李銀輝，王曄茹，孟媛媛，趙 偉，檀利軍，劉海泉,3,4，謝慶超,3,5,*，趙 勇,3,5,*

（1.上海海洋大學食品學院，上海 201306；2.國家食品安全風險評估中心，北京 100022；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風險評估實驗室（上海），上海 201306；4.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術研究中心，上海 201306；5.上海海洋大學食品質(zhì)量安全檢測實驗室，上海 201306）

即食發(fā)酵肉制品是以畜禽肉為原料在自然或人工條件下經(jīng)特定微生物和酶的作用，加工制成的一類可即食的產(chǎn)品。它們的共同特點是處理時間長，且干燥后質(zhì)量損失較大。其加工過程包括原料肉的預處理、發(fā)酵和干燥3 個階段。發(fā)酵過程中，主要進行微生物代謝，而在干燥階段會形成特殊的質(zhì)構和風味[1]。經(jīng)過發(fā)酵和干燥，原料肉經(jīng)歷了由生到熟的轉變，故本文將這兩個階段概括為熟化階段。熟化過程不僅耗能低，并且賦予了肉制品獨特的功能特性、感官特性和營養(yǎng)特性。

即食發(fā)酵肉制品主要分為即食發(fā)酵火腿和香腸兩大類，雖然兩者形態(tài)有差異，但其熟化過程中理化性質(zhì)的變化及其熟化機制是類似的[2]。在熟化過程中，酶和微生物將蛋白質(zhì)和脂質(zhì)水解氧化形成了大量小分子物質(zhì)（如游離氨基酸、游離脂肪酸、醛、酮等）；微生物發(fā)酵劑消耗肌肉中的碳水化合物并產(chǎn)生有機酸，pH值降低至4.5～5.5，由于干燥脫水以及鹽的作用，肌肉中水分活度（aw）降低，一定程度上保證了產(chǎn)品的安全性，同時酸可以使肌肉中的鹽溶性蛋白質(zhì)變性，產(chǎn)生的凝膠結構有助于形成即食發(fā)酵肉制品特殊的質(zhì)構；腌制劑中硝酸鹽和亞硝酸鹽通過與肌紅蛋白結合形成亞硝酸肌紅蛋白，提升了即食發(fā)酵肉制品的色澤[3]。

即食發(fā)酵肉制品的熟化過程中，酶、微生物和腌制劑對形成其獨特的品質(zhì)、風味和色澤等起到重要作用。目前即食發(fā)酵肉制品的生產(chǎn)大都是經(jīng)驗性的，因此全面了解其熟化過程中理化性質(zhì)的變化以及熟化因素的作用機制對其生產(chǎn)加工具有指導意義。本文系統(tǒng)地闡述其熟化過程中的成分變化以及影響熟化的因素及其作用機制，以期為更加深入地了解和探究此類產(chǎn)品提供依據(jù)。

1 即食發(fā)酵肉制品熟化過程中的成分變化

即食發(fā)酵肉制品熟化過程中發(fā)生了一系列高度復雜的生化反應。在此過程中，蛋白質(zhì)水解形成多肽和游離氨基酸；蛋白質(zhì)凝膠的生成使即食發(fā)酵肉制品形成了獨特的質(zhì)構；脂質(zhì)在酶的作用下發(fā)生水解形成游離脂肪酸。游離氨基酸和脂肪酸對風味物質(zhì)的形成有重要影響，其中游離脂肪酸經(jīng)過氧化生成醛、酮、醇和酯等風味物質(zhì)，同時碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)酸以及美拉德反應也是風味和滋味物質(zhì)的主要來源。

1.1 蛋白質(zhì)的變化

1.1.1 蛋白質(zhì)的水解及其影響因素

蛋白質(zhì)水解是即食發(fā)酵肉制品熟化過程的主要生化反應之一。熟化過程中，肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的含量呈下降趨勢，韋友兵等[4]發(fā)現(xiàn)薩拉米香腸的肌漿蛋白氮質(zhì)量分數(shù)從21.22%降低至11.35%，肌原纖維蛋白氮質(zhì)量分數(shù)從19.5%降低至8.77%。大分子的蛋白質(zhì)水解成小分子物質(zhì)更有利于人體吸收，同時生成的各種生物活性肽，賦予了產(chǎn)品特殊的營養(yǎng)價值和功能特性[5]。其中，與降血壓相關的活性肽——血管緊張素轉換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制劑研究最為廣泛。Mora等[6]研究表明伊比利亞發(fā)酵火腿中的肽段包含已知的ACE抑制片段，該研究者將此肽段作用于自發(fā)性高血壓大鼠，結果表明8 h后大鼠的收縮壓顯著降低12 mm Hg。最近，一項臨床研究評估了發(fā)酵火腿的消費與心血管效應之間的關系，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵火腿可以減輕炎癥反應和改變血栓形成狀態(tài)。另外，有研究表明西班牙發(fā)酵火腿中具有可以影響糖代謝的生物活性肽，攝入該火腿后受試者血糖水平有所下降[7]。

蛋白質(zhì)的水解受多種因素的影響。首先，不同類型發(fā)酵產(chǎn)品蛋白質(zhì)水解指數(shù)不同，發(fā)酵火腿中水解指數(shù)高達24%～40%，發(fā)酵香腸中水解指數(shù)可達到17%左右[4,8]。其次，蛋白質(zhì)種類也是影響其蛋白質(zhì)水解率的因素之一，López等[9]采用肽組學方法對阿根廷市售發(fā)酵香腸中的蛋白質(zhì)水解過程及其生成的多肽進行了研究，發(fā)現(xiàn)香腸中肌漿蛋白比肌原纖維蛋白更容易被水解。此外，不同的加工條件蛋白質(zhì)的水解速率也不同，高含水量的香腸蛋白質(zhì)水解速率較高。由于鹽分和水分在肌肉中的轉移路徑不同，肌肉的半膜肌和股二頭肌的幾何位置對火腿熟化過程中蛋白質(zhì)水解速率也有很大影響[10]。

1.1.2 蛋白質(zhì)的氧化

蛋白質(zhì)的適度氧化有利于蛋白酶對蛋白質(zhì)的識別，提高蛋白質(zhì)的水解率。但是過度氧化會產(chǎn)生一些不良效果（包括氨基酸降解、蛋白質(zhì)溶解度降低、酶失活和蛋白質(zhì)消化率降低等），導致產(chǎn)品品質(zhì)劣化（例如變色、異味、質(zhì)地缺陷以及營養(yǎng)價值下降）[11]。蛋白質(zhì)的氧化有兩種方式，一種是由自由基（如超氧陰離子自由基、羥自由基（·OH）和過氧化硝基陰離子（ONOO－）等）直接引起，遵循自由基鏈式反應過程；另一種是由氧化應激的副產(chǎn)物（加工過程中產(chǎn)生的氧化脂質(zhì)或其他促氧化劑）間接引起。氨基酸側鏈基團的修飾是蛋白質(zhì)氧化的主要特征，氧化過程中氨基酸殘基的側鏈受到攻擊，并轉化為羰基衍生物。自由基與氨基酸側鏈進行反應時，氨基酸的反應敏感度表現(xiàn)出較大的差異，其中自由基對半胱氨酸的含硫活性中心敏感性較強，氧化形成二硫鍵促進了蛋白質(zhì)之間的相互交聯(lián)[12]。此外，常見的蛋白質(zhì)氧化反應還包括芳香族氨基酸側鏈與脂肪族發(fā)生羥基化、堿性氨基酸脫氨生成羰基化合物等[13]。目前關于蛋白質(zhì)氧化機制方面取得了一定的進展，但在即食發(fā)酵肉制品中蛋白質(zhì)氧化對于其熟化具體作用、蛋白質(zhì)氧化前后的化學結構變化以及如何精準地控制氧化的強度等都仍需進一步的探索。

1.1.3 質(zhì)構的形成

質(zhì)構是評價即食發(fā)酵肉制品質(zhì)量的主要感官特征之一[14]。熟化過程中質(zhì)構的變化主要表現(xiàn)為最終產(chǎn)品硬度的增加、咀嚼性增強、彈性下降以及嫩度降低[15-17]。其中蛋白質(zhì)變性并生成凝膠是產(chǎn)品質(zhì)構形成的主要原因，蛋白質(zhì)凝膠是蛋白質(zhì)發(fā)生降解和變性而產(chǎn)生的稠密光滑的結構物質(zhì)，可以增加肌肉組織間的硬度和黏合性，從而改變?nèi)庵破返馁|(zhì)構。其形成可分為3 個主要步驟：首先是在鹽的作用下鹽溶性蛋白質(zhì)析出，進而酸化形成蛋白質(zhì)凝膠，最后在干燥過程中進一步強化蛋白質(zhì)凝膠[16-17]。

影響質(zhì)構的因素眾多，包括原料、含鹽量和pH值等。Steen等[18]研究了不同的原料肉和翻滾時間對火腿質(zhì)構的影響，發(fā)現(xiàn)原料肉的品質(zhì)與產(chǎn)品質(zhì)構關系顯著。鹽減弱了蛋白質(zhì)附近基團離子之間的靜電吸引，從而促進蛋白質(zhì)的展開和解離，使產(chǎn)品質(zhì)構進一步形成[2]，Coll-Brasas等[19]研究表明減少鹽的添加量會導致產(chǎn)品硬度和黏附性降低。同時，質(zhì)構還受pH值影響，不同的酸度通過影響蛋白質(zhì)凝膠的形成，會使最終產(chǎn)品的質(zhì)構出現(xiàn)較大差異。

目前關于即食發(fā)酵肉制品的質(zhì)構形成與蛋白質(zhì)水解程度、肌肉纖維的組織狀態(tài)變化（如粗絲和細絲、Z盤和胞間蛋白相關變化）以及蛋白質(zhì)的微觀結構變化之間的相互關聯(lián)研究較少?？梢圆捎脪呙桦娮语@微鏡、低場核磁共振、激光粒度儀等觀察即食發(fā)酵肉制品中肌肉纖維的組織狀態(tài)并分析蛋白質(zhì)的微觀結構，以解釋最終產(chǎn)品質(zhì)構的形成過程。

1.2 脂質(zhì)的變化

脂質(zhì)是原料肉的主要成分，質(zhì)量分數(shù)在25%～55%之間。熟化過程中脂質(zhì)的水解和氧化與即食發(fā)酵肉制品的感官特性密切相關[20]。脂質(zhì)含量的不同會導致產(chǎn)品品質(zhì)的差異，在切片方面，當肌肉中的脂質(zhì)含量超過5%時，即食發(fā)酵火腿就會表現(xiàn)出大理石花紋結構[21]；在色澤方面，隨著肌肉內(nèi)脂質(zhì)含量的增加，產(chǎn)品切片的紅度和亮度會降低[22]；同時產(chǎn)品的風味形成與脂質(zhì)的含量之間也有很強的關聯(lián)性。

伴隨著脂質(zhì)的水解，游離脂肪酸的含量增加，在熟化結束時，即食發(fā)酵肉制品中游離脂肪酸質(zhì)量占肌肉中總脂質(zhì)的8%～20%。不同類型的產(chǎn)品脂質(zhì)分解的速率存在較大差異，發(fā)酵火腿中，游離脂肪酸的質(zhì)量分數(shù)在10 個月內(nèi)從1%～2%上升到10%～12%，與發(fā)酵火腿相比發(fā)酵香腸中脂質(zhì)的水解速度較快，游離脂肪酸的質(zhì)量分數(shù)在1 個月內(nèi)可由1%～2%上升到4%～5%[23]。劉姝韻等[24]發(fā)現(xiàn)5種云南火腿脂肪酸的含量存在較大差別，但其組成比例較為相似，故不同產(chǎn)品之間品質(zhì)的差別可能部分是脂質(zhì)水解程度的差異造成的。

在氧化性物質(zhì)的作用下，水解生成的大量游離脂肪酸會被進一步氧化，適度的脂質(zhì)氧化對多汁性、嫩度和風味有積極的影響。其氧化形式主要有酶促氧化和自由基氧化，其中酶促氧化是指在內(nèi)源脂肪氧合酶催化下，多不飽和脂肪酸被氧化的反應；自由基氧化包括引發(fā)、延伸和終止3 個步驟，引發(fā)是由自由基和其他一些氧化引發(fā)劑（包括活性氧和單線態(tài)氧等）所致，從脂肪酸中的亞甲基碳上除去一個氫以形成烷基，這一過程優(yōu)先作用于多不飽和脂肪酸。延伸步驟是自由基與氧反應生成過氧基，而后從另一種脂肪酸中提取氫，形成過氧化氫。在終止步驟中過氧化氫分解，從而導致?lián)]發(fā)性物質(zhì)生成[25]。Li Binbin等[26]指出脂質(zhì)氧化與蛋白質(zhì)氧化關系密切，脂質(zhì)氧化可誘導蛋白質(zhì)氧化。

評價脂質(zhì)氧化的進程一般用過氧化值（peroxide value，POV）和硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）值，POV和TBA值在即食發(fā)酵肉制品熟化過程中發(fā)生顯著變化。Koutina等[27]研究了帕爾瑪火腿的脂質(zhì)變化，并指出半膜肌中肌內(nèi)脂肪的脂質(zhì)氧化進程比股二頭肌中快，在成熟的9 個月內(nèi)股二頭肌中POV增加，然后迅速下降，而半膜肌中的POV在成熟3 個月后即達到最大值。

1.3 風味物質(zhì)的形成

化學反應和微生物代謝反應是即食發(fā)酵肉制品產(chǎn)生風味物質(zhì)主要方式，化學反應包括脂肪酸氧化反應、美拉德反應以及蛋白質(zhì)的水解；微生物代謝反應可進一步分為碳水化合物發(fā)酵、氨基酸降解反應、脂質(zhì)β氧化作用。風味物質(zhì)形成的化學反應和微生物代謝反應示意圖如圖1所示。

圖1 即食發(fā)酵肉制品風味物質(zhì)的形成反應[28]Fig. 1 Reaction for the formation of flavor substances in ready-to-eat fermented meat products[28]

如前所述蛋白質(zhì)和脂質(zhì)經(jīng)過水解，產(chǎn)生的部分游離氨基酸和脂肪酸是形成風味化合物的前體物質(zhì)。其中脂質(zhì)產(chǎn)生的多種揮發(fā)性化合物（烷烴、醛、醇、酯和羧酸等）是特征風味形成的主要因素[29]。脂質(zhì)中揮發(fā)性物質(zhì)的產(chǎn)生通常需要兩步，第一步是脂質(zhì)在脂肪酶或磷脂酶的作用下生成游離脂肪酸，第二步是游離脂肪酸經(jīng)過氧化生成不同種類的揮發(fā)性風味物質(zhì)[30]。脂質(zhì)氧化反應產(chǎn)生的羰基化合物與氨基酸進行美拉德反應，生成Strecker醛、α-酮酸和胺等物質(zhì)可作為反應底物，產(chǎn)生揮發(fā)性化合物[31-32]。蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的多肽也與特定的風味有關，Rodríguez-Nu?ez等[33]研究表明，火腿中1 500～1 700 Da的多肽與呈味有關。

碳水化合物的發(fā)酵除產(chǎn)酸外，還產(chǎn)生大量風味物質(zhì)和滋味物質(zhì)，如丙酮、3-羥基-2-丁酮、乙醇、乙酸和丁酸等[34]；發(fā)酵劑中的微生物群可以降解氨基酸，其中凝固酶陰性葡萄球菌和酵母菌降解氨基酸使其變?yōu)橄鄬娜┎a(chǎn)生揮發(fā)性較強的風味化合物[35]；游離脂肪酸也可以通過脂質(zhì)β氧化反應降解，產(chǎn)生短鏈脂肪酸和酮酸，β-酮酸通過脫羧反應降解為甲基酮，并進一步降解為仲醇。此外，不同的發(fā)酵肉制品中所使用的香料有所不同，最終產(chǎn)品所形成的特征滋味和風味也有所差異。

2 即食發(fā)酵肉制品熟化終點的判斷

即食發(fā)酵肉制品熟化不足時產(chǎn)品的品質(zhì)和風味不佳，而熟化過度時又易氧化過度導致食品腐敗變質(zhì)，所以需要準確判斷熟化終點。實際生產(chǎn)過程中，熟化終點的判斷大都是基于經(jīng)驗性的，為實現(xiàn)集約化大規(guī)模生產(chǎn)，根據(jù)熟化過程中理化性質(zhì)的變化，研究者們試圖尋找一種標志物或檢測方法來判斷熟化終點。常見有下列3種判斷方法。

根據(jù)蛋白質(zhì)水解變化率及產(chǎn)生的代謝物進行判斷：馬曉鐘等[36]研究表明蛋白質(zhì)水解指數(shù)能夠直觀且快速地評價金華火腿的發(fā)酵程度。Degnes等[37]使用由靶向生成物（如氨基酸、多肽等）和非靶向生成物（如次黃嘌呤）所構成的代謝物譜的變化來指示火腿的熟化程度，并為代謝物譜建立快速的定量分析方法。Gallego等[38]研究了西班牙火腿加工過程中在不同時間位于肌節(jié)Z線的LIM域結合蛋白的降解。用質(zhì)譜鑒定出不同時期的多種肽鏈，其中部分肽段具有作為發(fā)酵火腿加工生物標志物的潛力。對于不同的品牌或類型的產(chǎn)品有著不同的蛋白質(zhì)水解率，且代謝產(chǎn)物的量也存在著差異，故實際生產(chǎn)中要根據(jù)具體產(chǎn)品的特性制定相應的行業(yè)標準或企業(yè)標準。

采用數(shù)學模型分析熟化過程中不同時期的代謝產(chǎn)物進行判斷：Bello等[39]提出了使用數(shù)學模型方法區(qū)分熟化過程中的不同階段，并確定了所涉及的各種參數(shù)，包括水分活度、發(fā)酵微生物種群（乳酸桿菌科、微球菌科）和代謝產(chǎn)物（乳酸、乙酸、總游離脂肪酸、總游離氨基酸）等。發(fā)酵香腸在干燥過程中水分會散失，采用數(shù)學模型描述香腸重量損失和含水量隨時間的變化，可用于判定香腸的熟化程度。

采用特定的儀器進行輔助判斷：Fulladosa等[40]開發(fā)了一種對發(fā)酵火腿表面進行質(zhì)構分析的儀器，主要原理是不同球形探針在3 個解剖位置上進行單軸壓縮，用于模擬人手指的施力作用并記錄力和時間曲線來表征火腿的彈性參數(shù)，以判斷熟化終點。Prevolnik等[41]采用了近紅外光譜數(shù)據(jù)和人工神經(jīng)網(wǎng)絡判定發(fā)酵火腿的成熟。使用光譜儀在400～2 500 nm的波長范圍內(nèi)進行掃描，通過2D Kohonen人工神經(jīng)網(wǎng)絡將樣本進行分析，構建熟化分類模型并選擇一個錯誤率最低的模型用于判定熟化程度。近紅外光譜的應用具有成本低、快速和對產(chǎn)品無損等優(yōu)點，然而肉類樣品的異質(zhì)性和水分在紅外區(qū)域的高吸光度會導致測試結果的偏差?？梢詫⒔t外光譜、雙能X射線吸收儀以及質(zhì)構分析儀等其他檢測技術相結合，不僅可以檢測肉制品中的化學成分和肉質(zhì)屬性，還可以探究其組成如蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的比例等，從而更好地標定熟化終點。

3 即食發(fā)酵肉制品熟化過程中各影響因素的作用機制

在熟化過程中，蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和碳水化合物經(jīng)微生物和酶的作用，部分轉化為小分子物質(zhì)，進而影響了即食發(fā)酵肉制品的外觀、風味和質(zhì)地。在熟化過程中發(fā)生的主要生化變化如圖2所示。

圖2 即食發(fā)酵肉制品熟化過程中發(fā)生的主要生化變化[1]Fig. 2 Major biochemical changes during the ripening process of ready-to-eat fermented meat products[1]

3.1 內(nèi)源酶的作用

3.1.1 內(nèi)源脂酶的作用

脂質(zhì)相關酶類主要包括脂肪酶和磷脂酶類。熟化過程中甘油三酯（triglycerides，TG）、磷脂在脂肪酶和磷脂酶的作用下進行部分水解生成相應的游離脂肪酸和甘油[42]。脂肪酶可分為酸性脂酶（溶酶體酸性脂酶，最適pH 4～5）、中性脂酶（激素敏感脂肪酶（hormonesensitive lipase，HSL），最適pH 7.0～7.5）、堿性脂酶（脂肪甘油三酯脂肪酶（adipose triglyceride lipase，ATGL），最適pH 8～9）[43]。發(fā)酵香腸中亞油酸是釋放最多的脂肪酸，其次分別是油酸、硬脂酸和棕櫚酸等，脂肪酸含量的差異可能與脂肪酶的專一性有關[44]。磷脂也是即食發(fā)酵肉制品熟化過程的主要水解底物。磷脂酶可分為5 類：磷脂酶A1、A2、B、C和D，熟化過程中磷脂酶一直保持較高的活力，且產(chǎn)生大量不飽和脂肪酸[4,45]。但是關于磷脂酶水解的作用方式及機理的研究較少。

酶解過程中脂肪ATGL主要降解TG，最先水解sn-1處的脂肪酸；HSL在中性條件下活躍于細胞質(zhì)中，水解TG和二酰甘油（diacylglycerol，DAG）；單酰甘油脂肪酶（monoacylglycerol lipase，MGL）活性最強，水解1或2位的單酰甘油，所以在組織中沒有單酰甘油的積累[46]。他們之間具有一定的反應催化順序，即TG在ATGL的作用下水解為DAG和1分子脂肪酸，再由HSL繼續(xù)催化，將DAG轉化為單酰甘油（monoacylglycerol，MAG）和1分子脂肪酸；最后由MGL發(fā)揮催化作用，將MAG分解為甘油和脂肪酸。為保證機體內(nèi)水解平衡，DAG和MAG還可通過二?；视王；D移酶（diacylglycerol acyltransferase，DGAT）和單?；视王；D移酶（monoacyglycerol acyltransferases，MGAT）發(fā)生酯化過程再次生成TG[47]。反應過程如圖3所示。

圖3 TG水解過程[47]Fig. 3 Triglyceride hydrolysis process[47]

3.1.2 內(nèi)源蛋白酶的作用

蛋白質(zhì)的水解主要是通過內(nèi)源蛋白酶來實現(xiàn)的，這類酶在肉的嫩化和即食發(fā)酵肉制品的風味形成方面具有重要作用。即食發(fā)酵肉制品熟化過程中，內(nèi)源蛋白酶將蛋白質(zhì)和多肽水解為小肽并釋放出氨基酸，其又可分為內(nèi)肽酶和外肽酶，內(nèi)肽酶主要有組織蛋白酶B、L和鈣蛋白酶，外肽酶主要有氨基肽酶和羧肽酶。蛋白水解通常分為兩步：首先，內(nèi)肽酶分解完整的蛋白質(zhì)生成多肽；其次，生成的多肽被外肽酶進一步降解，釋放出單個氨基酸、二肽和三肽，并伴隨有風味物質(zhì)的產(chǎn)生[43]。

即食發(fā)酵肉制品熟化過程中組織蛋白酶是引起蛋白質(zhì)降解和風味物質(zhì)形成的主要內(nèi)肽酶，目前已從肌肉中分離鑒定出近20種組織蛋白酶。通過實驗室條件下模擬發(fā)酵香腸的熟化過程，發(fā)現(xiàn)組織蛋白酶B、D和L起主要作用，Berardo等[48]確定了組織蛋白酶B和D在水解蛋白質(zhì)過程中的特異性水解位點以及共同水解位點。組織蛋白酶B作用于肌動蛋白并產(chǎn)生相應的肽，這些肽大部分是由蛋白質(zhì)的N端和C端釋放的，且多數(shù)為水溶性多肽；組織蛋白酶D能夠快速降解肌聯(lián)蛋白、肌球蛋白重鏈及M蛋白和C蛋白；組織蛋白酶L作用于整個熟化階段[49]。鈣蛋白酶只在腌制初期參與肌肉中蛋白水解，由于水分活度的降低和較低pH值，其活性會被抑制。

氨基肽酶和羧肽酶是將小分子肽繼續(xù)分解為游離氨基酸的主要外肽酶。氨基肽酶（包括精氨酰、丙氨酰和焦谷氨酰氨基肽酶等）在水解過程中具有一定的活性，由于氨基肽酶的水解具有底物特異性，根據(jù)相應生成的游離氨基酸濃度，可以確定其對水解的貢獻程度[50]。王德寶[51]研究表明丙氨酰氨基肽酶是促進游離氨基酸釋放的主要外肽酶，其活性占總氨基肽酶活性的83%，并顯示出較強的底物特異性。精氨酰氨基肽酶又稱氨基肽酶B，是骨骼肌中第二重要的氨基肽酶，有助于產(chǎn)生堿性氨基酸，如精氨酸和賴氨酸。現(xiàn)今對羧肽酶在熟化過程作用及其機制的研究還有待深入。即食發(fā)酵肉制品中內(nèi)源酶的類型以及作用如表1所示。此外，酶的水解活性受多種因素影響，例如由于鹽的抑制作用，組織蛋白酶B和L的活性降低到原來的9.3%和13.7%；溫度升高有利于酶對肌肉蛋白質(zhì)的降解，與5 ℃下發(fā)酵的火腿相比，30 ℃下股二頭肌的蛋白水解程度顯著增強?；鹜缺ｕr中常用到的超高壓處理也會影響酶的水解活性，Rivas-Ca?edo等[52]發(fā)現(xiàn)用600 MPa高壓處理火腿6 min，氨基肽酶活性降低了50%以上。

表1 即食發(fā)酵肉制品中內(nèi)源蛋白酶類型和作用Table 1 Types and functions of endogenous proteases in ready-to-eat fermented meat products

3.2 外源酶的作用

不同種類的酶參與即食發(fā)酵肉制品熟化過程中不同的生化反應，內(nèi)源酶的含量及其產(chǎn)生作用的影響因素十分復雜，因此常通過添加外源酶的方式來改善發(fā)酵工藝。國內(nèi)外關于添加外源酶在即食發(fā)酵肉制品中作用效果的研究進展如表2所示。

表2 外源酶在即食發(fā)酵肉制品中的作用效果Table 2 Effects of exogenous enzymes in fermented meat products

3.3 發(fā)酵劑的作用

微生物發(fā)酵劑可以在一定程度上提高即食發(fā)酵肉制品的品質(zhì)。首先它們可以起到抗氧化作用，避免因過度氧化而對產(chǎn)品造成的不利影響。同時，抑制有害細菌的生長繁殖，降低亞硝酸鹽和生物胺的含量，分解碳水化合物產(chǎn)生乳酸和其他有機酸從而降低pH值，提高產(chǎn)品的安全性。此外，還可以促進蛋白質(zhì)和脂肪的降解，加速風味物質(zhì)的形成，提高產(chǎn)品的營養(yǎng)價值。

發(fā)酵肉制品中作為發(fā)酵劑的微生物主要包括葡萄球菌、乳酸桿菌、微球菌、酵母菌和霉菌等。乳酸菌在發(fā)酵酸化階段起著主導作用；酵母菌耐鹽，發(fā)酵能力強，一般生長在發(fā)酵肉表面；在肉制品發(fā)酵生產(chǎn)中，酵母菌很少單獨使用，多與乳酸菌、微球菌等共同完成發(fā)酵[69]。市面上大多數(shù)發(fā)酵劑也多由兩種或多種混合菌種組成。

3.3.1 抗氧化作用

蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的氧化程度對最終產(chǎn)品的品質(zhì)有重要影響，過度氧化會導致產(chǎn)品腐敗變質(zhì)。微生物發(fā)酵劑具有一定的抗氧化作用，其抗氧化作用機制主要有3種。1）分泌抗氧化物質(zhì)如抗氧化酶、醇類物質(zhì)等，以抵抗氧化作用；2）調(diào)節(jié)信號通路；3）通過清除自由基，從而避免其對細胞的侵害[70]。Yu Di等[71]研究發(fā)現(xiàn)，復配發(fā)酵劑植物乳桿菌CD101和葡萄球菌NJ201有助于延緩干發(fā)酵香腸的氧化。Yang Xin等[72]發(fā)現(xiàn)通過飼喂雛雞植物乳桿菌，雛雞腸黏膜內(nèi)Nrf2及下游HO-1基因的mRNA水平上調(diào)，有效減輕了霉菌毒素脫氧雪腐鐮刀菌烯醇對雛雞的不良影響。馮美琴等[73]通過接種植物乳桿菌和葡萄球菌來制作發(fā)酵香腸，結果表明添加發(fā)酵劑的一組生成了多種具有抗氧化作用的多肽并有清除自由基的能力。

3.3.2 保證產(chǎn)品安全性

熟化過程中，發(fā)酵劑能夠抑制致病微生物生長、限制亞硝胺的形成及降低亞硝酸鹽含量，保證了產(chǎn)品安全性。發(fā)酵前期，乳酸菌快速生長繁殖產(chǎn)生大量乳酸，肉制品的pH值降低，抑制腐敗和致病性微生物的生長繁殖[74]。乳酸菌產(chǎn)生的細菌素也可以抑制致病菌的生長繁殖，de Castilho等[75]研究了細菌素UFVNPAC1對豬肉香腸中單核細胞增生李斯特菌的抑菌效果，結果表明，在10 d內(nèi)單核細胞增生李斯特菌的菌落數(shù)從3.0（lg（CFU/g））降至1.5（lg（CFU/g））。一些乳酸菌含有致病性微生物的抗性基因（如酒井乳桿菌、彎乳桿菌和屎腸球菌中含有抗性基因entA、entB和entP），而對致病菌產(chǎn)生一定的抗性。牛天嬌等[76]將植物乳桿菌PL-ZL001添加到發(fā)酵香腸中發(fā)現(xiàn)其可以抑制6種生物胺的積累。在香腸中分別接種5（lg（CFU/g））和7（lg（CFU/g））的沙克乳酸桿菌C2，結果表明亞硝酸鹽含量隨著接種濃度的增加而降低[77]。

3.3.3 對蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的降解作用

微生物發(fā)酵劑產(chǎn)生的脂酶和蛋白酶可以使生肉中的蛋白質(zhì)和脂肪發(fā)生降解，生成氨基酸、酯、肽和短鏈揮發(fā)性脂肪酸等。同時，隨著必需氨基酸含量的增加以及益生菌的存在增強了產(chǎn)品的營養(yǎng)保健作用[78]。田星等[79]研究表明添加發(fā)酵劑的產(chǎn)品在微生物菌群多樣性和風味品質(zhì)等方面均明顯優(yōu)于自然發(fā)酵肉制品。微球菌科具有降解脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的作用，如肉質(zhì)葡萄球菌和木糖葡萄球菌能顯著促進蛋白質(zhì)和脂肪的水解，改善色澤，促進風味的形成[80]。Chen Qian等[81]將以片球菌、戊糖乳桿菌作為發(fā)酵劑進行香腸發(fā)酵，結果表明發(fā)酵劑組的香腸中游離脂肪酸含量均高于自然發(fā)酵組。不同發(fā)酵劑的作用下香腸中游離脂肪酸的種類不變，只是含量有所差異，所以只是增加了脂質(zhì)的水解程度，并未改變水解模式[82]。同種發(fā)酵劑對不同的脂質(zhì)水解能力有所差異，王德寶等[83]用木糖葡萄球菌和清酒乳桿菌發(fā)酵香腸，發(fā)現(xiàn)此類發(fā)酵劑分解磷脂能力比分解中性脂質(zhì)強。

目前，對于微生物發(fā)酵劑的研究主要集中在微生物多樣性、特定微生物對產(chǎn)品品質(zhì)的影響、特征風味的形成等方面。微生物發(fā)酵劑可以抑制即食發(fā)酵肉制品中亞硝胺等有害化學物質(zhì)的產(chǎn)生，但具體機制尚無研究報道，且在熟化過程中發(fā)酵劑與內(nèi)源酶的相互作用機制還有待明確。

3.4 腌制劑的作用

食鹽是即食發(fā)酵肉制品生產(chǎn)中重要的輔料，不僅可以使產(chǎn)品具有一定的咸味，而且能增加其鮮亮程度以及保水能力，有助于產(chǎn)品形成理想的凝膠質(zhì)地和感官品質(zhì)[84]。不同類型的產(chǎn)品中鹽的含量不同，成熟火腿中食鹽的質(zhì)量分數(shù)為6%～12%，香腸中食鹽的質(zhì)量分數(shù)為8%左右[85]。食鹽的添加有助于使水分活度保持在較低的水平，從而抑制致病微生物的生長繁殖，延長產(chǎn)品的貨架期[86]，如在火腿的腌制階段，當腿肉中的食鹽平均質(zhì)量分數(shù)為3.32%時，23.9 ℃發(fā)酵4周后，其中的旋毛蟲即失去活性[8]。低水分活度對脂肪水解酶、脂肪氧化酶和磷脂酶等的活性也有影響，從而對即食發(fā)酵肉制品中脂質(zhì)氧化分解以及風味物質(zhì)的形成具有調(diào)節(jié)作用[87]，也有一些研究報告表明食鹽可以促進氧化，因為它破壞了細胞膜的結構完整性從而促進肉類產(chǎn)品中氧化劑與不飽和脂質(zhì)之間的氧化反應。此外，由Na＋引起的血紅素結合蛋白釋放的鐵元素可提高氧化速率[88]。

亞硝酸鹽和硝酸鹽常以鈉鹽或鉀鹽的形式添加于即食發(fā)酵肉制品中，有助于形成獨特的色澤以及保證產(chǎn)品安全性。其呈色機理為：硝酸鹽在微生物還原酶的作用下形成亞硝酸鹽；亞硝酸鹽在酸性條件下（微生物發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸）會形成亞硝酸，亞硝酸的性質(zhì)不穩(wěn)定，在常溫下分解產(chǎn)生NO；亞硝酸鹽經(jīng)還原性物質(zhì)（如還原劑NADH）降解產(chǎn)生自由基（如NAD·）；生成的自由基將肉中的高鐵肌紅蛋白還原，NO與其還原產(chǎn)物反應生成玫瑰紅色的亞硝基肌紅蛋白，同時氯化鈉與亞硝酸鹽反應生成亞硝基氯化物加速了亞硝酸肌紅蛋白的形成[89]。此外，亞硝酸鹽可以抑制肉毒梭菌，對即食發(fā)酵肉制品的生物安全性有一定的作用[90]。

4 結 語

即食發(fā)酵肉制品在熟化過程中理化性質(zhì)發(fā)生改變，形成了其獨特的質(zhì)構和風味，本文重點闡述了熟化變化規(guī)律以及酶、發(fā)酵劑和腌制劑等的作用機制。熟化不是單一因素作用的結果，在即食發(fā)酵肉制品熟化的研究中有許多問題亟待解決，主要體現(xiàn)在以下4 個方面：1）對于熟化終點的判斷依據(jù)，至今暫無相關的行業(yè)標準。2）目前對于熟化過程中蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的變化，大部分停留在定性判斷和定量層面，很少關注其自身微觀結構的改變，如蛋白質(zhì)在熟化前后微觀結構的差異。3）與熟化相關的酶類眾多且復雜，尚未完全確認它們在熟化過程的專一性以及具體的反應歷程。4）熟化的影響因素之間相互作用機制不明確，如發(fā)酵劑與腌制劑之間的相互作用機制等。

熟化過程中所發(fā)生的變化廣泛涉及食品研究的多種領域。通過整合相關研究數(shù)據(jù)，利用大數(shù)據(jù)模擬的方法可以更好地了解產(chǎn)品在熟化過程中的演變。將熟化過程中發(fā)生的熱力學轉變、脂解率和蛋白質(zhì)水解率、水分活度的變化和微生物的生長情況等研究數(shù)據(jù)，整合到有效的模擬工具中，分析產(chǎn)品熟化過程中的每個階段，優(yōu)化出適宜的加工條件（鹽漬或發(fā)酵溫度等），使產(chǎn)品具有更好的同質(zhì)性并降低生產(chǎn)成本。可利用現(xiàn)代先進技術，如采用蛋白質(zhì)組學研究肌肉細胞、組織以及蛋白質(zhì)的組成及其變化規(guī)律，結合高效液相色譜法探究其水解底物的特異性以及相關酶類的作用位點和作用方式；并采用掃描電子顯微鏡或共聚焦顯微鏡觀察其微觀結構的變化。利用現(xiàn)代基因工程優(yōu)化發(fā)酵劑中微生物的功能，如在發(fā)酵劑菌株中插入相應的致病菌抗性基因，以保證產(chǎn)品安全性。關于建立與熟化過程中相關酶類的純化方法并揭示其作用方式，也是今后的研究重點之一。通過對即食發(fā)酵肉制品的深入研究，為肉制品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供理論依據(jù)，為消費者提供優(yōu)質(zhì)美味的發(fā)酵產(chǎn)品。