胡 萍，李 會，楊溪霖，張海寧，卿克勤

四川省成都市第一人民醫(yī)院檢驗科，四川成都 610041

前列腺癌在西方發(fā)達國家是最常見的男性腫瘤，約占男性腫瘤的1/3，病死率位于男性腫瘤的第3位[1-2]。隨著我國經(jīng)濟的快速發(fā)展、人口老齡化的加劇，前列腺癌的發(fā)病率逐年上升，成為老年男性健康的重要威脅。由于前列腺癌早期癥狀隱匿，且不同地區(qū)前列腺特異抗原篩查存在差異，在我國前列腺癌初診患者人群中，高危患者占比較多[3-4]。目前，前列腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機制仍然不是十分明確。因此，尋找前列腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵因子，將為前列腺癌早期診斷、治療及預后等提供理論基礎(chǔ)和分子靶標。

肥胖相關(guān)蛋白(FTO)是一種位于染色體16q12.2上的N6-甲基腺苷去甲基酶[5]，除了與肥胖癥的發(fā)病相關(guān)，越來越多的研究證實，F(xiàn)TO基因在乳腺癌、胃癌、急性髓細胞性白血病(AML)等多種腫瘤中均過表達，并且參與了多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移，是未來靶向治療研究的重要熱點[6-7]。

為了探索FTO基因與前列腺癌的關(guān)系，本研究首先采用免疫組織化學染色法檢測前列腺癌癌組織和癌旁組織中FTO的表達；采用實時熒光定量PCR(qPCR)和蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測FTO在前列腺正常細胞和癌細胞中的表達；采用統(tǒng)計學方法分析FTO的表達與前列腺癌組織臨床病理特征的關(guān)系；采用Transwell實驗檢測FTO慢病毒干擾質(zhì)粒感染前列腺癌細胞22RV1后的侵襲能力變化情況?，F(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 前列腺癌癌細胞PC3、22RV1、Du145和Lncap，前列腺正常細胞RWPE均購自中國科學院細胞庫；組織芯片購自上海芯超生物公司，包括3例前列腺正常組織，52例前列腺癌癌旁組織，55例前列腺癌組織，前列腺癌組織相關(guān)病理參數(shù)見表1；脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司；FTO慢病毒干擾載體shRNA購自賽業(yè)生物公司。

表1 前列腺癌患者臨床病理特征和前列腺癌FTO的表達情況(n=55)

1.2方法

1.2.1免疫組織化學染色 采用免疫組織化學染色檢測組織芯片中FTO蛋白水平的表達。組織芯片經(jīng)脫蠟、水化后，采用枸櫞酸緩沖液高壓修復抗原，冷卻至常溫。再用3% H2O2處理，避光封閉15 min；PBS洗滌3次，每次5 min；滴加山羊血清，37 ℃封閉30 min后；4 ℃過夜孵育兔抗人FTO單克隆抗體(編號27226-1-AP,稀釋濃度為1∶100，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；PBS洗滌3次，每次5 min，滴加兔通用IgG二抗(上海長島生物科技有限公司)，37 ℃孵育30 min；PBS洗滌3次，每次5 min，滴加辣根過氧化酶標記的三抗，37 ℃ 孵育30 min；PBS洗滌3次，每次5 min后用DAB顯色；流水沖洗15 min，蘇木精復染1 min后，流水沖洗30 min，脫水封片，在光學顯微鏡下觀察并采集圖像。最后采用半定量方法評價FTO的表達情況，得分評價如下，F(xiàn)TO的染色強度評估：陰性(0分)、弱陽性(1分)、中陽性(2分)、強陽性(3分)；FTO的陽性染色的百分比：<5%(0分)、5%～<26%(1分)、26%～<51%(2分)、51%～75%(3分)、>75%(4分)。每個組織標本的FTO表達最終得分等于強度得分×百分比得分，總得分為0～12分，其中<9分為FTO低表達，≥9分為FTO高表達。

1.2.2qPCR檢測 采用Triol法提取細胞總RNA，按照引物反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行操作，取200 ng總RNA經(jīng)Bio-Rad反轉(zhuǎn)錄試劑反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA，產(chǎn)物在ABI 7500檢測系統(tǒng)進行PCR反應(yīng)，每個標本以GAPDH為內(nèi)參。FTO基因引物序列如下，上游：5′-CCCTGTGAGCAGCAACATAAG-3′,下游：5′-CAACCCGACCCAGTCTAAATC-3′；GAPDH基因引物序列如下，上游：5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGT-3′,下游：5′-GGGAAGGATCTGTCTCTGACC-3′；引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。利用相應(yīng)標本中GAPDH mRNA的比例計算組織中mRNA的表達水平，并將對照組中靶基因的表達水平設(shè)為1，對其他組中的靶基因的表達水平進行標準化計算。

1.2.3Western blot 采用細胞裂解法提取細胞總蛋白，即加入細胞RIPA裂解液，經(jīng)勻漿、裂解、離心后，獲得總蛋白，后通過Bradford方法檢測總蛋白濃度，進行聚丙烯胺凝膠電泳，經(jīng)恒流電轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯膜上，后將聚偏二氟乙烯膜放入含5%脫脂奶粉的TBST封閉液中封閉，加入一抗加兔抗人FTO單克隆抗體(編號27226-1-AP，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，稀釋濃度為1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，洗膜，加入兔通用二抗(上海長島生物科技有限公司)，37 ℃孵育1 h，洗膜后加入發(fā)光液顯影。最后，采用分析系統(tǒng)軟件測定蛋白條帶的積分光密度值，以GAPDH蛋白條帶作為內(nèi)參對照。

1.2.4FTO干擾慢病毒載體感染 常規(guī)培養(yǎng)22RV1細胞，待細胞融合度達60%～80%。將其分為實驗組、對照組和空白組3組，利用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體介導質(zhì)粒轉(zhuǎn)染FTO慢病毒干擾載體(pLVX-shRNA-FTO)至實驗組細胞中，轉(zhuǎn)染48 h后，使用2 μg嘌呤霉素穩(wěn)定篩選FTO沉默細胞，提取細胞總蛋白，在蛋白水平上驗證FTO干擾效果。

1.2.5侵襲實驗 采用Transwell實驗，按照細胞外基質(zhì)膠∶無血清培養(yǎng)基為1∶7.5的配比在冰上稀釋成使用液。把槍頭剪去一小段(約3 μm)后在冰上吸取每孔40 μL細胞外基質(zhì)膠使用液輕輕加入24孔板的8.0 μm的Transwell上室中，取實驗組、對照組、空白組的細胞，分別接種8 000個細胞和200 μL DMEM培養(yǎng)基到Transwell上室中，并將500 μL DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)置于下室中，每組設(shè)置3個復孔。在37 ℃和5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，然后取出培養(yǎng)室，用PBS洗滌兩次，用多聚甲醛固定10 min。將小室內(nèi)未發(fā)生侵襲的細胞用棉簽移除，將小室背面的細胞用0.1%的結(jié)晶紫染色并在顯微鏡下觀察結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1FTO在前列腺癌組織中高表達 與癌旁組織比較，F(xiàn)TO在前列腺癌組織中表達水平更高，差異有統(tǒng)計意義(P<0.05)，見圖1。

注：A為FTO在前列腺癌組織中的表達；B為FTO在前列腺癌旁組織中的表達;C為FTO在前列腺癌和癌旁組織的免疫組化評分圖。圖1 FTO在前列腺癌組織和癌旁組織中的表達比較

2.3高表達的FTO與前列腺癌的Grade分級的關(guān)系 據(jù)FTO組化評分，將FTO的表達分為高表達組30例和低表達組25例。結(jié)果表明，F(xiàn)TO的表達與前列腺癌的Grade分級有關(guān)，而與年齡、Gleason分級、淋巴結(jié)個數(shù)無關(guān)，見表2、3。

2.2FTO在前列腺癌細胞中高表達 Western blot結(jié)果表明，F(xiàn)TO在前列腺癌細胞PC3，Du145，22RV1，Lncap中的表達水平高于前列腺正常細胞RWPE，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；qPCR結(jié)果顯示，F(xiàn)TO在前列腺癌細胞PC3，Du145，22RV1，Lncap中的mRNA表達水平高于前列腺正常細胞RWPE，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

注：A為Western blot分析FTO在前列腺正常細胞和前列腺癌細胞中的蛋白表達圖；B為FTO蛋白表達水平的定量柱狀圖，和RWPE細胞比較，aP<0.05；C為qPCR分析FTO在前列腺正常細胞和前列腺癌細胞中的mRNA定量表達圖，和RWPE細胞比較，aP<0.05。圖2 FTO在前列腺正常細胞和前列腺癌細胞中的表達

表2 FTO的表達與前列腺癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.4FTO的下調(diào)抑制了22RV1細胞的侵襲能力 Western blot檢測結(jié)果顯示，與對照組和空載組比較，實驗組細胞中FTO的蛋白表達水平降低；通過Transwell實驗分析結(jié)果進一步表明，感染FTO慢病毒干擾載體(pLVX-shRNA-TFO)的前列腺癌細胞22RV1的侵襲能力降低。見圖3、4。

表3 Spearman分析FTO的表達與前列腺癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

注：A為Western blot分析FTO在對照組、空白組和實驗組細胞中的蛋白表達圖；B為FTO蛋白表達水平的定量柱狀圖，aP<0.05。圖3 pLVX-shRNA-TFO感染22RV1細胞后的FTO蛋白表達圖

注：A為Transwell分析對照組和實驗組細胞侵襲能力；B為侵襲細胞數(shù)的定量柱狀圖。圖4 Transwell實驗分析pLVX-shRNA-TFO感染后對22RV1細胞侵襲能力的影響(×400)

3 討 論

前列腺癌是威脅男性健康的常見惡性腫瘤，其全球發(fā)病率以每年5%的速度迅速增長[8]，據(jù)調(diào)查顯示，我國前列腺癌發(fā)病率比30年前增加近3倍[9]。FTO是與肥胖關(guān)系密切的易感基因[10]，而肥胖是前列腺癌等癌癥的危險因素，這提示FTO可能在介導肥胖和腫瘤發(fā)生之間發(fā)揮作用?，F(xiàn)有研究數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)TO與多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展和預后存在關(guān)聯(lián)。例如，F(xiàn)TO在AML中高表達，促進人AML細胞的存活和增殖，并抑制人AML細胞的分化和凋亡，從而促進白血病的發(fā)生[11-12]。在雌激素受體表達陽性的子宮內(nèi)膜癌中，F(xiàn)TO可以通過PI3K/Akt和MAPK信號通路誘導腫瘤細胞的生長和侵襲[13]。FTO在胃癌組織中高表達的同時能夠促進胃癌細胞的增殖和遷移[14]。此外，在不同癌癥中FTO表達的增加可能是由肥胖相關(guān)的FTO單核苷酸多態(tài)性引起的，從而促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[15-17]，如，F(xiàn)TO rs9939609與前列腺癌相關(guān)。然而，關(guān)于FTO表達與前列腺癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性，目前尚缺乏相關(guān)研究。

本研究通過免疫組織化學染色在55例前列腺癌組織與52例癌旁組織中檢測了FTO的表達；且通過Western blot和qPCR實驗在前列腺癌細胞PC3、22RV1、Du145、Lncap和前列腺正常細胞RWPE中檢測了FTO的表達。FTO在前列腺癌細胞中的mRNA和蛋白表達水平均升高，與臨床病理組織中表達升高的趨勢一致，這些結(jié)果共同提示FTO的高表達可能與前列腺癌的發(fā)生密切相關(guān)，F(xiàn)TO高表達可能有助于前列腺癌的發(fā)生。通過結(jié)合臨床病理資料分析發(fā)現(xiàn)FTO與前列腺癌的Grade分級具有相關(guān)性。在細胞水平干擾FTO的表達后，發(fā)現(xiàn)降低FTO的表達可抑制前列腺癌細胞的侵襲能力，提示FTO在前列腺癌中可能具有促進腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的能力，其具體的分子機制還需在后續(xù)研究中進一步探索。

因此，本研究可為前列腺癌的治療尋找合適的靶點提供實驗依據(jù)，F(xiàn)TO可能成為前列腺癌的重要分子靶點。