余卓恒，宋文剛，梁靜文

1.廣東省深圳市龍崗中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東深圳 518116；2.北華大學(xué)醫(yī)學(xué)部，吉林吉林 132000

精神分裂癥是困擾現(xiàn)代人類的重大慢性精神疾病之一，主要在青春期發(fā)作，持續(xù)終生。它干擾了患者多方面的生活，其復(fù)雜的病因和發(fā)病機(jī)制使大部分患者的臨床療效并不明顯，同時(shí)也給社會(huì)和家庭造成嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)[1-2]。近年研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群失調(diào)是精神類疾病發(fā)病的重要影響因素[3]，腸道微生物可通過微生物-腸-腦軸影響神經(jīng)遞質(zhì)的分泌，從而影響神經(jīng)發(fā)育、認(rèn)知和行為，而且通過神經(jīng)內(nèi)分泌可調(diào)節(jié)多種神經(jīng)遞質(zhì)參與精神疾病的發(fā)生和發(fā)展[4]。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于精神分裂癥與腸道菌群方面的研究并不多。本研究擬收集精神分裂癥患者和體檢健康者的糞便標(biāo)本，進(jìn)行16S rRNA高通量測(cè)序，并采用液相色譜-質(zhì)譜(LC-MC)非靶向代謝組學(xué)方法檢測(cè)精神分裂癥患者和體檢健康者糞便標(biāo)本代謝產(chǎn)物，分析精神分裂癥患者腸道菌群結(jié)構(gòu)及其代謝產(chǎn)物變化，尋找腸道菌群改變影響精神分裂癥患者代謝產(chǎn)物的相關(guān)機(jī)制，并尋找特征性指標(biāo)協(xié)助臨床診斷精神分裂癥。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2020年5-11月在深圳市龍崗中心醫(yī)院收治住院的21例精神分裂癥患者的糞便標(biāo)本作為精神分裂癥組，其中男11例，女10例；年齡21～71歲，平均(44.48±5.39)歲。精神分裂癥患者納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合精神分裂癥相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)，由兩名精神科醫(yī)生(至少1名醫(yī)生為副主任醫(yī)師以上職稱)診斷一致；(2)患者疾病史均在1年以上，服用藥物種類相對(duì)一致且病情相對(duì)穩(wěn)定。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者合并有糖尿病、甲狀腺疾病、高血壓、心臟病等其他可能影響腸道菌群穩(wěn)定性的疾??；(2)近3個(gè)月內(nèi)有腹瀉癥狀者；(3)近3個(gè)月內(nèi)使用過抗菌藥物或益生菌類藥物治療者；(4)妊娠、哺乳期或月經(jīng)期女性。選擇同期在該院進(jìn)行體檢的21例體檢健康者的糞便標(biāo)本作為健康對(duì)照組，其中男11例，女10例，年齡23～68歲，平均(43.52±4.27)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)由1名精神科醫(yī)師單獨(dú)進(jìn)行訪談并排除精神類疾??；(2)無精神病家族史；(3)未服用與精神病相關(guān)的任何藥物；(4)年齡、性別分別與患者匹配。健康對(duì)照組的排除標(biāo)準(zhǔn)同精神分裂癥組。

1.2方法 本研究采用16S rRNA高通量測(cè)序檢測(cè)精神分裂癥組和健康對(duì)照組的腸道菌群差異，并采用LC-MC非靶向代謝組學(xué)方法檢測(cè)精神分裂癥組和健康對(duì)照組其中17例糞便標(biāo)本的代謝產(chǎn)物，分析精神分裂癥患者腸道菌群結(jié)構(gòu)及其代謝產(chǎn)物變化。所取得的糞便標(biāo)本均在完成留樣后2 h內(nèi)采用無菌小離心管進(jìn)行分裝，并于-70 ℃低溫冰箱冷凍保存。

1.2.1Alpha多樣性分析 選擇Alpha多樣性指數(shù)對(duì)標(biāo)本中的菌群豐度和多樣性進(jìn)行分析，分別使用Shannon指數(shù)評(píng)估標(biāo)本的菌群多樣性和chao1指數(shù)評(píng)估菌群豐度(物種的種類數(shù)量)，將得到的2個(gè)指數(shù)利用Wilcox Test統(tǒng)計(jì)方法分析精神分裂癥組和健康對(duì)照組間的Alpha多樣性指數(shù)差異。

1.2.2Beta多樣性分析 本研究同時(shí)選擇Weighted Unifrac距離，Unweighted Unifrac距離及Bray Curtis距離這3個(gè)距離模型作為Beta多樣性距離的參考指標(biāo)，評(píng)估不同樣品及分組間的微生物群落結(jié)構(gòu)差異，采用無度量多維標(biāo)定法統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.3腸道菌群結(jié)構(gòu)差異 選取在屬分類相對(duì)水平豐度排名前20的物種，分析各標(biāo)本和各分組在屬水平上的相對(duì)分布情況。采用LEFSe方法分析組間可操作分類單元(OUT)差異，選擇LDA值>2作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，即具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的Biomakers特征微生物。

1.2.4非靶向代謝組學(xué)分析 將所有代謝物用KEGG數(shù)據(jù)庫br08001進(jìn)行注釋，得到代謝物所扮演的生物學(xué)角色，然后統(tǒng)計(jì)每個(gè)生物學(xué)角色的百分比，繪制百分比堆積柱形圖。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用16S rRNA測(cè)序得到全部原始序列進(jìn)行質(zhì)量控制、去噪、拼接、去嵌合體，形成OUT，即特征序列。采用LEFSe(基于物種相對(duì)豐度)和DESeq2(基于物種比例)進(jìn)行標(biāo)本的物種組間差異性分析；采用Wilcox Test統(tǒng)計(jì)方法對(duì)Alpha多樣性進(jìn)行組間差異性分析；采用PERMANOVA統(tǒng)計(jì)方法對(duì)Beta多樣性進(jìn)行組間差異性分析。測(cè)序分析流程基于qiime2及R語言數(shù)據(jù)包，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

LC-MC非靶向代謝組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)先標(biāo)準(zhǔn)化處理使得所有的代謝物水平的中位數(shù)和上下四分位點(diǎn)基本處于同一水平；采用log轉(zhuǎn)化使得代謝物水平分布接近正態(tài)分布；采用正交偏最小二乘別分析(OPLS-DA)模型和雙樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異分析。所有分析流程基于R語言數(shù)據(jù)包，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1精神分裂癥組與健康對(duì)照組糞便標(biāo)本腸道微生物多樣性分析

2.1.1Alpha多樣性分析 結(jié)果顯示，兩組間的Alpha多樣性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

2.1.2Beta多樣性分析 Beta多樣性分析結(jié)果顯示，標(biāo)本分布在組間和組內(nèi)間有差異。結(jié)合PERMANOVA統(tǒng)計(jì)方法再次進(jìn)行分析所得的Bray Curtis Distance、Weighted Unifrac和Unweighted Unifrac距離的P均<0.05，即兩組間的Beta多樣性有明顯差異，組間菌群結(jié)構(gòu)有明顯差異，見圖2～4。

注：A為Shannon指數(shù)分析結(jié)果圖；B為chao指數(shù)分析結(jié)果圖。圖1 Alpha多樣性分析結(jié)果圖

圖2 Bray Curtis距離分析圖

圖4 Unweighted Unifrac距離矩陣分析圖

2.2精神分裂癥組與健康對(duì)照組在屬水平上腸道菌群結(jié)構(gòu)差異 根據(jù)屬水平上物種的相對(duì)分布情況顯示各標(biāo)本和各分組間均有差異，見圖5。篩選到19個(gè)屬水平上的差異性大的物種，再結(jié)合DESeq2方法統(tǒng)計(jì)屬水平上物種的P<0.05的菌屬，其中上調(diào)菌屬有12個(gè)：安德克菌屬、消化鏈球菌屬、梭菌屬、腸球菌屬、錐形桿菌屬、普雷沃菌屬、梭桿菌屬、醋酸桿菌屬、疣微菌屬、瘤胃球菌屬、丁酸弧菌屬、優(yōu)桿菌；下調(diào)的菌屬有7個(gè)：糞桿菌屬、嗜血菌屬、毛螺菌屬、德克斯菌屬、假丁酸弧菌屬、SMB53、氨基酸球菌屬。

圖5 兩組在屬水平上的腸道菌群結(jié)構(gòu)差異

2.3LC-MC非靶向代謝組學(xué)分析結(jié)果

2.3.1兩組代謝物組成的差異分析 結(jié)果顯示，兩組間的代謝物的組成存在不同程度的差異。見圖6。

圖6 精神分裂癥組和健康對(duì)照組糞便標(biāo)本中代謝物組成的差異分析

2.3.2兩組糞便標(biāo)本的特征代謝物篩選 本研究在OPLS-DA的置換檢驗(yàn)中，使用Q2作為檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量，使用置換的方法求得Q2的隨機(jī)分布，并計(jì)算其P值以求證明其預(yù)測(cè)能力，P均<0.01，說明該預(yù)測(cè)模型能區(qū)分兩組之間代謝物的差異，見圖7。本研究利用OPLS-DA模型的判別分析尋找VIP(重要性)最大的代謝物，選擇 VIP>1并且經(jīng) FDR校正后的P<0.05的代謝物，本研究找到了7個(gè)代謝物分別為：異丙腎上腺素、R-3-羥基肉豆蔻酸、13-二甲基尿酸、137-三甲基尿酸、十一酸、鵝去氧膽酸、鄰氨基苯甲酸。最后結(jié)合OPL-DA模型篩選VIP最大的代謝物和單變量分析，發(fā)現(xiàn)異丙腎上腺素、R-3-羥基肉豆蔻酸、十一酸、鵝去氧膽酸、鄰氨基苯甲酸在精神分裂癥組中是上調(diào)的，而13-二甲基尿酸、137-三甲基尿酸在精神分裂癥組中是下調(diào)的。

注：A為陽離子模式的Q2分布圖；B為陰離子模式的Q2分布圖。圖7 兩組在OPLS-DA檢驗(yàn)中Q2分布圖

2.3.3多組學(xué)關(guān)聯(lián)的相關(guān)性分析 本研究對(duì)屬水平上的微生物及負(fù)離子的代謝物同時(shí)進(jìn)行雙樣本t檢驗(yàn)，得到相關(guān)的差異物種及差異代謝物(P<0.05)，根據(jù)本研究找到的特征菌屬和特征代謝物進(jìn)行關(guān)聯(lián)性熱圖分析發(fā)現(xiàn)，精神分裂癥患者中可能與脂肪酸代謝途徑正向調(diào)節(jié)相關(guān)的菌屬有梭菌屬、消化鏈球菌屬、梭桿菌屬、腸球菌屬，負(fù)向調(diào)節(jié)相關(guān)的菌屬有假丁酸弧菌屬、糞桿菌屬；與鵝去氧膽酸正向調(diào)節(jié)相關(guān)的菌屬有梭菌屬、消化鏈球菌屬、腸球菌屬、優(yōu)桿菌屬，負(fù)向調(diào)節(jié)相關(guān)的菌屬有糞桿菌屬、假丁酸弧菌屬、嗜血菌屬、毛螺旋菌屬；與免疫炎癥機(jī)制正向調(diào)節(jié)相關(guān)的菌屬有腸球菌屬、消化鏈球菌、梭桿菌屬、疣微菌屬、優(yōu)桿菌屬，負(fù)向調(diào)節(jié)相關(guān)的有毛螺旋菌屬、氨基酸球菌屬。

3 討 論

本研究收集21例精神分裂癥患者和21例體檢健康者的糞便進(jìn)行16S rRNA測(cè)序，并采用LC-MC非靶向代謝組學(xué)檢測(cè)精神分裂癥患者和體檢健康者中的17例糞便標(biāo)本的代謝產(chǎn)物。因考慮標(biāo)本對(duì)菌群結(jié)構(gòu)的影響因素較多，本研究對(duì)精神分裂癥組和健康對(duì)照組的年齡跟性別進(jìn)行一一配對(duì)。研究采用Alpha多樣性分析發(fā)現(xiàn)精神分裂癥組和健康對(duì)照組間微生物菌群數(shù)量沒有明顯的差異，可能因精神分裂癥組經(jīng)藥物治療后，導(dǎo)致菌群數(shù)量接近健康對(duì)照組菌群數(shù)量水平。但采用Beta多樣性分析，患者腸道微生物構(gòu)成有明顯差異，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的共有19個(gè)，而且還發(fā)現(xiàn)疣微菌和梭桿菌是從門水平到屬水平在精神分裂癥患者中顯著富集。

在屬水平上，與健康對(duì)照組比較，精神分裂癥組7個(gè)菌屬相對(duì)豐度降低，12個(gè)菌屬相對(duì)豐度升高，其中2個(gè)屬于典型的益生菌(毛螺菌屬和糞桿菌)屬水平較低。毛螺菌屬能參與人體短鏈脂肪酸的代謝，而短鏈脂肪酸是腸上皮細(xì)胞能量的主要來源[5]，因此毛螺菌屬水平降低可能會(huì)導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞通透性改變，進(jìn)而導(dǎo)致短鏈脂肪酸進(jìn)入血液循環(huán)并通過血腦屏障直接影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)，誘發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)炎癥并引發(fā)與精神分裂癥相關(guān)的行為特征。

本研究發(fā)現(xiàn)精神分裂癥組的普雷沃菌屬、疣微菌屬、瘤胃球菌屬明顯高于健康對(duì)照組，而嗜血桿菌和德克斯菌屬則減少，與相關(guān)研究一致[3,6-8]。SCHWARZ等[7]還報(bào)道瘤胃球菌屬水平增加與精神分裂癥的陰性癥狀和認(rèn)知缺陷的減少相關(guān)，乳酸菌的豐度在精神分裂癥患者首發(fā)時(shí)增加，并且與癥狀的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，但是本研究中乳酸桿菌在精神分裂癥組和健康對(duì)照組間的差異不明顯，可能是因?yàn)楸狙芯康木穹至寻Y組有藥物使用情況。本研究發(fā)現(xiàn)精神分裂癥組的腸道菌群組成確實(shí)發(fā)生了明顯的變化，這些變化的菌群可能與精神分裂癥的發(fā)生發(fā)展有一定的關(guān)聯(lián)，有望為精神分裂癥早期診斷及治療提供一定的依據(jù)。

精神分裂癥患者存在認(rèn)知功能障礙，其大腦的認(rèn)知功能進(jìn)化與能量代謝相關(guān)[9]。腸道微生物不僅參與人體內(nèi)腸道代謝，其產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物也能影響機(jī)體不同的代謝途徑，進(jìn)而影響疾病的發(fā)生和發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)137-三甲基尿酸、13-二甲基尿酸在精神分裂癥組中是下調(diào)的，其中甲基尿酸為嘌呤類生物堿。一些嘌呤類生物堿能促進(jìn)脂肪酸β氧化及增強(qiáng)氧化磷酸化，同時(shí)增強(qiáng)機(jī)體組織脂肪燃燒，達(dá)到降血脂的作用[10]。精神分裂癥組腸道微生物代謝物甲基尿酸的下調(diào)可能致使脂肪代謝減少，進(jìn)一步導(dǎo)致脂肪酸增加，這可能是精神分裂癥組引起代謝產(chǎn)物飽和脂肪酸十一酸上調(diào)的原因。據(jù)本研究找到的特征菌屬和特征代謝物進(jìn)行關(guān)聯(lián)性熱圖分析發(fā)現(xiàn)，精神分裂癥患者中可能與脂肪酸代謝途徑正向調(diào)節(jié)相關(guān)的菌屬有梭菌屬、消化鏈球菌屬、梭桿菌屬、腸球菌屬，負(fù)向調(diào)節(jié)相關(guān)的菌屬有假丁酸弧菌屬、糞桿菌屬。

本研究發(fā)現(xiàn)精神分裂癥組的腸道菌群代謝產(chǎn)物鵝去氧膽酸水平較健康對(duì)照組升高，鵝去氧膽酸由肝臟合成，分泌到腸道，經(jīng)細(xì)菌生物轉(zhuǎn)化形成次級(jí)膽汁酸包括脫氧膽酸和膽石酸。膽汁酸信號(hào)通路核受體法尼酯X受體(FXR)與TakedaG蛋白偶聯(lián)受體5已被鑒定為胰島素抵抗、肥胖、脂質(zhì)代謝和全身代謝過程的調(diào)節(jié)劑[11]，其中鵝去氧膽酸激活FXR的能力最強(qiáng)。有研究顯示，長(zhǎng)期使用氯氮平治療可引起患者脂代謝異常，導(dǎo)致不可逆的肥胖[12]。本研究中精神分裂癥患者均接受過氯氮平等精神分裂癥常用的藥物治療，且鵝去氧膽酸水平較體檢健康者升高，有可能激活FXR，引起脂質(zhì)代謝異常。在特征菌屬和特征代謝物的關(guān)聯(lián)性熱圖中發(fā)現(xiàn)，與鵝去氧膽酸正向調(diào)節(jié)相關(guān)的菌屬有梭菌屬、消化鏈球菌屬、腸球菌屬、優(yōu)桿菌屬，負(fù)向調(diào)節(jié)相關(guān)的菌屬有糞桿菌屬、假丁酸弧菌屬、嗜血菌屬、毛螺旋菌屬。

有研究表明，高飽和脂肪飲食增加革蘭陰性菌的比例，進(jìn)而增加內(nèi)毒素血癥[13]。同時(shí)，NGUYEN等[14]研究了不同膳食油處理對(duì)豬回腸組織體外內(nèi)毒素轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，發(fā)現(xiàn)魚肝油和魚油(不飽和脂肪)降低了腸道通透性，而椰子油(飽和脂肪)增加腸道通透性。脂筏可調(diào)節(jié)腸內(nèi)毒素轉(zhuǎn)運(yùn)，飽和脂肪可穩(wěn)定脂筏，使內(nèi)毒素轉(zhuǎn)運(yùn)更充分，揭示飽和脂肪可能通過增加腸道滲透性，改變腸道菌群組成，從而導(dǎo)致代謝性內(nèi)毒素血癥[14]。另外脂質(zhì)A可與巨噬細(xì)胞上的Toll樣受體4(TLR4)結(jié)合引起機(jī)體的免疫和炎癥反應(yīng)[15]。R構(gòu)型的3-羥基豆蔻酸是天然的脂質(zhì)A的組成成分，而脂質(zhì)A是內(nèi)毒素的主要組成結(jié)構(gòu)，本研究發(fā)現(xiàn)的特征菌屬大部分為革蘭陰性菌，這可能就是R-3-羥基肉豆蔻酸上調(diào)的原因；另外鄰氨基苯甲酸是一種具有毒性的物質(zhì)，對(duì)黏膜有刺激作用，這2個(gè)代謝物的上調(diào)可能通過增加腸道滲透性引發(fā)細(xì)菌移位和炎癥反應(yīng)。在特征菌屬和特征代謝物的關(guān)聯(lián)性熱圖中發(fā)現(xiàn)，與免疫炎癥機(jī)制正向調(diào)節(jié)相關(guān)的菌屬有腸球菌屬、消化鏈球菌、梭桿菌屬、疣微菌屬、優(yōu)桿菌屬，負(fù)向調(diào)節(jié)相關(guān)的有毛螺旋菌屬、氨基酸球菌屬。

精神分裂癥患者可通過酪氨酸代謝途徑分解酪氨酸合成兒茶酚胺類代謝物，進(jìn)而影響疾病的進(jìn)程[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)異丙腎上腺素的在精神分裂癥患者中是上調(diào)的，也符合這一論點(diǎn)。腎上腺素主要通過酪氨酸代謝產(chǎn)生，但是異丙腎上腺素不是天然存在的腎上腺素，異丙腎上腺素主要通過肝臟代謝并由腎臟進(jìn)行排泄，而且半衰期短，本研究在腸道檢測(cè)出有較高水平的異丙腎上腺素，這是否提示腸道菌群可以通過酪氨酸代謝合成異丙腎上腺素，這有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

本研究分析精神分裂癥患者和體檢健康者間的腸道微生物結(jié)構(gòu)及其腸道微生物代謝產(chǎn)物的差異，為精神分裂癥的臨床診斷和治療道路上提供一定證據(jù)。但也存在以下問題：患者樣本量少、受糞便標(biāo)本保存及運(yùn)送條件等影響較大。本研究中患者入組時(shí)已接受藥物治療，無法分析治療前的腸道微生物的結(jié)構(gòu)組成，不能明確精神分裂癥治療常用藥物對(duì)腸道菌群的影響。后續(xù)研究需擴(kuò)大患者樣本量，控制其他外在干擾因素進(jìn)行縱向深入研究，納入未經(jīng)治療的研究對(duì)象，研究用藥前后患者腸道菌群變化情況。