雷 鳴，王晴美，龔永祿，杜 維，鄧 毅，羅迪賢△

1.湖南省常德市第一人民醫(yī)院檢驗科，湖南常德 415003；2.南華大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所，湖南衡陽 421000

肺癌是全球發(fā)病率最高、生命危害最大的惡性腫瘤之一[1]。由于肺癌早期沒有明顯的臨床癥狀，在確診時癌細胞就已經(jīng)不受控制的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，大多數(shù)患者的中位生存期不足1年，5年生存率僅在17%左右[2]。因此，在分子層面對肺癌的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移機制進行更深入的研究，對肺癌的早期診斷和精準治療具有重要意義[3]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長度大于200 nt，但不具備編碼蛋白質(zhì)功能的RNA分子[4]，其以RNA形式在多種層面上參與調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平基因的表達，影響細胞的生長、發(fā)育、凋亡和分化[5]，并且與物種進化、胚胎發(fā)育及腫瘤的發(fā)生發(fā)展等有著密切的聯(lián)系[6]。目前已有多個lncRNA被證實與腫瘤的侵襲遷移及預(yù)后有關(guān)。lncRNA-KAT7是本課題組前期應(yīng)用lncRNA表達譜芯片分析技術(shù)在肺癌組織及癌旁組織中篩選到的具有明顯差異表達的lncRNA。lncRNA-KAT7位于人17號染色體的hg19區(qū)域正鏈上，GC水平為58%，轉(zhuǎn)錄子長度為575 bp，無編碼蛋白的開放閱讀框。有研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA-KAT7在結(jié)直腸癌癌組織內(nèi)低表達，其可能通過抑制NF-κB磷酸化及腫瘤細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程來抑制結(jié)直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲[7]。而目前關(guān)于lncRNA-KAT7在肺癌中的表達及相關(guān)功能的報道較少。本研究旨在分析lncRNA-KAT7基因在肺癌組織及癌旁組織標本中的表達情況，并了解其與肺癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系，同時通過Transwell實驗在體外條件下檢測lncRNA-KAT7過表達對肺癌細胞遷移和侵襲能力的影響，為臨床治療肺癌尋找新的靶點。

1 材料與方法

1.1組織標本 收集2018年1—6月于常德市第一人民醫(yī)院胸外科行肺癌切除術(shù)的38例患者的原發(fā)病灶癌組織標本及其癌旁組織標本(距離癌灶邊緣5 cm以上)，并保存于液氮中。本研究經(jīng)常德市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準，入選患者均知情同意。

1.2儀器與試劑 人肺癌細胞株(A549)購自上海細胞庫；通用細胞凍存液、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、RNA提取試劑盒、實時熒光定量PCR(q-PCR)、Lipofectamine?2000 Reagent試劑均購自美國Thermo Fisher Scientific公司；質(zhì)粒小抽提試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；康寧Transwell板、Matrigel基質(zhì)膠購自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司。

1.3方法

1.3.1q-PCR檢測 采用Trizol試劑盒提取肺癌組織及癌旁組織、肺癌A549細胞的總RNA，測定其純度和濃度。將得到的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，GAPDH作為內(nèi)參，采用q-PCR測定肺癌組織、癌旁組織及各組A549細胞中l(wèi)ncRNA-KAT7的表達水平。lncRNA-KAT7引物序列如下，上游引物：5′-AGCTCTTGGTTGAGCCCTTC-3′；下游引物：5′-GGGGCTGTGTGTGATTTTGTC-3′；GAPDH的引物序列如下，上游引物：5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′；下游引物：5′-TCCACCCTGTTGGTGTA-3′。q-PCR反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min；95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，共40個循環(huán)；使用2-ΔΔCt公式計算lncRNA-KAT7的相對表達水平。實驗重復(fù)3次。

1.3.2質(zhì)粒載體構(gòu)建和細胞轉(zhuǎn)染 空載體pcDNA-3.1為本實驗室自備，采用分子克隆方法構(gòu)建lncRNA-KAT7表達質(zhì)粒pcDNA-lncRNA-KAT7；選取生長狀態(tài)良好的A549細胞懸液，將其稀釋為每毫升DMEM培養(yǎng)基中含1×106個A549細胞后，接種于六孔板進行細胞培養(yǎng)，當(dāng)細胞融合度達到70%～80%時根據(jù)基因轉(zhuǎn)染操作手冊進行瞬時轉(zhuǎn)染。根據(jù)實驗設(shè)計將A549細胞分為pcDNA-3.1組和pcDNA-lncRNA-KAT7組，分別將空載體pcDNA-3.1和pcDNA-lncRNA-KAT7質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染至A549細胞，同時將綠色熒光蛋白GFP瞬時轉(zhuǎn)染至A549細胞，q-PCR檢測lncRNA-KAT7的轉(zhuǎn)染效果。

1.3.3細胞遷移和侵襲實驗 遷移實驗：將瞬時轉(zhuǎn)染24 h后的A549細胞重懸于無血清培養(yǎng)液中過夜饑餓培養(yǎng)，在Transwell上層小室中按每孔100 μL加入無血清A549細胞懸液(1×105個細胞)，同時將800 μL含10%FBS的培養(yǎng)基作為化學(xué)引誘劑加入Transwell下層小室中，將其放置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出小室，在上室中加入多聚甲醛固定遷移細胞，采用結(jié)晶紫染色試劑染色后用顯微鏡觀察和捕獲圖像，取8個視野，進行細胞計數(shù)并計算平均值。細胞侵襲實驗：需在Transwell小室上室包被Matrigel基質(zhì)膠再孵育2 h水化后備用，其余步驟同遷移實驗。

2 結(jié) 果

2.1肺癌組織及癌旁組織中l(wèi)ncRNA-KAT7基因的表達比較 肺癌組織中l(wèi)ncRNA-KAT7的表達水平明顯低于癌旁組織(P<0.05)；選取的38份肺癌組織及癌旁組織標本中，84.2%(32/38)的肺癌組織標本中l(wèi)ncRNA-KAT7的表達水平明顯低于癌旁組織。見圖1。

注：A為lncRNA-KAT7在肺癌組織及癌旁組織中的表達；B為lncRNA-KAT7在肺癌及癌旁組織表達的比值圖。圖1 lncRNA-KAT7在肺癌組織及癌旁組織中的表達比較

2.2lncRNA-KAT7的表達水平與臨床病理特征的關(guān)系 lncRNA-KAT7的表達水平與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.043)、肺癌組織學(xué)類型(P=0.001)及年齡(P=0.027)有關(guān)，但與患者的腫瘤分化程度、腫瘤最大徑、TNM分期、T分級及性別無關(guān)(P>0.05)。見表1。

表1 lncRNA-KAT7表達水平與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.3A549細胞瞬時轉(zhuǎn)染pcDNA-lncRNA-KAT7質(zhì)粒后的結(jié)果檢測 A549細胞瞬時轉(zhuǎn)染pcDNA-lncRNA-KAT7質(zhì)粒后，pcDNA-lncRNA-KAT7組lncRNA-KAT7表達水平明顯高于pcDNA-3.1組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；采用倒置熒光顯微鏡檢測A549細胞的轉(zhuǎn)染效率在40%～50%。見圖2。

注：A為瞬時轉(zhuǎn)染后A549細胞中l(wèi)ncRNA-KAT7的平均熒光強度(MFZ)；B為瞬時轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白GFP的前后對比效果圖。圖2 A549細胞瞬時轉(zhuǎn)染pcDNA-lncRNA-KAT7質(zhì)粒后的結(jié)果

2.4Transwell實驗檢測lncRNA-KAT7對肺癌A549細胞遷移和侵襲能力的影響 Transwell實驗結(jié)果顯示，與pcDNA-3.1組比較，pcDNA-lncRNA-KAT7組平均每個視野穿至小室外的遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)均明顯減少(P<0.05)。見圖3。

注：A為Transwell實驗結(jié)果圖；B為Transwell實驗結(jié)果統(tǒng)計圖;aP<0.05。圖3 Transwell實驗檢測lncRNA-KAT7對肺癌A549細胞遷移和侵襲能力的影響

3 討 論

lncRNA定位于細胞核和細胞質(zhì)，曾被認為是基因轉(zhuǎn)錄的“噪音”或“暗物質(zhì)”，并未受到重視[8]。但后來的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA可通過表觀遺傳學(xué)調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制調(diào)控基因表達，從而參與細胞的生理過程[9]。lncRNA的異常表達與腫瘤的形成、浸潤、轉(zhuǎn)移過程相關(guān)，其參與細胞分化、細胞內(nèi)物質(zhì)交換、核內(nèi)運輸、細胞周期、染色質(zhì)修飾、干細胞重組、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾等多種重要的調(diào)控過程[10]。抑制腫瘤進展的關(guān)鍵在于抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲，而lncRNA既可對腫瘤細胞的周期、凋亡、轉(zhuǎn)移等產(chǎn)生影響[11]，又可在表觀遺傳的層面上宏觀調(diào)控腫瘤細胞的很多特征，從而在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[12]。

隨著精準醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展，腫瘤基因診斷和分子靶向治療成為腫瘤診斷和治療的重要發(fā)展方向[13]。在對lncRNA深入研究的過程中，人們發(fā)現(xiàn)了一些新的在肺癌中發(fā)揮促癌或抑癌作用的lncRNA[14]，這些肺癌相關(guān)基因的異常表達對肺癌細胞的侵襲、遷移及增殖能力起到了重要的調(diào)控作用[15]，并與患者預(yù)后及對化療藥物的耐藥有密切關(guān)系[16]。研究發(fā)現(xiàn)lncRNA-ATB在肺癌組織和肺癌細胞中高表達，利用siRNA外源性沉默lncRNA-ATB，能夠抑制肺癌細胞的增殖和遷移能力，以及促進肺癌細胞凋亡[17]。YANG等[18]的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA-BANCR在非小細胞肺癌(NSCLC)組織和細胞中表達缺失，其作為分子表達途徑的重要調(diào)控因子對肺癌細胞活性、遷移、侵襲和凋亡發(fā)揮抑制作用，體內(nèi)實驗表明，為NSCLC模型小鼠注射lncRNA-BANCR表達細胞，對NSCLC腫瘤生長有一定的抑制作用。

lncRNA-KAT7是新近發(fā)現(xiàn)的一種結(jié)直腸癌抑制因子，但其在其他惡性腫瘤中的作用尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，lncRNA-KAT7在肺癌組織中的表達水平明顯低于癌旁組織(P<0.05)，提示lncRNA-KAT7可能是與肺癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的癌基因。為了進一步探討lncRNA-KAT7表達與肺癌的關(guān)系，本研究對lncRNA-KAT7表達與肺癌患者臨床病理特征進行了分析，結(jié)果顯示lncRNA-KAT7的表達水平與患者的年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但與患者的腫瘤分化程度、腫瘤最大徑、TNM分期、T分級及性別無關(guān)(P>0.05)，提示肺癌組織中l(wèi)ncRNA-KAT7參與肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果同時顯示，lncRNA-KAT7表達水平與肺癌組織學(xué)類型有一定關(guān)系，其在肺鱗癌組織中的表達水平明顯低于肺腺癌組織，提示lncRNA-KAT7在肺鱗癌中發(fā)揮的抑癌作用可能更強一些。由此筆者認為，lncRNA-KAT7有望成為肺癌診斷和預(yù)后判斷的潛在腫瘤分子標志物。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移被認為是肺癌死亡的重要原因之一。研究表明lncRNA可通過與miRNA競爭性結(jié)合、細胞內(nèi)的剪切作用形成miRNA的前體，通過發(fā)揮內(nèi)源性miRNA海綿作用的方式抑制miRNA的表達，從而促進或抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展[16,19]。GAO等[19]在研究中發(fā)現(xiàn)，過表達lncRNA-KAT7可以通過正向調(diào)節(jié)miR-10a基因的甲基化，負向調(diào)節(jié)miR-10a的表達來抑制肺癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。有研究表明，lncRNA-KAT7在結(jié)直腸癌癌組織和細胞內(nèi)低表達，與pcDNA-3.1組比較，過表達lncRNA-KAT7的HCT116細胞中E-鈣黏蛋白(與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)移相關(guān))的表達水平明顯增加，β-連環(huán)蛋白(與增殖相關(guān))和MMP-2蛋白(與侵襲相關(guān))的表達水平相對降低，從而推測lncRNA-KAT7可能通過調(diào)控EMT途徑抑制腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[20]。本研究采用Transwell實驗進一步驗證lncRNA-KAT7與肺癌細胞侵襲遷移的關(guān)系，實驗結(jié)果表明，過表達lncRNA-KAT7可以抑制肺癌A549細胞的遷移和侵襲。然而本研究對lncRNA-KAT7與肺癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系的研究僅處于功能解析的初始階段，更深層面對lncRNA-KAT7參與的信號通路及其對肺癌具體作用機制的探索，有待后續(xù)進一步開展。

綜上所述，lncRNA-KAT7在肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中具有調(diào)控腫瘤細胞遷移和侵襲能力的作用，并有望成為肺癌分子靶向治療中的潛在靶點。