增強(qiáng)，從而使其對胰淀粉酶空間二級結(jié)構(gòu)中的α-螺旋、無規(guī)卷曲的影響增強(qiáng)，導(dǎo)致DHPM-SDF對胰淀粉酶活力抑制能力增強(qiáng)。

3 結(jié) 論

刺梨果渣SDF、IDF、TDF都能通過吸附葡萄糖、抑制葡萄糖擴(kuò)散以及影響胰淀粉酶二級結(jié)構(gòu)來減緩葡萄糖的流動(dòng)進(jìn)程和降低淀粉消化速率。其中，與SDF相比，IDF表現(xiàn)出較強(qiáng)的葡萄糖吸附能力和抑制葡萄糖擴(kuò)散的能力。SDF對胰淀粉酶活力的抑制能力顯著高于IDF（P＜0.05），并且，SDF對胰淀粉酶活力的抑制可能是通過改變胰淀粉酶分子二級結(jié)構(gòu)的α-螺旋和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)。TDF表現(xiàn)出于IDF相似的葡萄糖吸附能力和抑制淀粉酶活力能力。DHPM處理使得SDF的比表面積減小，平均粒徑增大，顆粒阻礙作用增強(qiáng)，進(jìn)而使DHPM-SDF表現(xiàn)出比SDF更強(qiáng)的葡萄糖吸附和抑制葡萄糖擴(kuò)散的能力。此外，與SDF相比，DHPM-SDF通過顯著增加胰淀粉酶中β-轉(zhuǎn)角的相對含量以及降低α-螺旋和無規(guī)卷曲相對含量，而表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑制淀粉酶活力的能力。本研究初步探索了刺梨果渣IDF、SDF和TDF以及DHPM-SDF對葡萄糖擴(kuò)散和淀粉消化的影響，為刺梨果渣膳食纖維在淀粉消化過程中的調(diào)控作用及其降血糖活性研究提供理論依據(jù)，并為DHPM改性處理對刺梨果渣的精深加工提供技術(shù)參考。