王令宇，劉司瑜，楊毓賢，王子誠，房經(jīng)貴，上官凌飛

（南京農業(yè)大學園藝學院/江蘇省果樹品種改良與種苗繁育工程中心，江蘇南京 210095）

根據(jù)《中國農業(yè)統(tǒng)計年鑒》統(tǒng)計數(shù)據(jù)，截止到2019年，我國葡萄栽培面積已經(jīng)達到726.20 hm2，僅次于柑橘、蘋果和梨，居于第四位。葡萄是需肥量比較大的果樹，化肥的不合理使用，不僅會造成肥料的浪費，也會造成環(huán)境的污染。肥料的精準施用既可以節(jié)約肥料，均衡土壤養(yǎng)分，又可以減少環(huán)境污染，增加葡萄產(chǎn)量。

葉面施肥操作簡單、用量少，同時具有肥效快、利用率高、對環(huán)境污染小等優(yōu)點[1-2]。在葉面施肥過程中可以結合農藥噴施，在一定程度上能夠減少勞動力的投入[3]。磷鉀是植物生長必需的元素，在植物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著十分重要的作用，對葡萄果實的發(fā)育尤為重要[4-5]。因此，在葡萄果實膨大前噴施KH2PO4可促進其迅速膨大，但是生產(chǎn)上對其噴施時期不能精準把控，造成肥料浪費等問題。因此，葡萄精準施肥在產(chǎn)業(yè)提檔升級和高質量發(fā)展中顯得尤為重要。

基因的表達早于生物體性狀的變化，利用基因信息開發(fā)的生物標記已廣泛應用于動物（花斑裸鯉等）、植物（水稻、菠菜、亞麻等）、人類（遺傳疾病等）等[6-10]。近幾年，已有相關研究報道指出，基于基因表達信息變化開發(fā)的生物標記可以用于指導葡萄生產(chǎn)，如利用葡萄氮代謝基因的表達評價不同氮肥肥效、利用鉀吸收相關基因評價葡萄葉面肥的效果和濃度、利用葡萄花果相關基因的表達情況來指導施肥等[11-14]。磷肥和鉀肥是葡萄果實膨大期所需的主要肥料，本研究選擇了7個磷鉀吸收相關的基因用于生物標記的開發(fā)。其中，VvKUP1、VvKUP2屬于KUP家族鉀轉運體，其功能是促進植物對鉀的吸收和維持細胞內K+濃度。VvSORK、VvSIRK屬于shaker家族，VvSIRK為shaker家族內向整流K+通道基因，主要功能為低親和吸收K+。VvSORK為shaker家族外向整流K+通道基因，VvPHT1-4、VvPHT2-1屬于PHT基因家族，為高親和力磷酸鹽轉運蛋白，主要作用是從外界環(huán)境攝取磷酸鹽。磷調節(jié)子VvPHO1屬于高親和力磷轉運載體基因，增加植物磷元素的吸收[15-18]。本研究以‘陽光玫瑰’‘巨峰’葡萄為試材，在分子水平研究葉面噴施磷鉀肥的最佳時期，開發(fā)相關的生物標記，對葡萄的精準施肥具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料來源

試驗位于淮安市盱眙縣穆店鎮(zhèn)，江蘇省龍誠農業(yè)發(fā)展有限公司基地。‘巨峰’和‘陽光玫瑰’葡萄均為3年生，大H架設施栽培。園區(qū)為智能水肥一體化管理，土壤pH為5.8，有效磷含量為29.1 mg·kg-1、速效鉀含量為51.4 mg·kg-1。

KH2PO4購自南京化學試劑有限公司。反轉錄試劑盒購自南京TaKaRa有限公司。熒光定量染料SYBR GreenⅠ購自上海浦迪生物科技有限公司。所用引物由北京通用生物技術有限責任公司合成（表1）。

1.2 肥料噴施處理

選取大面積種植園區(qū)，每個品種分別在坐果后7 d（6月7日，AFS7）、11 d（6月11日，AFS11）、15 d（6月15日，AFS15）選取發(fā)育基本一致的植株，選擇陰天或者上午9:00前對葡萄葉片正反面均勻噴施0.3%KH2PO4溶液，以葉面下滴溶液為止，每處理3次重復。4個處理記為T1（AFS7）、T2（AFS11）、T3（AFS15）和噴施清水的對照CK。在AFS3（6月3日）、AFS7（6月7日）、AFS11（6月11日）、AFS15（6月15日）、AFS19（6月19日）噴施之前采集第8～9節(jié)位的成熟葉片，并用液氮處理，放-80 ℃冰箱，用于測定葉片內磷鉀吸收相關基因的表達。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 生理指標

每個處理在噴施前采樣一次和噴施后每4 d隨機采集30粒果，最后一次采樣為坐果后27 d，用于果實縱橫徑以及粒質量的測量。穗質量和粒質量用電子天平稱量，精確到0.01 g，取平均值。用游標卡尺隨機測量各個處理5粒果實的縱徑和橫徑，精確到0.01 cm，取均值。

1.3.2 RNA提取與cDNA的合成

總RNA提取采用改良CTAB法[19]，DNA去除使用TaKaRa試劑盒，RNA濃度使用超微量分光光度計（型號為Nanodrop-100a）檢測，完整性使用瓊脂糖電泳檢查。以提取的RNA為反轉錄模版，使用TaKaRa試劑盒（型號為ES10）反轉錄為cDNA，所得cDNA置于-20℃貯藏，用于基因表達趨勢分析。

1.3.3 熒光定量PCR

利用Primer Premier 5.0軟件，分別設計看家基因以及與磷鉀吸收相關基因：Shaker家族內向整流鉀離子通道（inward rectifying shaker-like K+channel, VvSIRK）、shaker家族外向整流鉀離子通道（shaker-like potassium channel, VvSORK）[12]；磷轉運體1-4（phosphate transporters1-4,VvPHT1-4）、磷轉運體2-1（phosphate transporters2-1,VvPHT2-1）、木質部磷離子轉載轉運體1（Xylem phosphorusion transporter1,VvPHO1）、鉀轉運蛋白基因1（Potassium protein, VvKUP1）、鉀轉運蛋白基因2（Potassium protein, VvKUP2）等基因的定量PCR引物見表1。

以葡萄看家基因Actin為內參，按照SYBR Premix ExTaqTM試劑盒說明書，采用實時熒光定量PCR（realtime quantitative PCR, RT-qPCR）方法測定基因的相對表達量。反應體系分為（1）擴增體系：cDNA 1.0 μL，上下游引物為0.8 μL（表1），反應MIX 10 μL，ddH2O 7.4 μL，總體系是20 μL。（2）程序是：95 ℃變性1 min，Tm退火20 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)，退火溫度58 ℃，反應結束后分析融解曲和熒光值變化曲線。3個重復，試驗數(shù)據(jù)用Excel和LinReg PCR[13]軟件分析，采用2-△CT計算方法，以CK計算相對表達量。

表1 熒光定量PCR引物Table 1 Fluorescent quantitative PCR primers

2 結果分析

2.1 不同時期噴施KH2PO4對果?？v橫徑的影響

由表2可以看出，T3處理‘巨峰’果實縱徑和橫徑與CK差異顯著，縱徑增加大約21%，橫徑增加大約10%。由表2可以得到，經(jīng)施肥處理的‘陽光玫瑰’果實的縱橫徑與CK相比增加明顯，尤其是T3處理效果最好，縱徑與CK相比增加約17%，橫徑增加約15%。結果表明，在不同時期噴施的KH2PO4均促進了果實縱橫徑的增加，以T3效果最好。

表2 不同時期噴施KH2PO4對果實縱橫徑的影響Table 2 Effect of spraying KH2PO4 in different times on fruit vertical and horizontal diameter

2.2 不同時期噴施KH2PO4對果粒質量的影響

葡萄果實粒質量是評價果實外觀品質的重要參考，也是本試驗最重要的一個指標。結果顯示，葉面噴施磷鉀肥均有效的增加了果粒質量。‘巨峰’以T3施肥效果最好，如圖1A施肥處理較對照處理差異明顯，在噴后27 d，T3處理粒質量已經(jīng)超過5 g，對照組不足4 g，增加約25%。‘陽光玫瑰’也是第3次施肥效果最好，如圖1B，T3（AFS15）處理在噴后27 d時果實粒質量達到了6.5 g以上，對照為5.5 g左右，增加大約為18%。

圖1 不同時期噴施磷酸二氫鉀對兩品種果粒質量的影響Figure 1 Effect of spraying KH2PO4 on fruit weight in different periods

2.3 不同時期葡萄葉片磷鉀吸收基因的表達情況

2.3.1 不同時期‘陽光玫瑰’葉片磷鉀吸收基因的表達

通過對‘陽光玫瑰’5個時期的葉片進行基因表達趨勢分析（圖2）可得：磷鉀吸收基因VvKUP1的表達趨勢先上升再下降，以AFS7表達量最高；VvKUP2的表達趨勢先降低再上升再降低，以AFS3和AFS11表達量較高。VvSORK的表達趨勢總體下降；VvPHT1-4的表達趨勢是先下降再上升，在AFS15表達量達到最大值然后下降。VvSIRK基因的表達趨勢是先上升再下降，以AFS11和AFS15表達量較高。VvPHT2-1表達趨勢是先下降再上升再下降，以AFS3表達量最高。VvPHO1基因的表達趨勢是先上升再下降，再上升，以AFS19表達量最高。經(jīng)過表型數(shù)據(jù)可得‘陽光玫瑰’最佳的施肥處理為T3，即花后15 d施肥最佳。此時，VvKUP2、VvPHT2-1基因表達趨勢表現(xiàn)為在AFS11上升、在AFS15下降；VvPHO1的表達趨勢都為AFS11下降，AFS15上升，VvPHT1-4的表達趨勢則為在AFS15突然上升并表達量到達最大值。

圖2 坐果后‘陽光玫瑰’葉片磷鉀吸收基因的表達情況Figure 2 Expression of phosphorus and potassium genes in leaves of 'Shine Muscat' after fruit setting

2.3.2 不同時期‘巨峰’葉片磷鉀吸收基因的表達情況

圖3顯示，磷鉀相關基因在不同時期葉片的表達量不同，這可能與植株在各個時期所吸收的營養(yǎng)元素有關?！薹濉汀柟饷倒濉牧租浳障嚓P基因的表達趨勢大致相同，如‘陽光玫瑰’和‘巨峰’在最佳施肥時期時，VvKUP1基因都表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢，VvPHO1的表達量都表現(xiàn)為先下降再上升的趨勢，VvSORK總體表現(xiàn)為下降的趨勢，VvPHT1-4、VvPHT2-1基因都是先下降再上升再下降的趨勢，VvSIRK表達量都是先上升后下降。VvKUP2基因的表達量在‘巨峰’中表現(xiàn)為先升高再降低，而在‘陽光玫瑰’中表現(xiàn)為先降低再上升再降低。經(jīng)過縱橫徑和粒質量分析可得，‘巨峰’最佳的施肥處理為T3，VvKUP2、VvSORK基因的表達趨勢都表現(xiàn)為AFS11表達量上升、AFS15表達量下降；VvPHT2-1和VvPHO1的表達趨勢都為AFS711先下降，在坐果后AFS15再上升。

圖3 坐果后‘巨峰’葉片磷鉀吸收基因的表達情況Figure 3 Expression of phosphorus and potassium genes in leaves of 'Kyoho' after fruit setting

2.4 生物標記的開發(fā)與利用

2.4.1 生物標記的開發(fā)

通過對‘陽光玫瑰’和‘巨峰’果實粒質量和縱橫徑分析，確定出最佳施肥日期，再結合基因表達趨勢分析結果可以得出，VvSORK和VvKUP2基因的表達趨勢由上升轉為下降，VvPHO1和VvPHT1-4基因的表達趨勢由下降轉為上升，且VvPHO1/VvPHT2-1的比值為3～4，VvPHT1-4/VvPHT2-1的比值為27～35時為最佳施肥日期（圖4）。綜合考慮可以作為確定最佳噴施膨果肥日期的判定依據(jù)，達到減肥增效的目的。

圖4 坐果后葉片VvPHO1-4/VvPHT2-1和VvPHO1/VvPHT2-1的比值Figure 4 The ratio of VvPHO1-4/VvPHT2-1 and VvPHO1/VvPHT2-1 of leaves after fruit setting

2.4.2 生物標記的利用

當‘巨峰’‘陽光玫瑰’果實坐果后，每隔3 d采集一次葉片，用于RNA的提取、反轉錄，再進行熒光定量RCR分析是否符合標記規(guī)律。若符合，立即葉面噴施KH2PO4，此時噴施促進果實膨大效果最好，流程見圖5。

圖5 生物標記使用示意圖Figure 5 Biomarker diagram of biomarker utilization

3 討論

磷、鉀元素在植物細胞中較為豐富，對植物的生長發(fā)育具有重要的影響，如促進光合作用、維持滲透壓、調節(jié)氣孔和細胞伸長、提高葉片葉綠素含量等[20-21]。葉面施肥技術已經(jīng)在番茄、小麥、棉花等作物上廣泛使用和深入研究[22-24]。葡萄葉面噴施是彌補土壤缺肥的有效措施，具有利用率高、效果顯著、用肥少、見效快的特點[25-26]。本研究表明，對‘陽光玫瑰’‘巨峰’葉面噴施磷鉀肥均促進葡萄果實縱橫徑的增加和粒質量的提高。

肥料施用的種類、濃度和時期是決定葉面肥效果的關鍵因素。不同時期的葡萄對磷鉀肥的要求不同，傳統(tǒng)施肥時期是基于樹木生長確定磷肥和鉀肥的需求判斷，屬于經(jīng)驗判斷，很難做到精準施肥[22-23]。傳統(tǒng)施肥不僅沒有最佳的施肥效果，也造成了肥料的浪費和環(huán)境的污染。開發(fā)用于施肥最佳時期判定的生物標記，利用分子診斷方法提前預測和精準判斷樹體生理狀況，可以做到精準施肥，減少肥料浪費[24-25]。

生物標記能夠精準鑒定有機體的生命狀態(tài)和生理階段，預判某種疾病是否存在[26-27]。隨著農業(yè)科技的不斷發(fā)展，農業(yè)生產(chǎn)逐步由“傳統(tǒng)農業(yè)”過渡走向“精準農業(yè)”。農業(yè)對精準的要求以及生物標記在生命體特征預判上的優(yōu)越性促進了生物標記在農業(yè)上的應用，已經(jīng)成為精準農業(yè)的重要依據(jù)。有很多研究證據(jù)表明，利用相關基因的表達情況，可以預測植物的營養(yǎng)狀況[1,28-32]。基因信息可以精準地反映植物體各種生理狀態(tài)，可以作為精準施肥的依據(jù)。

李傲等[29]研究表明，在葡萄果實膨大期噴施0.3%的KH2PO4的效果最好，可以促進果實膨大。在葡萄對磷鉀元素的研究中，主要聚集在根系吸收磷鉀元素和不同鉀肥種類對葡萄果實品質的影響上，對于葉面噴施磷鉀肥最佳時期的判斷研究不多[33-37]。本試驗在果實膨大期進行葉面噴施KH2PO4，測定果實的粒質量和縱橫徑，并采集不同時期的葉片用于測定葉片中磷鉀吸收相關基因的表達，結合生理和基因表達，篩選出一套可用于提前預測噴施膨果肥的最佳時期的生物標記。將來，可以開發(fā)快速檢測試劑盒，結合高密度田間采樣，實現(xiàn)葡萄大規(guī)模種植園的精準施肥管理，達到減少肥料施用和省工省力的目的。

4 結論

葉面噴施磷鉀肥可以有效促進果實增大，結合生理數(shù)據(jù)和基因表達，篩選出一套可作為噴施磷鉀肥最佳時期判定的生物標記，VvSORK和VvKUP2基因的表達趨勢由上升轉為下降，VvPHO1和VvPHT1-4基因的表達趨勢由下降轉為上升，且VvPHO1/VvPHT2-1的比值為3～4，VvPHT1-4/VvPHT2-1的比值為27～35。