趙芳 倫淑敏 高照偉 段麗娟 楊海軍

食管癌是食管鱗狀上皮或腺上皮異常增生導(dǎo)致的惡性病變，是消化道常見惡性腫瘤之一，食道癌的發(fā)病率占全世界所有癌癥診斷的3.2%，死亡率占所有癌癥死亡的5.3%，且食道癌病死率逐年上升［1-2］。當(dāng)前最常用治療方式為以外科手術(shù)為主同時結(jié)合放化療方式綜合治療，盡管該治療方式可有效根治早期惡性腫瘤，但對晚期惡性腫瘤只能達(dá)到姑息性治療作用，多數(shù)患者死于腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，因此抑制腫瘤的增殖轉(zhuǎn)移成為當(dāng)今提高患者生存率的重要的治療方式之一［3］。長鏈非編碼核糖核苷酸（LncRNA）可調(diào)控腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，有研究指出沉默表達(dá)LncRNA 信號傳導(dǎo)蛋白Sma 和Mad 相關(guān)蛋白同源物5（SMAD5）反義核糖核酸1（SMAD5-AS1）后可抑制鼻咽癌癌細(xì)胞增殖［4］。本實(shí)驗(yàn)室前期研究證實(shí)SMAD5-AS1干擾可影響食管癌細(xì)胞增殖能力，然而其作用機(jī)制仍不清楚。表觀遺傳誘發(fā)LncRNA1（EPIC1）參與癌細(xì)胞增殖［5］。細(xì)胞周期蛋白D1（cyclinD1）是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的重要蛋白，參與調(diào)控食管癌細(xì)胞的增殖［6］。B 細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）是抗凋亡基因，BCL-2/BCL-XL 死亡相關(guān)啟動子（Bad）是促凋亡基因，有研究表明Bcl-2 和Bad 參與食管癌細(xì)胞的增殖［7］。然而SMAD5-AS1 能否調(diào)控EPIC1、cyclinD1、Bad 和Bcl-2 表達(dá)調(diào)控食管癌細(xì)胞增殖未知。本研究選取食管癌細(xì)胞株Eca109 開展細(xì)胞試驗(yàn)，研究SMAD5-AS1 調(diào)控食管癌細(xì)胞Eca109 增殖的作用并初步探討可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞與試劑

人食管癌細(xì)胞株Eca109（由中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫提供）；大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞（購自上海鈺博生物科技有限公司，生產(chǎn)批號：YB-L033）；無菌1640 液體細(xì)胞培養(yǎng)基（RPMI-1640）（購自Hyclone公司，生產(chǎn)批號：SH30809.01B）；胎牛血清、減血清培養(yǎng)基（Opti-MEM）（均購自Gibco 公司，生產(chǎn)批號：10270-106、31985-062）；磷酸鹽緩沖溶液（PBS）、0.25%胰蛋白酶（均購自solarbio，生產(chǎn)批號：P1010、T1350）；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染（Lipofectamine? RNAiMAX）試劑盒（購自Invitrogen 公司，生產(chǎn)批號：13778030）；小 干 擾SMAD5-AS1 RNA（si-SMAD5-AS1）、SMAD5-AS1、EPIC1、cyclinD1、Bcl-2 和Bad 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增引物、pLVX-IRES-ZsGreenl-si-SMAD5-AS1 質(zhì)粒（均由武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司合成）；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑-8（CCK8）（購自solarbio公司，生產(chǎn)批號：CA1210）；兔抗人cyclinD1、Bcl-2、Bad 和內(nèi)參基因磷酸脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體（一抗）、山羊抗兔cyclinD1、Bcl-2、Bad 和GAPDH辣根過氧化物酶標(biāo)記多克隆抗體（二抗）（均購自武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；生產(chǎn)批號：PAB30598、LS-B6772、PAB32756、PAB36269、SAB43714、ab182858、SAB32651、SAB13529）；吐溫-20（Tween-20）、細(xì)胞快速裂解液和二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒（均購自solarbio，生產(chǎn)批號：T8220-100、R0010、PC0020）

1.1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

SW-CJ-1D 型超凈工作臺（購自蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司）；311 型CO2恒溫培養(yǎng)箱（購自Thermo公司）；DMIL LED 型倒置熒光顯微鏡（購自Leica 公司）；Icen-24R 型高速冷凍離心機(jī)、Nano-300 型超微量分光光度計(jì)和AMR-100 型酶標(biāo)儀（均購自杭州奧盛儀器有限公司）；CFX-Connect 96 型熒光定量PCR儀（購自美國Bio-Rad 公司）；Tanon-5200 型全自動化學(xué)發(fā)光分析儀（購自上海天能科技有限公司）；mini protean 3 cell 型電泳儀（購自BIO-RAD）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇與傳代

細(xì)胞復(fù)蘇：37℃水浴迅速融化凍存細(xì)胞，待完全融化后，加入RPMI-1640 培養(yǎng)液，離心，棄上清，加RPMI-1640 培養(yǎng)液，37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)。細(xì)胞傳代：無菌操作棄培養(yǎng)液，PBS 洗滌，37℃0.25%胰酶消化，制備細(xì)胞懸液，培養(yǎng)箱培養(yǎng)待用。

1.2.2 siRNA 質(zhì)粒構(gòu)建

從NCBI 數(shù)據(jù)庫中查找SMAD5-AS1 信息（NR_026763.1），根據(jù)siRNA 設(shè)計(jì)工具設(shè)計(jì)針對SMAD5-AS1 的siRNA 序列（si-SMAD5-AS1 序列：5′-CCGATAAGCGCGGATCCTTATCT-3′ ）。pLVX-IRES-ZsGreenl-si-SMAD5-AS1 質(zhì)粒委托武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司構(gòu)建。

1.2.3 轉(zhuǎn)染

將細(xì)胞接種至6 孔板，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到90%時，以Lipofectamine? RNAiMAX 脂質(zhì)體法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，按試劑盒操作說明進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：向轉(zhuǎn)染試劑中緩慢加入pLVX-IRES-ZsGreenl-si-SMAD5-AS1 質(zhì)粒，培養(yǎng)4 h，換液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，將該組細(xì)胞記為siRNA-1 組；同法獲得轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的細(xì)胞，記為siRNA 陰性對照組。另取未處理細(xì)胞記為對照組。每組細(xì)胞設(shè)置3 個復(fù)孔。

1.2.4 各組細(xì)胞SMAD5-AS1、EPIC1 信使核糖核酸（mRNA）表達(dá)檢測

向各組細(xì)胞中加入細(xì)胞裂解液，提取細(xì)胞總RNA。反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件：95℃3 min；95℃5 s、56℃10 s、72℃25 s 40 個循環(huán)；65℃5 s。引物序列見表1。用相對定量法［8］對比各組待測基因mRNA 表達(dá)差異。本研究選取GAPDH 作為內(nèi)參基因，以2-ΔΔCt表示各組待測基因mRNA 表達(dá)倍比關(guān)系。

表1 PCR 所需引物序列Table 1 Primer sequences required for PCR

1.2.5 各組細(xì)胞增殖活性檢測

采用CCK8 法檢測細(xì)胞增殖活性。收集細(xì)胞，將細(xì)胞分于96 孔板，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為3×103個/孔，100 μL/孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)過夜，細(xì)胞貼壁后繼續(xù)培養(yǎng)48 h；加入10 μL/孔CCK8 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；酶標(biāo)儀檢測450 nm 處吸光度值。各組細(xì)胞增殖抑制率=（對照組平均吸光度值-轉(zhuǎn)染組平均吸光度值）/對照組平均吸光度值×100.00%。

1.2.6 各組細(xì)胞細(xì)胞周期檢測

收集各組細(xì)胞，離心棄上清，PBS 重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個/mL；離心，加70%乙醇固定4℃過夜；離心棄上清，PBS 洗滌；加入100 μL 核糖核酸酶A（RNaseA），37℃水浴孵育30 min；加入400 μL 碘化丙啶（PI），流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

1.2.7 各組細(xì)胞cyclinD1、Bad、Bcl-2 mRNA 表達(dá)檢測

檢測方法同上，引物序列見表2。

表2 PCR 所需引物序列Table 2 Primer sequences required for PCR

1.2.8 各組細(xì)胞cyclinD1、Bad、Bcl-2 蛋白表達(dá)檢測

取各組細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，4℃充分裂解細(xì)胞，離心，取上清。BCA 法測定蛋白質(zhì)含量，調(diào)整蛋白質(zhì)終濃度為5 μg/μL。每孔上樣量4 μL。蛋白質(zhì)免疫印跡法電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉4℃過夜，加入一抗孵育1 h，含0.05% Tween-20 的PBS 洗滌，加入二抗，室溫孵育1 h。顯色反應(yīng)后，全自動化學(xué)發(fā)光分析儀中檢測，TANON GIS 軟件讀取相關(guān)條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（±s）表示，多組間用方差分析，SNK-q檢驗(yàn)每兩樣之間差異。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞SMAD5-AS1、EPIC1 mRNA 表達(dá)水平檢測

各組細(xì)胞SMAD5-AS1、EPIC1 mRNA 表達(dá)水平比較：對照組＞siRNA 陰性對照組＞siRNA-1 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 SMAD5-AS1、EPIC1 表達(dá)倍比關(guān)系（±s）Table 3 Expression ratio of SMAD5-AS1 and EPIC1（±s）

表3 SMAD5-AS1、EPIC1 表達(dá)倍比關(guān)系（±s）Table 3 Expression ratio of SMAD5-AS1 and EPIC1（±s）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與siRNA 陰性對照組比較，bP＜0.05。

組別對照組siRNA 陰性對照組siRNA-1 組F 值P 值n3 3 3 SMAD5-AS1 1.079±0.209 1.034±0.204a 0.633±0.119ab 5.456 0.045 EPIC1 1.029±0.203 1.014±0.201a 0.209±0.041ab 23.784 0.001

2.2 各組細(xì)胞增殖活性比較

各組細(xì)胞增殖活性比較：siRNA-1 組＞siRNA陰性對照組＞對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

表4 各組細(xì)胞增殖抑制率（±s）Table 4 Proliferation inhibition rates of each group（±s）

表4 各組細(xì)胞增殖抑制率（±s）Table 4 Proliferation inhibition rates of each group（±s）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與siRNA 陰性對照組比較，bP＜0.05。

組別對照組siRNA 陰性對照組siRNA-1 組F 值P 值n3 3 3增殖抑制率（%）0-0.010±0.007a 0.211±0.041ab 81.036 0.000

2.3 各組細(xì)胞周期分布比較

與對照組和siRNA 陰性對照組比較，siRNA-1組細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞占比升高、S 期和G2/M 期占比下降（P=0.043，P=0.046；P=0.043，P=0.029；P=0.002，P=0.002）；對照組和siRNA 陰性對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.967；P=0.874；P=0.875）。見圖1。

圖1 各組細(xì)胞周期分布

2.4 各組細(xì)胞cyclinD1、Bad、Bcl-2 mRNA表達(dá)比較

與對照組和siRNA 陰性對照組比較，siRNA-1組cyclinD1 和Bcl-2 mRNA 表達(dá)均顯著下降（P＜0.05），Bad mRNA 表達(dá)顯著上升（P＜0.05）；對照組和siRNA 陰性對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表5。

表5 cyclinD1、Bad、Bcl-2 表達(dá)倍比關(guān)系（±s）Table 5 Expression ratio of cyclinD1，Bad and Bcl-2（±s）

表5 cyclinD1、Bad、Bcl-2 表達(dá)倍比關(guān)系（±s）Table 5 Expression ratio of cyclinD1，Bad and Bcl-2（±s）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與siRNA 陰性對照組比較，bP＜0.05。

組別對照組siRNA 陰性對照組siRNA-1 組F 值P 值n3 3 3 cyclinD1 1.004±0.187 1.047±0.191 0.420±0.075ab 14.324 0.005 Bad 1.010±0.190 0.953±0.172 6.010±1.181ab 51.946 0.000 Bcl-2 0.998±0.186 0.908±0.169 0.200±0.034ab 26.733 0.001

2.5 各組細(xì)胞cyclinD1、Bad、Bcl-2 蛋白表達(dá)比較

與對照組和siRNA 陰性對照組比較，siRNA-1組cyclinD1 和Bcl-2 蛋白質(zhì)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），Bad 蛋白表達(dá)顯著上升（P＜0.05）；對照組和siRNA 陰性對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表6。

表6 各組細(xì)胞cyclinD1、Bad、Bcl-2 蛋白相對表達(dá)量（±s）Table 6 Relative expression of CyclinD1，Bad and Bcl-2 proteins in cells of each group（±s）

表6 各組細(xì)胞cyclinD1、Bad、Bcl-2 蛋白相對表達(dá)量（±s）Table 6 Relative expression of CyclinD1，Bad and Bcl-2 proteins in cells of each group（±s）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與siRNA 陰性對照組比較，bP＜0.05。

組別對照組siRNA 陰性對照組siRNA-1 組F 值P 值n3 3 3 cyclinD1 0.569±0.039 0.557±0.036 0.471±0.022ab 7.790 0.021 Bad 0.331±0.018 0.319±0.016 0.423±0.020ab 29.731 0.001 Bcl-2 0.556±0.035 0.516±0.032 0.440±0.023ab 11.248 0.009

3 討論

SMAD5-AS1 可調(diào)控癌細(xì)胞增殖，cyclinD1、抗凋亡基因Bcl-2 和促凋亡基因Bad 參與食管癌細(xì)胞增殖［9-10］。然而SMAD5-AS1 能否通過調(diào)節(jié)cyclinD1、Bcl-2 和Bad 表達(dá)調(diào)節(jié)食管癌細(xì)胞增殖尚未有研究報道。故本研究選取食管癌細(xì)胞株Eca109，研究SMAD5-AS1 干擾通過調(diào)控cyclinD1、Bcl-2 和Bad表達(dá)對食管癌細(xì)胞增殖能力的作用機(jī)制。

本研究結(jié)果表明SMAD5-AS1 干擾可有效下調(diào)SMAD5-AS1 和EPIC1 mRNA 的表達(dá)，使癌細(xì)胞周期G1/S 阻滯，抑制癌細(xì)胞增殖。LncRNA 的轉(zhuǎn)錄本長度大于200 個核苷酸，其中轉(zhuǎn)錄方向與鄰近基因轉(zhuǎn)錄方向相反的LncRNA 為反義LncRNA，有研究表明反義LncRNA 參與癌細(xì)胞增殖［11］。SMAD5-AS1是反義LncRNA，下調(diào)SMAD5-AS1 表達(dá)可有效抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移［12］。EPIC1 是一種LncRNA，有研究表明EPIC1 沉默表達(dá)后，胰腺癌細(xì)胞G1/S 周期阻滯，抑制胰腺癌細(xì)胞增殖［13］。本研究與前述研究結(jié)果一致，提示SMAD5-AS1 沉默表達(dá)可能通過抑制SMAD5-AS1 和EPIC1 的表達(dá)，使細(xì)胞G1期阻滯，無法進(jìn)入S 期，阻止癌細(xì)胞分裂，從而抑制癌細(xì)胞增殖。然而又有研究指出SMAD5-AS1與能夠促進(jìn)癌癥發(fā)展的小核苷酸（miRNA）-135b-5p特異性結(jié)合，導(dǎo)致下調(diào)SMAD5-AS1 時miRNA-135b-5p 表達(dá)上升進(jìn)而促進(jìn)腫瘤發(fā)展［14］。也有研究表明在骨肉瘤細(xì)胞過表達(dá)EPIC1 通過促進(jìn)MEF2D泛素化抑制細(xì)胞增殖［15］。本研究與前述兩者研究結(jié)果相反，可能由于不同的作用機(jī)制導(dǎo)致。

本研究結(jié)果表明SMAD5-AS1 干擾可有效下調(diào)cyclinD1 和Bcl-2 表達(dá)水平，上調(diào)Bad 表達(dá)水平。cyclinD1 是G1/S 特異性周期蛋白，促使細(xì)胞由G1期向S 期轉(zhuǎn)換，促進(jìn)細(xì)胞增殖，研究發(fā)現(xiàn)腫瘤中cyclinD1 過度表達(dá)，敲除cyclinD1 后細(xì)胞在G1期阻滯，無法進(jìn)入S 期，抑制癌細(xì)胞增殖［16］。抗凋亡基因Bcl-2 可抑制細(xì)胞凋亡，促凋亡基因Bad 可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，研究表明在腫瘤組織中抑制Bcl-2 表達(dá)、促進(jìn)Bad 表達(dá)可有效抑制癌細(xì)胞的增殖能力。本研究前述研究結(jié)果一致，SMAD5-AS1 沉默表達(dá)后，細(xì)胞周期蛋白cyclinD1、抗凋亡基因Bcl-2 表達(dá)被抑制，同時促凋亡基因Bad 表達(dá)被促進(jìn)，抑制癌細(xì)胞增殖能力。

綜上所述，本研究設(shè)計(jì)合成特異性靶向SMAD5-AS1 的siRNA 序列轉(zhuǎn)染至食管癌細(xì)胞中，證實(shí)抑制SMAD5-AS1 表達(dá)可顯著抑制食管癌細(xì)胞增殖能力，為食管癌的治療提供新的藥物研發(fā)方向；SMAD5-AS1 干擾，使細(xì)胞G1/S 期阻滯，可能通過抑制EPIC1、cyclinD1 和Bcl-2 表達(dá)，促進(jìn)Bad表達(dá)達(dá)到有效抑制癌細(xì)胞增殖的作用。