鄭倩倩，陳璐瑤，何歡，侯夢雪，牛芯蕊，王曉玲，汪濤

（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617）

據(jù)統(tǒng)計，2020年全球新發(fā)癌癥病例1 929 萬例，其中中國新發(fā)癌癥457 萬人，占全球23.7%，腫瘤的發(fā)病率、病死率仍居首位［1］，防控形勢極其嚴峻。隨著對腫瘤發(fā)病機制認識的深入，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對腫瘤的治療從單純殺傷癌細胞逐漸轉(zhuǎn)向腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME），以TME 為靶標的治療策略與中醫(yī)藥診療腫瘤的整體觀相契合。腫瘤免疫微環(huán)境（tumor immune microenviroment，TIME）是TME 的重要組成部分，臨床實踐證明，中醫(yī)藥在重塑TIME，改善機體的內(nèi)環(huán)境，尤其是使患者可帶瘤生存并防治腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)方面有獨特的優(yōu)勢［2］。在對腫瘤病機精準定位的基礎(chǔ)上，諸多學(xué)者提出了扶正培本、清熱解毒、活血祛瘀、軟堅散結(jié)等治則并積累了許多療效確切的經(jīng)方、驗方，但因理、法、方、藥流派眾多，復(fù)方藥味復(fù)雜，不易進行大規(guī)模的臨床研究和機制探討，對中醫(yī)藥抗癌的有效性和安全性國際認可度偏低?；谥兴幊煞值亩鄻有?、功能的多靶性，亟待利用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫和分子對接技術(shù)進行高通量組學(xué)數(shù)據(jù)分析，從系統(tǒng)生物學(xué)和生物網(wǎng)絡(luò)的角度，闡釋藥物與機體的相互作用，探討抗癌藥對癌細胞生命活動調(diào)控相關(guān)通路的干預(yù)機制［3－4］。故本研究擬運用高通量組學(xué)數(shù)據(jù)分析法，探討芪歸藥對干預(yù)TIME的機制，并與陽性對照藥即廣譜免疫調(diào)節(jié)劑左旋咪唑［5］做對比，以期為以芪歸藥對為核心配伍的中藥復(fù)方藥理機制研究及臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 篩選芪歸藥對活性成分并預(yù)測主要靶點

應(yīng)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）在線檢索黃芪、當歸的所有化學(xué)成分，設(shè)置口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（drug－likeness，DL）≥0.18為篩選條件，同時結(jié)合相關(guān)文獻，篩選出藥對的活性成分并預(yù)測每個活性成分的潛在靶點。

1.2 篩選TIME和芪歸藥對交集靶點

在GeneCards 數(shù)據(jù)庫中以關(guān)鍵詞“TIME”檢索，篩選得到TIME 相關(guān)基因。利用Ri386 4.0.1 篩選TIME相關(guān)基因與藥物的映射靶點。

1.3 構(gòu)建芪歸藥對－活性成分－靶點－TIME 網(wǎng)絡(luò)圖及交集靶點的蛋白互作網(wǎng)（Protein－Protein Interaction，PPI）

將獲取的藥物活性成分、交集靶點等數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.7.1 軟件，構(gòu)建藥物－活性成分－靶點－疾病網(wǎng)絡(luò)，各節(jié)點分別代表藥物、活性成分、靶點及疾病，線表示各節(jié)點之間的相互關(guān)系，利用網(wǎng)絡(luò)分析功能得到各節(jié)點的度值篩選出核心節(jié)點。將交集靶點導(dǎo)入，設(shè)置物種為Homo sapiens，置信度0.4，得到蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，并將得到的TSV 文件利用R Studio 4.0.1按度值排列分析。

1.4 芪歸藥對調(diào)節(jié)TIME 的GO 功能、KEGG 通路富集分析

將潛在的交集靶點輸入David 數(shù)據(jù)庫中進行GO功能富集分析，選擇生物過程、分子功能和細胞組分3個模塊和KEGG通路富集的分析。GO功能富集分析指在特定功能層次上統(tǒng)計蛋白/基因的數(shù)目或組成。KEGG 通路富集分析可用于推斷蛋白質(zhì)之間新的關(guān)聯(lián)關(guān)系，設(shè)定人類基因為篩選范圍，P＜0.05 為篩選值，獲得相應(yīng)的數(shù)據(jù)，并用微生信網(wǎng)絡(luò)平臺在線工具將得到的芪歸藥對調(diào)節(jié)TIME 所涉及的相關(guān)通路和生物功能數(shù)據(jù)進行可視化。

1.5 核心成分－靶點分子對接驗證

選取PPI互作圖中度值前5名的靶點，在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（protein databank，PDB）下載靶點對應(yīng)的靶蛋白的3D 結(jié)構(gòu)并進行加氫、去水、去除小分子處理，在PubChem 中搜索芪歸藥對－活性成分－靶點－TIME網(wǎng)絡(luò)中連接度排名前3 的小分子，即槲皮素（quercetin）、β－谷甾醇（beta－sitosterol）及山柰酚（kaempferol）及陽性對照藥左旋咪唑的2D 結(jié)構(gòu)，并使用Chem 3D 軟件進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，利用AutoDock Vina 軟件進行分子對接，對接結(jié)果采用PyMol 2.3軟件進行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 篩選芪歸藥對的活性成分及與TIME交集的靶點

通過TCMSP 軟件以藥物標準OB ≥30%和DL ≥0.18 為條件篩選出芪歸藥對18 個有效活性成分，100 個靶標，有效成分的OB 和DL 值見表1。在GeneCards數(shù)據(jù)庫中與TIME相關(guān)的靶標有3 425個，將活性成分的靶標與TIME相關(guān)基因進行映射，得到芪歸藥對與TIME 交集靶點79 個，提示黃芪和當歸干預(yù)TIME既有獨立的作用靶點，又有共同的協(xié)作靶點。

表1 芪歸藥對活性成分的基本信息

2.2 構(gòu)建芪歸藥對－活性成分－靶點－TIME網(wǎng)絡(luò)及PPI圖

藥物－靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)見圖1、2，藥對中連接度為前3 位的潛在活性分子槲皮素（quercetin）、β－谷甾醇（beta－sitosterol）及山柰酚（kaempferol）可能通過靶向TIEM 中IL－6、CAPS3、VEGFA、MAPK8、EGFR 等基因發(fā)揮作用。

圖1 芪歸藥對活性成分與TIME相互作用圖

2.3 芪歸藥對調(diào)節(jié)TIME 的KEGG 通路、GO 功能富集分析

將79 個藥物靶點輸入DAVID 數(shù)據(jù)庫中，以P＜0.05 為篩選條件，KEGG 通路富集78 條，選富集基因數(shù)較高的前20條繪制圖表，見圖3A，GO功能富集得到304 條，涉及216 個生物過程、21 個細胞組分、67 個分子功能，每類取富集程度排序最高的前10 繪制圖表，見圖3B。KEGG通路、GO功能富集分析顯示：在缺氧、慢性炎癥的微環(huán)境中，microRNA、PI3K/Akt、TNF、MAPK、HIF－1等通路參與調(diào)控細胞凋亡、藥物反應(yīng)及基因表達等生物過程。

圖3 芪歸藥對調(diào)節(jié)TIME的KEGG通路富集分析、GO分析

2.4 分子對接結(jié)果

芪歸藥對活性成分與左旋咪唑分別與圖2B 中選出的度值排名前5 位的關(guān)鍵靶蛋白做分子對接，分別見表2、圖4與表3、圖5。藥物活性成分與靶蛋白結(jié)合能越低，結(jié)合可能性越大，結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定，更易發(fā)揮相應(yīng)的效應(yīng)。結(jié)果提示：藥物活性成分槲皮素可與IL－6（THR－164、GLN－157、SER－108），VEGFA（GLN－20、CYS－10）和EGFR（ARG－71、ARG－80）等分子的氨基酸殘基形成氫鍵，β－谷甾醇可與CASPA3（ASN208）的氨基酸殘基形成氫鍵，山柰酚可與MAPK8（ASP－339、TYR－202、CYS－213、GLY－216、ARG－72）的氨基酸殘基形成氫鍵，與對應(yīng)的靶蛋白進行良好的結(jié)合。左旋咪唑可與VEGFA（SER－11）、MAPK8（GLU－217）、IL－6（GLN－81）的氨基酸殘基結(jié)合形成氫鍵并與三者結(jié)合，未能與EFGR 與CASP3 形成氫鍵，表明左旋咪唑不能與二者結(jié)合。

圖2 交集靶點的PPI圖和靶蛋白的條形圖

圖4 活性成分與核心靶點的分子對接圖

圖5 左旋咪唑與核心靶點的分子對接圖

表2 活性成分與核心靶點的結(jié)合能

表3 左旋咪唑與核心靶點的結(jié)合能

3 討論

腫瘤類似于“器官樣組織”，由癌細胞、非癌細胞、脈管體系及含多種炎癥免疫因子、代謝物的基質(zhì)組成。非癌細胞、腫瘤基質(zhì)構(gòu)成了癌細胞賴以生存的TME［6］。TIME 是TME 的重要組成部分，在與癌細胞相互作用的動態(tài)過程中，免疫細胞在清除和免疫編輯重塑癌細胞的同時，癌細胞及其釋放的瘤源性免疫抑制因子也對免疫細胞進行“反塑型”。癌細胞通過分泌轉(zhuǎn)化生長因子－β（transforming growth factor－β，TGF－β）、白細胞介素－10（interleukin－10，IL－10）等多種免疫抑制因子及產(chǎn)生外泌體以傳遞miRNA，刺激T 細胞、B 細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞向免疫抑制表型的調(diào)節(jié)性T細 胞（regulatory T cell，Treg）、腫瘤相關(guān)巨噬細胞（tumor－associated macrophage，TAMs）、調(diào)節(jié)性樹突狀細胞轉(zhuǎn)化，并使髓系免疫抑制細胞（myeloid derived suppressor cells，MDSCs）增殖。這些免疫細胞彼此相互作用，表達更多的免疫抑制因子及促瘤生長因子（IL－4、6、10，TGF－β 等），通過抑制細胞毒性T 細胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）、NK 細胞的活化，促進CTL、NK 細胞的凋亡，消耗或拮抗IL－2、腫瘤壞死因子－α（tumor necrosis factor－α，TNF－α）等促炎因子，產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等方式促進腫瘤侵襲、血管生成及轉(zhuǎn)移，形成腫瘤演進和TIME 免疫抑制相互促進的惡性循環(huán)［7－8］。

乏氧在某種程度上可視為TIME慢性炎癥、免疫抑制的始動因素。癌細胞的快速增殖、血管畸形造成TIME處于乏氧狀態(tài)，各種癌細胞大多過表達缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia－inducible factor，HIF）。HIF－1α 參與70 多個靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，如誘導(dǎo)TGF－β 產(chǎn)生經(jīng)MAPK、PI3K/Akt 途徑促使癌細胞增殖，上調(diào)MMPs 的表達促進腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移，上調(diào)VEGF 及其受體的表達促進血管生成，誘導(dǎo)耐藥相關(guān)蛋白的表達增加放化療抗性［9］。此外，HIF還通過多種途徑影響免疫細胞的抗癌反應(yīng)：抑制CD4+T 細胞、CLT、NK 細胞增殖及遷移活性，抑制免疫刺激性細胞因子的產(chǎn)生和釋放；募集Treg，MDSCs、M2 型TAMs 等免疫抑制細胞浸潤，促進它們分泌免疫抑制細胞因子及誘導(dǎo)免疫檢查點分子的表達；改變瘤源性外泌體中miRNA 的成分下調(diào)免疫細胞功能［10－11］，逐步促使TIME 形成慢性炎癥、免疫抑制的惡性循環(huán)。

中醫(yī)學(xué)認為，腫瘤是因機體正氣不足，全身氣血陰陽失調(diào)、臟腑功能紊亂、津液輸布障礙，痰、瘀、毒等病理產(chǎn)物積聚形成，“正虛”是腫瘤發(fā)病的根本原因，“痰、瘀、毒”是腫瘤進展和轉(zhuǎn)移的必要因素。在腫瘤發(fā)展的不同階段，“虛、痰、瘀、毒”常合并出現(xiàn)，TME 存在著免疫抑制（正虛）、血管生成（血瘀）、酸性、高壓、低氧（痰濁）等特點，易誘導(dǎo)癌細胞轉(zhuǎn)移（癌毒）［12］。據(jù)此病機分析，“扶正祛邪、固本培元”是中醫(yī)抗癌的基本治則。通過對腫瘤患者的187 張中藥處方調(diào)查分析，發(fā)現(xiàn)處方中有298 味，排名前5 位的依次是生黃芪、茯苓、砂仁、當歸和炒白術(shù)［13］，其中“扶正益氣”中藥黃芪、當歸是常用藥對之一。臨床上曾對120 例腫瘤患者分別給予加味當歸補血湯及調(diào)節(jié)免疫治療，通過觀察療效、比較免疫學(xué)各項指標變化，發(fā)現(xiàn)在芪歸藥對為基礎(chǔ)上進行加減能明顯改善患者的免疫功能，使各項免疫指標水平較對照組均明顯上升［14］?！罢摗迸c腫瘤互為因果，形成惡性循環(huán)，以芪歸藥對為基礎(chǔ)配伍的扶正固本方還能促進TIME免疫與血管的正常化，如黃芪補氣湯提取物具有提高小鼠細胞免疫、單核巨噬細胞吞噬能力、NK細胞活性及抗腫瘤的功效［15］；當歸補血湯通過調(diào)節(jié)VEGF 與VEGFR 和sVEGFR 兩種受體的結(jié)合抑制與腫瘤共培養(yǎng)血管內(nèi)細胞的增殖［16］。

由此，本研究運用關(guān)聯(lián)規(guī)則、聚類算法和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對芪歸藥對調(diào)節(jié)TIME 的作用機制展開深入分析。KEGG 通路、GO 功能富集分析結(jié)果提示，在缺氧、慢性炎 癥的TIME 中，microRNA、PI3K/Akt、TNF、MAPK、HIF－1 等通路參與調(diào)控細胞凋亡、藥物反應(yīng)及基因表達等多種生物過程，而這些通路涉及的生物過程可能是芪歸藥對所含槲皮素、山柰酚、β－谷甾醇等關(guān)鍵活性成分通過干預(yù)腫瘤組織IL－6、VEGF、EGFR、CAPS3、MAPK8 的表達發(fā)揮抗癌效應(yīng)的潛在靶點。研究已證實：芪歸藥對的活性成分槲皮素、山柰酚同屬黃酮類化合物，均具有抗炎、抗增殖促凋亡、抗腫瘤等藥理作用，并通過各種途徑切斷TIME 中炎癥－免疫抑制－血管生成之間的正向調(diào)控的環(huán)路，緩解TIME炎癥免疫抑制惡化程度。槲皮素通過上調(diào)TAMs 上的TRAIL－R 表達誘導(dǎo)其凋亡［17］，抑制PI3K/Akt 通路來抑制TIME 慢性炎癥和血管生成，提高荷瘤小鼠存活率［18］，經(jīng)線粒體凋亡途徑上調(diào)Caspse－3、9的表達和阻斷細胞生存相關(guān)PI3K/Akt、MAPK/ERK 通路促進人肝癌細胞HepG2 的凋亡［19］。山柰酚能通過下調(diào)HIF－1表達，抑制PI3K/Akt 通路或MAPK/ERK 通路的活化降低腫瘤組織VEGF 的表達水平［20］，抑制PI3K/Akt、MAPK 通路下調(diào)肝癌細胞表達CDKl、Cyclin B 蛋白，造成G2/M 期阻滯，觸發(fā)癌細胞自噬性死亡［21－22］，也可經(jīng)線粒體凋亡途徑活化Caspase－3、9，上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白Bax/Bcl－2 表達比，并通過抑制細胞周期蛋白CDK4、CDK6、Cyclin D1的表達有效阻止荷瘤鼠膽囊癌的進展［23］。β－谷甾醇屬甾醇化合物，具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抑制炎癥及抗腫瘤等多種生物活性，通過干預(yù)Caspase 途徑誘導(dǎo)直腸癌細胞凋亡，通過上調(diào)miR－10a 的表達和抑制PI3K/Akt 通路抑制腫瘤生長，顯著減低腫瘤組織MMP－2、9 及VEGF 的表達，抑制癌細胞轉(zhuǎn)移和侵襲［24］。左旋咪唑（levomisole）是一種廣譜的免疫調(diào)節(jié)藥物，可以通過增加NK 細胞活性、促進脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化等提高機體的免疫功能［25］，將其作為陽性對照藥可體現(xiàn)出芪歸藥對調(diào)節(jié)TIME的優(yōu)勢。

綜上，結(jié)合分子對接結(jié)果，芪歸藥對的主要活性成分槲皮素、山柰酚、β－谷甾醇可能是通過與TIME密切相關(guān)靶蛋白（IL－6、VEGFA、CASP3、MAPK8、EGFR）的結(jié)合發(fā)揮作用，與左旋咪唑相比結(jié)合能更低，表明這些小分子化合物與左旋咪唑相比具有更好的結(jié)合活性，本研究只是利用國內(nèi)外已有的數(shù)據(jù)庫進行的分析，是理論的推導(dǎo)。芪歸藥對調(diào)節(jié)TIME的具體的作用機制還需設(shè)計更加完善的實驗進一步研究。