盧 山，董輝苒，任文華，蘇 玉，李春艷，萬極碩，吳 俊

北京積水潭醫(yī)院檢驗科，北京 100035

維生素D作為人體必需的營養(yǎng)素，對人體鈣和磷的正常代謝有直接影響。維生素D缺乏十分常見，因此維生素D水平的準確檢測對多種鈣代謝相關(guān)疾病的預(yù)防和治療有著重要的意義。維生素D在血液循環(huán)中的主要形式以25-羥基維生素D[25-(OH)D]呈現(xiàn)，其半衰期最長，濃度最高，且最穩(wěn)定，能反映人體的維生素D總量。25-(OH)D的主要形式為25-(OH)D2和25-(OH)D3，所以評價體內(nèi)維生素D營養(yǎng)狀況最為有效的指標是血清中25-(OH)D2和25-(OH)D3水平[1]。

近年來，維生素D的檢測越來越受到人們的重視。國家在2015年發(fā)布了血清中25-(OH)D3檢測的行業(yè)標準[2]。目前液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)有通用性強、特異度和靈敏度高的優(yōu)勢，可以同時檢測25-(OH)D2和25-(OH)D3，是國際上維生素D檢測的金標準[3-10]。然而在臨床檢測維生素D的過程中，LC-MS/MS存在的問題是前處理過程復(fù)雜。目前多數(shù)實驗室是通過手工操作完成加樣和取樣步驟，臨床操作人員需要較高的技能要求，因此容易出現(xiàn)人為失誤導(dǎo)致檢測結(jié)果不好。近年來，自動化磁珠法(MSPE)標本制備的出現(xiàn)有望將LC-MS/MS技術(shù)發(fā)展成為前處理和檢測一體的全自動檢測方法，受到臨床的極大重視，該法前處理過程簡單，可節(jié)省人力和時間成本。因此，本研究評估了使用MSPE進行標本前處理后25-(OH)D2和25-(OH)D3的檢測結(jié)果，并與液液萃取法(LLE)和傳統(tǒng)固相支撐液液萃取法(SLE)檢測結(jié)果進行比較，以期為臨床選擇不同的標本處理方法提供幫助。

1 材料與方法

1.1材料來源 血清標本為當天臨床檢測剩余血清，選取避免溶血、乳糜、黃疸的120份臨床血清標本分裝后于-20 ℃冰箱保存待用。

1.2儀器與試劑 LC-MS/MS系統(tǒng)(美國AB SCIEX)；自動化磁珠法質(zhì)譜標本前處理系統(tǒng)ZPTQ 32(北京梅斯質(zhì)譜生物)；低速離心機(北京京立)；微孔板振蕩器、氮吹儀(杭州奧盛儀器)；LLE的25-(OH)D測定試劑盒(江蘇豪思生物)。SLE所用提取板為Cleanert SLE 96Wellplate(天津博納艾杰爾)。MSPE的25-羥維生素D測定試劑盒(北京梅斯質(zhì)譜生物)。

1.3方法

1.3.1LLE法標本處理過程 按照常規(guī)的LLE操作流程進行操作，首先將100 μL標本添加至小型離心管中，再在其中加入100 μL含內(nèi)標的甲醇，然后添加600 μL乙酸乙酯，震蕩后離心取400 μL上清液，氮吹后用100 μL初始流動相復(fù)溶。質(zhì)控和標準品同步按操作處理。

1.3.2SLE法標本處理過程 SLE法按Cleanert SLE 96Wellplate使用要求進行操作，首先將100 μL標本加入預(yù)設(shè)的96孔處理板中的標本位置，再在其中加入同位素內(nèi)標，然后每孔加入100 μL純水稀釋靜置5 min，之后每孔采用1 200 μL正己烷淋洗，收集淋洗液氮氣吹干，用100 μL初始流動相復(fù)溶。質(zhì)控和標準品同步按操作處理。

1.3.3MSPE標本處理過程 按照試劑盒操作規(guī)程操作。首先將100 μL標本加入預(yù)設(shè)的96孔中的標本位置，再在其中加入同位素內(nèi)標，之后將96孔板轉(zhuǎn)移至梅斯ZPTQ 32儀器進行自動標本處理。質(zhì)控和標本同步按操作處理。

1.3.4LC-MS/MS 色譜柱采用Kinetex 2.6 μm C18100A 30×2.1 mm規(guī)格，含0.1%甲酸的水溶液為流動相A，以含0.1%甲酸的甲醇為流動相B，采用梯度洗脫：0～<0.3 min，40%流動相A；0.3～<1.5 min，0%～<40%流動相A；1.5～2.5 min，0% 流動相A；2.5～3.5 min，40%流動相A,流速0.5 mL/min。采用正離子大氣壓化學電離離子化的多反應(yīng)監(jiān)測模式，25-(OH)D2和25-(OH)D3定量離子通道質(zhì)荷比分別為395.2∶269.3和383.3∶365.3；定性離子通道質(zhì)荷比分別為395.2∶337.2和383.3∶257.2；內(nèi)標離子通道質(zhì)荷比分別為398.2∶272.3和389.3∶371.3。離子源溫度：500 ℃，離子源電壓5 500 V，氣簾氣30，霧化氣55，輔助氣20。

1.4性能驗證 性能驗證過程參考《液相色譜-質(zhì)譜臨床應(yīng)用建議》[11]和《液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜臨床檢測方法的開發(fā)與驗證》[12]指南。

1.4.1線性、定量限和檢測限評價 以標準溶液濃度為X軸，標準品和內(nèi)標峰面積的比值為Y軸，進行線性回歸分析，經(jīng)“1/X2”權(quán)重得回歸方程。將樣品待測物和內(nèi)標的峰面積比代入標準曲線方程，計算標本中25-(OH)D2和25-(OH)D3水平，r>0.99。以信噪比≥3時的濃度設(shè)為檢測限，以信噪比≥10時的濃度設(shè)為定量限，且連續(xù)10次測定的變異偏差<20%。

1.4.2精密度評價 混合血清標本，平均分為2份，其中1份作為低水平標本，另1份添加適量標準品混合物作為高水平標本，將2個水平標本混勻，分裝至凍存管，置于-80 ℃保存。每天各取出1支，制備8個平行管，測定3批次，計算該方法的精密度。

1.4.3絕對回收率評估 取來源于不同患者的血清標本，每份不少于1 mL，震蕩混勻備用。標本再分為空白對照和MSPE提取前加標準品[添加2個10 μL不同濃度標準品，25-(OH)D2為3/13 ng/mL，25-(OH)D3為5/30 ng/mL]和MSPE提取后加標準品[添加2個10 μL不同濃度標準品，25-(OH)D2為3/13 ng/mL；25-(OH)D3為6/30 ng/mL]，最終用水補齊復(fù)溶體積。比較磁珠提取前加標準品(去除空白本底)與MSPE提取后加標準品(去除空白本底)峰面積的差異。

1.4.4相對回收率和準確度評估 通過測定混合血清和混合血清添加25-(OH)D2和25-(OH)D3的2個水平混合標準品溶液各10 μL[加入標準品對應(yīng)理論水平25-(OH)D2為3/13 ng/mL，25-(OH)D3為6/30 ng/mL]，每種處理各制備3個平行管，計算加樣回收率及與預(yù)期濃度的偏差。

1.4.5基質(zhì)效應(yīng)評估 采用標本處理后加入法。取4份來源于不同個體的血清標本，每份標本分為3份，經(jīng)過MSPE提取，其中1份加入水，1份加入10 μL標準品25-(OH)D2(3 ng/mL)，25-(OH)D3(6 ng/mL)，另1份加入10 μL標準品 25-(OH)D2(13 ng/mL)，25-(OH)D3(30 ng/mL)，3份均加入10 μL混合內(nèi)標。標本中去除空白中的信號值后與溶劑中標準品峰面積(或峰面積內(nèi)標比)進行比較，分析方法的基質(zhì)效應(yīng)。

1.4.6方法比對 收集臨床檢測剩余血清標本120例，各待測物濃度在檢測范圍內(nèi)分布相對均勻，采用LLE、SLE和MSPE同時進行處理，然后采用相同LC-MS/MS方法進行檢測，比較3種提取方法檢測結(jié)果的一致性。

1.5統(tǒng)計學處理 采用MedCalc進行統(tǒng)計學分析和作圖，采用Bland&Altaman作圖比較3種方法的差異，以Passing &Bablok回歸分析3種方法之間的相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.1血清標本經(jīng)MSPE提取后的典型色譜峰圖 25-(OH)D2和25-(OH)D3的出峰時間分別為1.90 min、1.86 min，兩種待測物峰形對稱，各成分分離良好，互不干擾，且與SLE方法提取后的檢測結(jié)果比較，MSPE提取后未發(fā)現(xiàn)雜峰明顯增多。

2.2MSPE提取25-(OH)D2和25-(OH)D3性能評價結(jié)果

2.2.1線性、定量限和檢測限 25-(OH)D2和25-(OH)D3分別在1.0～36.0 ng/mL，2.5～90.0 ng/mL范圍內(nèi)相關(guān)性良好，r在各批次均>0.99。25-(OH)D2和25-(OH)D3檢測限分別為0.15 ng/mL、0.15 ng/mL；定量限分別為0.4 ng/mL、0.9 ng/mL，對應(yīng)變異系數(shù)分別為11.71%、7.96%。

2.2.2精密度 25-(OH)D2和25-(OH)D3批內(nèi)重復(fù)精密度分別在5.3%～6.5%、5.1%～6.8%；實驗室內(nèi)總不精密度分別在7.3%～10.6%、6.1%～8.0%，見表1。

表1 MSPE提取LC-MS/MS測定25-(OH)D的結(jié)果

2.2.3絕對回收率 25-(OH)D2絕對回收率在27.7%～31.3%，25-(OH)D3絕對回收率在21.7%～34.3%。

2.2.4相對回收率和準確度 25-(OH)D2和25-(OH)D3相對回收率分別在97.0%～104.0%、96.5%～106.3%，百分偏差均在±15%以內(nèi)，見表2。

表2 MSPE提取LC-MS/MS測定25-(OH)D的結(jié)果

2.2.5基質(zhì)效應(yīng) 25-(OH)D2和25-(OH)D3在大氣壓化學電離檢測下幾乎沒有基質(zhì)效應(yīng)的抑制，甚至還有些基質(zhì)增強的趨勢，另外經(jīng)過同位素內(nèi)標校正后，相對基質(zhì)效應(yīng)均在100%左右，亦可抵消潛在的基質(zhì)效應(yīng)，見表3。

表3 MSPE提取LC-MS/MS檢測25-(OH)D的基質(zhì)效應(yīng)(%)

2.2.6方法比對 LLE、SLE和MSPE這3種方法提取臨床120例血清標本中25-(OH)D2和25-(OH)D3的結(jié)果比較，其中SLE和MSPE相關(guān)性均良好(r>0.99)，2種方法比較25-(OH)D相對百分偏差在±15%以內(nèi)，LLE和MSPE相對來說結(jié)果偏差較大(r>0.98)，2種方法比較25-(OH)D相對百分偏差在±25%以內(nèi)。見圖1～4。

圖1 MSPE和SLE結(jié)果的相關(guān)性

圖2 MSPE和SLE的Bland&Altaman分析

圖3 MSPE和LLE結(jié)果的相關(guān)性

圖4 MSPE和LLE的Bland&Altaman分析

3 討 論

目前免疫法和色譜法是檢測血清中25-(OH)D常用的方法，免疫法中有放射免疫法、酶聯(lián)免疫吸附試驗、化學發(fā)光免疫測定法及電化學發(fā)光免疫測定法[13]，色譜法中包括高效液相色譜法和LC-MS/MS[9-12]。其中，免疫類方法的優(yōu)點是初始投入成本低、高自動化、重現(xiàn)性好，然而特異度和靈敏度不高，不能準確測定25-(OH)D2水平，測試標本后期成本較高，回收率較差等是其不可避免的缺點；高效液相色譜法優(yōu)點是分離效果好、速度快等，缺點是靈敏度不高、且不能很好的定性等；LC-MS/MS具有靈敏度高、特異度強、準確度高的特點，能同時監(jiān)測25-(OH)D2和25-(OH)D3，缺點是對檢測人員技術(shù)要求高，儀器成本高[14-15]。LC-MS/MS技術(shù)檢測25-(OH)D已受到臨床醫(yī)生及檢驗人員的共同認可，然而復(fù)雜的前處理過程限制了LC-MS/MS在臨床的廣泛應(yīng)用，MSPE技術(shù)的出現(xiàn)為LC-MS/MS技術(shù)的自動化進程帶來了革命性的突破。

目前，LC-MS/MS方法進行檢測前均需要進行標本前處理。目前常用的前處理方法主要有固相萃取、液液萃取(包括SLE)、蛋白沉淀及免疫捕獲等。對于水平較低的25-(OH)D及激素類物質(zhì)往往需要使用較為繁瑣的前處理方法，對實驗室儀器配置和操作人員要求較高，并且不利于實現(xiàn)完全自動化。

本研究中MSPE通過在磁珠表面進行化學基團修飾，待測物與磁珠表面鍵合相發(fā)生吸附解吸附，模擬固相萃取的過程，其不同于免疫試劑中抗體包被MSPE的原理。首先活化平衡磁珠，然后加入待測標本，經(jīng)過充分混合后，待測物與磁珠互相吸附，之后通過不同極性強度的洗脫溶液對磁珠淋洗洗脫，以達到分離和純化的目的。MSPE有別于傳統(tǒng)固相萃取，通過磁珠的轉(zhuǎn)移來實現(xiàn)目標待測物的分離，不僅過程簡單，自動化程度高，MSPE和LC-MS/MS聯(lián)合使用有望成為一種前處理和檢測分析一體的全自動檢測方法。

綜上所述，本研究驗證了MSPE提取25-(OH)D的性能，MSPE和SLE這兩種提取方法具有良好相關(guān)性，所得結(jié)果基本一致。MSPE有望在未來規(guī)?；瘧?yīng)用于LC-MS/MS的自動化前處理過程，減少手工操作的誤差，助力于臨床應(yīng)用。