尹莉慧，黃喬木，呂 中

武漢工程大學(xué)環(huán)境生態(tài)與生物工程學(xué)院，湖北武漢430205

0 引 言

齲齒是一種慢性細(xì)菌性口腔疾病。細(xì)菌對(duì)食物中的碳水化合物進(jìn)行發(fā)酵會(huì)產(chǎn)生酸性有害物質(zhì)，這些有害物質(zhì)通過(guò)局部破壞敏感的牙齒硬組織形成齲齒[1]。齲齒對(duì)全球60%的兒童和幾乎所有的成人造成影響，若治療不及時(shí)，細(xì)菌會(huì)在牙齒表面產(chǎn)酸并形成牙菌斑生物膜，導(dǎo)致牙齒出現(xiàn)空洞或腐爛[2]。變異鏈球菌(Streptococcus mutans，S. mutans)是致齲齒的主要病原菌，廣泛存在于口腔中，與糖代謝產(chǎn)酸和牙菌斑有關(guān)[3]。目前最常用的口腔抗菌藥物有洗必泰[4]和抗生素[5]等。但是這些藥物都存在著一些不足，如長(zhǎng)時(shí)間使用洗必泰會(huì)造成牙齒變色、牙齦脫落和刺激口腔黏膜等問題[6]，而過(guò)度使用抗生素會(huì)造成致齲細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性[7]。因此，研究新的口腔抗菌策略具有重要意義。

近年來(lái)，光催化技術(shù)在抗菌領(lǐng)域的應(yīng)用引起人們的廣泛關(guān)注。光催化劑在光誘導(dǎo)下產(chǎn)生活性氧物種(reactive oxygen species，ROS)，如羥 基 自由基(·OH)、超氧陰離子(O2-·)等，它們通過(guò)破壞細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)影響細(xì)菌活性[8]。二氧化鈦(TiO2)因性能穩(wěn)定、催化效率高、生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛地應(yīng)用于催化和抗菌領(lǐng)域[9，10]，同時(shí)，因其長(zhǎng)效抗菌效率、表面防腐蝕特性被廣泛應(yīng)用于口腔疾病的治療[11]。TiO2在紫外光照射下對(duì)口腔致病菌白色念珠菌有抑制作用[12]。但TiO2的廣泛應(yīng)用受到其寬帶隙(如銳鈦礦型TiO2帶隙為3.2 eV)的限制[13]。寬帶隙使TiO2只能被波長(zhǎng)小于390 nm 的紫外光激發(fā)，光利用率較低[14，15]。將金屬和金屬氧化物負(fù)載至TiO2的晶格中對(duì)其表面進(jìn)行光敏化，能有效增強(qiáng)TiO2的光利用率[16]。銅等金屬摻入TiO2使其帶隙向可見光譜移動(dòng)，這使其在暴露于可見光時(shí)表現(xiàn)出光催化活性增強(qiáng)[17]。少量的銀摻入TiO2也能在可見光照射下對(duì)S. mutans產(chǎn)生抗菌作用[18]，但其抗菌機(jī)理尚未見報(bào)道。

發(fā)光二級(jí)管(light-emitting diode，LED)固化燈常用于牙科復(fù)合樹脂等修復(fù)材料的光固化，其波長(zhǎng)在420～480 nm 可見光范圍[19]。有報(bào)道將LED 固化燈與光敏劑聯(lián)合應(yīng)用于口腔細(xì)菌的治療[20]，但是這些光敏劑多為有機(jī)染料，具有生物相容性和穩(wěn)定性較差等缺點(diǎn)。根據(jù)已有的研究[21]，Ag/ZnO 納米復(fù)合材料與LED 聯(lián)合使用在5 min 內(nèi)能殺滅99.8%的S. mutans。Liu 等[13]也發(fā)現(xiàn)Ag2O/TiO2復(fù)合材料能夠在可見光下被激發(fā)產(chǎn)生ROS 抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)室前期發(fā)現(xiàn)單獨(dú)的Ag2O/TiO2長(zhǎng)時(shí)間(24 h)作用于S. mutans有明顯的抗菌效果[22]，但長(zhǎng)時(shí)間的藥物作用不利于牙科疾病的治療?；谏鲜龉ぷ?，本研究將Ag2O/TiO2復(fù)合材料與牙科常用的LED 固化燈結(jié)合，測(cè)定材料在LED 光照下短時(shí)間(5 min)的抗菌活性以及抗菌機(jī)理，為其用于牙科疾病治療提供理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)和方法

1.1 試劑和儀器

試劑：鈦酸四丁酯(TBT)(天津百世有限公司)，硝酸銀(AgNO3)、N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)(阿拉丁試劑有限公司)，活死細(xì)菌染色試劑盒LIVE/DEAD BacLightTMBacterial Viability Kit1897713(Thermo Fisher 公司)，對(duì)苯二甲酸(TA)、氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)(Adamas 試劑有限公司)，厭氧產(chǎn)氣袋(三菱瓦斯化學(xué)株式會(huì)社AnaeroPack)，二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA)(Sigma 有限公司)；上述試劑均為分析純，使用前未經(jīng)進(jìn)一步純化；變異鏈球菌UA159 (Streptococcus mutansUA159，S. mutans)來(lái)自武漢大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，培養(yǎng)基為心浸液肉湯培養(yǎng)基(BHI，Oxoid 公司)和瓊脂粉(Bio-Froxx 生物試劑公司)。

儀器：D8 ADVANCE 型X 射線粉末衍射儀(XRD，Bruker 公 司)，JSM 5510LV 型 掃 描 電 鏡(SEM，日本電子株式會(huì)社)，GeminiSEM 300 型場(chǎng)發(fā)射 電 子 掃 描 電 鏡(FE-SEM，Carl Zeiss 公 司)，F(xiàn)-4700 型熒光分光光度計(jì)(日本電子株式會(huì)社)，UV-2600 型紫外-可見分光光度計(jì)(UV-Vis，島津公司)，Ⅸ73 型倒置熒光顯微鏡(奧林巴斯公司)；采用牙科臨床常用的LED55-B 型LED 燈(TPC 醫(yī)療器械有限公司，420 nm＜λ＜480 nm，150 mW/cm2)作為光源，燈源截面直徑為0.6 cm，燈源與混合液液面保持0.5 cm 的距離。

1.2 Ag2O/TiO2的制備和表征

Ag2O/TiO2的制備參照文獻(xiàn)方法[23]。取2 mL TBT 溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%)逐滴加入60 mL 冰醋酸中，超聲分散后將混合液倒入反應(yīng)釜中，于160 °C反應(yīng)5 h，8 000 r/min 離心10 min，所得沉淀經(jīng)洗滌、干燥后研磨得到白色TiO2粉末。將Ag2O 和TiO2按摩爾比1∶10 制備Ag2O/TiO2。稱取0.2 g 合成的TiO2超聲分散于25 mL 去離子水中，與25 mL 20 mmol/L AgNO3溶液超聲混合，在避光條件下向上述混合液中逐滴加入25 mL 0.2 mol/L NaOH 溶液，反應(yīng)30 min 后以8 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心10 min，所得沉淀經(jīng)洗滌、干燥后研磨得到淡黃色Ag2O/TiO2粉末。

樣品的組成通過(guò)XRD 在2θ=10°～80°范圍內(nèi)表征，漫反射光譜(DRS)通過(guò)紫外-可見分光光度計(jì)在200～800 nm 范圍掃描獲得，形貌通過(guò)FE-SEM觀察。

1.3 抗菌實(shí)驗(yàn)和活死細(xì)菌染色

過(guò)夜培養(yǎng)的S. mutans用BHI 液體培養(yǎng)基稀釋至2×107CFU/mL，分別與終濃度為0.125、0.250、0.500 mg/mL 的Ag2O/TiO2BHI 懸浮液和1 mg/mL 的TiO2BHI 懸浮液在96 孔板中混合均勻，總體積為120 μL。LED 固化燈光照5 min，將菌液倍比稀釋后取10 μL 均勻涂布在培養(yǎng)皿上，于37 °C 培養(yǎng)24 h 后進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。未被材料和LED 光作用的細(xì)菌設(shè)為對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

用活死細(xì)菌染色試劑盒對(duì)光照作用完成后的菌液進(jìn)行染色處理0.5 h。其中染色劑SYTO 9 和PI 的終濃度分別為6 μmol/L 和30 μmol/L。取10 μL 染色后的菌液滴加到載玻片上，用熒光顯微鏡觀察。未被材料和LED 光作用的細(xì)菌作為對(duì)照組。

1.4 細(xì)菌形貌觀察

LED 固 化 燈 照 射Ag2O/TiO2（0.500 mg/mL）和S. mutans的混合液5 min，用2.5% 戊二醛在4°C 固定細(xì)菌細(xì)胞2 h，然后用酒精（50%）將細(xì)菌脫水3 min，再分別用75%、85%、95%和100%酒精進(jìn)行梯度脫水，用FE-SEM 觀察細(xì)菌的形貌。未被材料和LED 光作用的組設(shè)為對(duì)照組。

1.5 ROS 檢測(cè)

反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的ROS 利用TA 和NBT 檢測(cè)。TA 本身無(wú)熒光，但與·OH 反應(yīng)生成2-羥基對(duì)苯二甲酸復(fù)合物時(shí)產(chǎn)生熒光，且熒光強(qiáng)度與·OH 濃度直接相關(guān)；NBT 在259 nm 處有吸收峰，當(dāng)與反 應(yīng) 后 此 吸 收 峰 消 失[24]。將0.125、0.250、0.500 mg/mL 的Ag2O/TiO2懸浮液分別與終濃度為20 μmol/L TA 溶液和20 μmol/L NBT 溶液混合，LED光照5 min 后檢測(cè)混合溶液在315 nm 光的激發(fā)下，425 nm 處發(fā)射峰的熒光強(qiáng)度和259 nm 處吸收峰的光強(qiáng)度。

細(xì)胞內(nèi)ROS 利用熒光探針DCFH-DA 檢測(cè)。DCFH-DA 本身沒有熒光，進(jìn)入細(xì)胞后被酯酶水解生成DCFH。細(xì)胞內(nèi)的ROS 能夠氧化無(wú)熒光的DCFH 生 成 有 熒 光 的 二 氯 熒 光 素（DCF）[25]。用LED 分 別 光 照0.125、0.250、0.500 mg/mL 的Ag2O/TiO2和2×108CFU/mLS. mutans混 合 液，再向體系中加入100 μmol/L DCFH-DA，檢測(cè)混合溶液在488 nm 光激發(fā)下，在535 nm 處發(fā)射峰的熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果與討論

2.1 Ag2O/TiO2復(fù)合材料的表征

圖1(a)為復(fù)合材料的XRD 圖，所合成的TiO2衍射峰與銳鈦型TiO2(JCPDS 4-477)的特征峰相一致；復(fù)合材料中除了能觀察到TiO2的衍射峰以外，還能觀察到Ag2O 的特征峰(JCPDS 1-1041)，表明Ag2O/TiO2成功合成。圖1(b)是合成樣品的DRS圖，TiO2僅能吸收波長(zhǎng)小于390 nm 的光，負(fù)載Ag2O顆粒后，Ag2O/TiO2在200～800 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)都表現(xiàn)出高的吸收，表明Ag2O/TiO2具有廣譜的光吸收能力。TiO2和Ag2O/TiO2的SEM 圖分別如圖1(c)和(d)所示，可以觀察到TiO2為直徑1～2 μm 的微球，TiO2負(fù)載Ag2O 后形貌和大小均無(wú)明顯改變。

圖1 Ag2O/TiO2的表征（a）XRD 圖；（b）DRS 圖；TiO2（c）和Ag2O/TiO2（d）的SEM 圖Fig.1 Characterization of Ag2O/TiO2:(a)XRD patterns;(b)DRS spectra;SEM images of TiO2(c)and Ag2O/TiO2(d)

2.2 Ag2O/TiO2+LED 對(duì)S. mutans的 抗 菌 活 性

圖2(a)～(b)顯 示 了LED 光 照 下Ag2O/TiO2對(duì)S. mutans的抗菌活性。由圖2(a)可知，1 mg/mL TiO2在5 min LED 光照下對(duì)浮游態(tài)S. mutans幾乎無(wú)抗菌作用，0.500 mg/mL Ag2O/TiO2在無(wú)LED 光照時(shí)對(duì)S. mutans的存活數(shù)量也無(wú)明顯影響(圖2(b))。但Ag2O/TiO2在LED 照射5 min 后，S. mutans的菌落數(shù)明顯減少。與無(wú)光照相比，LED 光照使0.125、0.250 mg/mL Ag2O/TiO2作用S. mutans的菌落數(shù)的lgCFU 分別下降了1.33 和3.58，使0.500 mg/mL Ag2O/TiO2將S. mutans全部殺死(圖2(b))。以上結(jié)果表明LED 光照有效增強(qiáng)了Ag2O/TiO2在短時(shí)間內(nèi)對(duì)S. mutans的殺滅作用。根據(jù)報(bào)道，氧化銅納米顆粒對(duì)S. mutans的最低抑菌濃度為1 mg/mL[26]；二氧化鈰納米顆粒對(duì)S. mutans的最低抑菌濃度為1 mg/mL[27]；銀修飾的還原石墨烯納米復(fù)合物對(duì)S. mutans的最低抑菌濃度為1.28 mg/mL[28]；鋰摻雜的生物玻璃對(duì)S. mutans的最低抑菌濃度為50 mg/mL[29]；1 mg/mL Ag/ZnO 在LED 光 照 條 件下能殺死99.8%的S. mutans[21]?？梢?，利用LED光照增強(qiáng)Ag2O/TiO2抗菌活性，可以使用相對(duì)較小量的催化劑達(dá)到與文獻(xiàn)相當(dāng)?shù)囊志Ч?/p>

為了更加直觀地觀察LED 光照增強(qiáng)Ag2O/TiO2的抗菌效果，加入熒光染色劑SYTO 9（綠色熒光）和PI（紅色熒光）分別對(duì)活、死細(xì)菌進(jìn)行染色。如圖2(c)所示，未經(jīng)處理的空白組（Control）和僅用LED 或僅 用Ag2O/TiO2作用5 min 的 組 別，呈現(xiàn) 的幾乎都是綠色熒光，表明上述操作均不能殺滅浮游態(tài)S.mutans；而在Ag2O/TiO2與LED 固化燈聯(lián)用的組別中，可以看到熒光全部呈現(xiàn)紅色，說(shuō)明浮游態(tài)S. mutans幾乎被完全殺滅。

圖2 LED 光照下Ag2O/TiO2對(duì)S.mutans的抗菌活性（a）LED 光照下TiO2作用后的細(xì)菌存活率；（b）有無(wú)LED 光照下Ag2O/TiO2作用后的細(xì)菌存活率；（c）有無(wú)LED 光照下Ag2O/TiO2作用后S.mutans的熒光染色照片；ND：未檢測(cè)到細(xì)菌；*p＜0.05：與Ag2O/TiO2同濃度無(wú)光照處理組存在顯著差異Fig.2 Antibacterial activity of Ag2O/TiO2againstS. mutansunder LED light(a)Bacteria viability of TiO2under LED light;(b)bacteria viability of Ag2O/TiO2with or without LED light;(c)fluorescence staining ofS.mutanswith Ag2O/TiO2with or without LED light;ND:no bacteria were detected;*p＜0.05:significantly different from the group without LED illumination at equivalent Ag2O/TiO2doses

2.3 Ag2O/TiO2+LED 作 用 后S. mutans的 形 貌

細(xì)菌結(jié)構(gòu)的破壞是導(dǎo)致其死亡的原因之一。如圖3(a)～(d)所示，在未經(jīng)處理的空白組(圖3(a))和僅用LED(圖3(b))或僅用Ag2O/TiO2作用5 min(圖3(c))的組別中，細(xì)菌細(xì)胞表面光滑圓潤(rùn)，形貌未受到影響。而在Ag2O/TiO2與LED 聯(lián)用(圖3(d))的組別中，可以明顯觀察到細(xì)菌細(xì)胞表面變得粗糙、皺縮，出現(xiàn)破損，表明細(xì)菌遭到破壞。

圖3 LED 光照下Ag2O/TiO2作用于S.mutans的FE-SEM 圖（a）空白組；（b）LED；（c）Ag2O/TiO2；（d）Ag2O/TiO2+LED；紅色箭頭指示細(xì)胞破損Fig.3 FE-SEM images of Ag2O/TiO2onS. mutansunder LED light(a)Control;(b)LED;(c)Ag2O/TiO2;(d)Ag2O/TiO2+LED;The red arrow indicates cell damage

2.4 Ag2O/TiO2+LED 產(chǎn) 生 的ROS 種 類

光催化材料在光照條件下產(chǎn)生的ROS 主要為·OH 和O2-·[11]。本文考察了LED 光照下Ag2O/TiO2產(chǎn)生的ROS 種類，結(jié)果如圖4(a)～(d)所示。為了檢測(cè)LED 光照Ag2O/TiO2所產(chǎn)生的ROS 種類，引 入·OH 的 捕 獲 劑TA 和O2-·的 捕 獲 劑NBT。Ag2O/TiO2和TA 在無(wú)LED 光照條件下作用5 min，反應(yīng)體系中僅0.500 mg/mL 的Ag2O/TiO2可以檢測(cè) 到 少 量 的·OH 產(chǎn) 生(圖4(a))；而Ag2O/TiO2在LED 光照后，即使Ag2O/TiO2濃度低至0.125 mg/mL 也能產(chǎn)生·OH，且·OH 的生成量顯著高于未加光照的高濃度組的生成量(圖4(b))。圖4(c)和(d)是NBT 捕獲O2-·的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以看到，無(wú)論在有或無(wú)LED 光照射下，Ag2O/TiO2均沒有O2-·的產(chǎn)生。以上結(jié)果表明，在LED 光照下Ag2O/TiO2的體系中產(chǎn)生的ROS 為·OH。

圖4 LED 光照下Ag2O/TiO2產(chǎn)生的ROS 種類Ag2O/TiO2+TA 在無(wú)光照（a）和LED 光照（b）下的UV-Vis 圖；Ag2O/TiO2+NBT 在無(wú)光照（c）和LED 光照（d）下的UV-Vis 圖Fig.4 ROS species produced by Ag2O/TiO2under LED light UV-Vis spectra of Ag2O/TiO2+TA without(a)and with (b)LED light;UV-Vis spectra of Ag2O/TiO2+NBT without(c)and with (d)LED light

2.5 LED 光照增強(qiáng)Ag2O/TiO2抗菌活性的機(jī)理

光催化材料在光照時(shí)產(chǎn)生ROS，這些ROS 進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)部會(huì)氧化DNA、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等生物大分子，導(dǎo)致細(xì)菌死亡[30]。

為了探究Ag2O/TiO2在LED 光照下是否通過(guò)產(chǎn)生ROS 發(fā)揮抗菌作用，加入ROS 捕獲劑NAC 對(duì)材料在光照下產(chǎn)生的ROS 進(jìn)行捕獲并測(cè)定其抗菌活性。由圖5(a)可知，單獨(dú)的NAC (5 mmol/L)在LED 光照下對(duì)S. mutans無(wú)抗菌作用；Ag2O/TiO2+LED 能 夠 在5 min 內(nèi) 殺 滅S. mutans；而Ag2O/TiO2+LED 組 在 加 入NAC 后，S. mutans的存活率與空白組相比幾乎無(wú)改變。上述結(jié)果表明，LED 增強(qiáng)Ag2O/TiO2的抗菌活性主要通過(guò)光照使材料產(chǎn)生ROS，從而發(fā)揮抗菌作用。

為了進(jìn)一步確定ROS 能否進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)使細(xì)菌發(fā)生氧化損傷，采用DCFH-DA 熒光探針檢測(cè)胞內(nèi)ROS。如圖5(b)所示，無(wú)光照條件下Ag2O/TiO2作用5 min 僅產(chǎn)生低的熒光強(qiáng)度，表明胞內(nèi)ROS 產(chǎn) 生 較 少；而LED 光 照Ag2O/TiO2作 用S. mutans5 min 后，熒光強(qiáng)度顯著提高，說(shuō)明LED光照Ag2O/TiO2使S. mutans細(xì)胞內(nèi)的ROS 顯著地增加(圖5(c))。這些ROS 氧化了胞內(nèi)生物大分子，導(dǎo)致了細(xì)菌死亡。

圖5 LED 光照增強(qiáng)Ag2O/TiO2抗菌活性機(jī)理（a）細(xì)胞存活率；無(wú)光照（b）和LED 光照（c）下的胞內(nèi)ROS 含量；ND：未檢測(cè)到細(xì)菌；*p＜0.05：與空白組存在顯著差異Fig.5 Mechanism of LED light enhancing the antibacterial activity of Ag2O/TiO2(a)Bacteria viability;intracellular ROS content of Ag2O/TiO2without(b)or with (c)LED light;ND:no bacteria were detected;*p＜0.05:significantly different from control

3 結(jié) 語(yǔ)

本文將Ag2O/TiO2復(fù)合材料與牙科常用LED固化燈結(jié)合，測(cè)定在LED 短時(shí)間(5 min)照射下Ag2O/TiO2復(fù)合材料對(duì)齲齒主要致病菌S. mutans的抗菌活性，并探討了其作用機(jī)理。根據(jù)本文的結(jié)果，LED 固化燈光照顯著增強(qiáng)了Ag2O/TiO2復(fù)合材料在短時(shí)間內(nèi)對(duì)S. mutans的殺滅能力。其機(jī)制涉及LED 光照使Ag2O/TiO2產(chǎn)生·OH，破壞了細(xì)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)，并進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，促使細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)ROS含量增加，從而破壞生物大分子的功能。LED 光照射Ag2O/TiO2復(fù)合材料的抗菌治療方法簡(jiǎn)便、易行，作用時(shí)間短，抗菌效果顯著，具有應(yīng)用于牙科臨床抗菌的潛力。