張?jiān)椒玻J，張海霞，王敏，施建豐，陳斌?

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇 南京 210028；2.江蘇省中醫(yī)藥研究院國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥釋藥系統(tǒng)重點(diǎn)研究室，江蘇 南京 210028；3.南京中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210028；4.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇 南京 210008）

外傷血瘀證是由創(chuàng)傷、跌打損傷及金刃損傷等多種原因［1］所致的脈管破損，血液溢于脈外的病證［2］，屬于血瘀證的一種［3］。機(jī)體存在外傷血瘀癥狀時(shí)，會(huì)導(dǎo)致血液流變學(xué)異常、傷處淤斑或病理性改變、微循環(huán)障礙等［4］，從而使機(jī)體處于慢性疼痛的不適狀態(tài)［5］。

三七［Panax notoginseng（Buekill）F.H.Chen ex C.H.Chow］和丹參（Salviae miltiorrhizae）為臨床常用活血中藥，兩藥許多藥理活性均相同，常以配伍藥對(duì)［6］形式出現(xiàn)在血瘀、血栓、冠心病等疾病的治療中，使活血消瘀之效倍增［7］。

目前外傷血瘀證的相關(guān)研究主要集中在血管內(nèi)皮細(xì)胞功能、血小板功能、炎癥反應(yīng)、微循環(huán)障礙和血液流變學(xué)變化等方面［8－11］，而關(guān)于外傷血瘀證對(duì)機(jī)體內(nèi)源性物質(zhì)代謝的影響研究較少。因此，本研究復(fù)制了大鼠外傷血瘀證模型，并基于UPLC－Q－TOF－MS/MS技術(shù)研究經(jīng)典活血中藥三七、丹參及兩者不同比例配伍藥對(duì)對(duì)外傷血瘀證大鼠血液流變學(xué)、病理組織形態(tài)及血漿、尿液內(nèi)源性代謝物質(zhì)的影響，分析并比較了三七、丹參單味入藥或以不同比例配伍藥對(duì)入藥對(duì)外傷血瘀證模型大鼠血漿和尿液中血瘀差異代謝物的回調(diào)作用，以期從代謝組學(xué)角度探究三七、丹參及其不同比例配伍藥對(duì)的活血化瘀作用機(jī)制，豐富三七－丹參活血作用的研究。

1 材料

1.1 藥品與試劑

三七（亳州萬珍中藥飲片廠，批號(hào)：2008065）、丹參（貴州同德藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20191101－01）經(jīng)江蘇省中醫(yī)藥研究院黃一平研究員鑒定，均符合2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定?；钛雇茨z囊（珠海安生鳳凰制藥有限公司）；羧甲基纖維素鈉（上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)：107001134）；肝素鈉注射液（常州千紅生化制藥有限公司）；甲醇和乙腈（色譜純，德國(guó)Merk公司）；甲酸（色譜純，ACS公司）。

1.2 儀器

超高效液相色譜－四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（AB SCIEX Triple TOF 5600+，美國(guó)AB 公司）；冰箱（BCD－530WDEAU1，海爾智家股份有限公司）；手提高速粉碎機(jī)（DFT－100A，溫嶺市林大機(jī)械有限公司）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（5430R，Eppendorf 公司）；渦旋儀（IKA?VORTEX，德國(guó)IKA 公司）；海爾低溫保存箱（DW－86L578S，青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司）；數(shù)控超聲波清洗器（KQ2200DV，昆山市超聲儀器有限公司）；千分之一電子天平（LE403E型，梅特勒－托利多儀器上海有限公司）；氮吹儀（N－EVAP－112，美國(guó)Organomation公司）；倒置顯微鏡（Ⅸ73，Olympus 公司）；自動(dòng)血流變分析儀（SA－9000，北京賽科希德公司）。

1.3 動(dòng)物

48 只SD 大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量（250 ± 20）g，購(gòu)自南通大學(xué)，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（蘇）2019－0001，飼養(yǎng)于江蘇省中醫(yī)藥研究院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心（溫度23～24 ℃，濕度40%～45%）。所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)動(dòng)物所有操作均符合江蘇省中醫(yī)藥研究院動(dòng)物倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 灌胃藥物制備

三七、丹參分別打粉過80 目篩得三七藥粉和丹參藥粉，將三七藥粉和丹參藥粉分別按3∶1、1∶1、1∶3 的比例混勻，得不同比例三七－丹參藥對(duì)粉末，活血止痛膠囊除去膠囊外殼得陽性藥粉末，用0.1% CMC－Na溶液分別將三七、丹參和不同配比的三七－丹參藥對(duì)配制為生藥濃度0.243 g/mL 的混懸藥液（以生藥含量計(jì)），陽性藥粉末配制為0.081 g/mL的混懸藥液。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組、造模與給藥

將48 只SD 大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、活血止痛膠囊組（陽性藥組）、三七組、丹參組以及三七－丹參3∶1 組、三七－丹參1∶1 組和三七－丹參1∶3 組，每組6 只。實(shí)驗(yàn)前1 d 固定全部大鼠，將各組大鼠右后肢脫毛，除空白組外，其余各組大鼠均參考文獻(xiàn)［12］復(fù)制大鼠外傷血瘀證模型，空白組大鼠固定相同時(shí)間。各給藥組根據(jù)體表面積折算法換算為成人臨床劑量（9 g）的3 倍量（2.43 g/kg）給藥，陽性藥組按照體表面積折算法換算為成人日用量（每粒0.5 g，1 次3 粒，每日2 次）的3 倍量（0.81 g/kg）給藥，混懸藥液灌胃量均為10 mL/kg；空白組和模型組大鼠灌胃等體積的0.1%CMC－Na溶液，每日1次，連續(xù)給藥5 d。

2.2 血液流變學(xué)指標(biāo)檢測(cè)

各組大鼠采用肝素鋰負(fù)壓采血管經(jīng)腹主動(dòng)脈采血，手持采血管中部上下顛倒5～8 次，使全血與肝素鋰充分混勻后，4 h 內(nèi)用自動(dòng)血流變分析儀測(cè)定200、50、30、5、1 1/s 切變率下的全血黏度及全血高切、低切相對(duì)黏度。

2.3 病理標(biāo)本留取

取大鼠傷肢肌肉組織，在10%甲醛溶液中固定24 h，石蠟制片，用蘇木精－伊紅染色（HE 染色），樹膠固封，顯微鏡下進(jìn)行病理觀察。

2.4 生物樣本收集、制備與檢測(cè)

2.4.1 生物樣本采集

末次給藥12 h 后，大鼠均單只放于代謝籠內(nèi)禁食不禁水，收集大鼠12～24 h 尿液后，經(jīng)眼眶靜脈叢采血至涂有1%肝素鈉生理鹽水的離心管內(nèi)。上述生物樣本均離心10 min（4 ℃，3 000 r/min），轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管內(nèi)，得血漿和尿液樣本，于－80 ℃保存。

2.4.2 生物樣本制備

分析前取出血漿和尿液樣本，4 ℃解凍。精確吸取200 μL 血漿，加入4 倍量預(yù)冷24 h 乙腈，渦旋60 s，4 ℃靜置10 min 后，13 000 r/min 離心15 min，轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管中，4 ℃下氮?dú)獯蹈珊笥?00 μL乙腈水溶液（乙腈∶水=8∶2，V/V）復(fù)溶，渦旋60 s，13 000 r/min離心15 min，取上清液進(jìn)樣檢測(cè)。

精確吸取200 μL 尿液，加入4倍量預(yù)冷24 h乙腈，渦旋60 s，4 ℃靜置10 min后，13 000 r/min離心15 min，轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管中，4 ℃下氮?dú)獯蹈珊笥?00 μL乙腈水溶液（乙腈∶水=8∶2，V/V）復(fù)溶，渦旋60 s，13 000 r/min離心15 min，取上清液進(jìn)樣檢測(cè)。

2.4.3 質(zhì)控樣本（quality control samples，QC samples）

分別等量吸取每份血漿和尿液樣本30 μL，混合均勻，得到血漿QC 樣本和尿液QC 樣本，用于檢測(cè)儀器穩(wěn)定性和重復(fù)性。

2.4.4 色譜條件

色譜柱為Acquity UPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm，Waters 公司）；柱溫40 ℃，流速0.3 mL/min，進(jìn)樣量2 μL；流動(dòng)相A為0.1%甲酸水，流動(dòng)相B 為乙腈溶液。洗脫條件［13］：0～1 min，30% B；1～2 min，30%～60% B；2～3 min，60%～70% B；3～6 min，70%～95% B；6～7.5 min，95% B；7.5～7.6 min，30%B；7.6～10 min，30%B。

2.4.5 質(zhì)譜條件

采用TOF MS－IDA－MS/MS，電噴霧離子源（ESI），正、負(fù)離子掃描，掃描范圍50～1 250 m/z。檢測(cè)方式［13］：氣簾氣（CUR）40 psi，霧化氣（GS1）55 psi，輔助氣（GS2）55 psi，電噴霧電壓（ISVF）5 500 eV，離子源溫度（TEM）550 ℃，去簇電壓（DP）± 100 eV；TOF MS 模式下設(shè)置碰撞電壓±10 eV，IDA－MS/MS 條件下設(shè)置碰撞電壓±40 eV，碰撞電壓差20 eV。

2.4.6 進(jìn)樣步驟

血漿和尿液樣本分開進(jìn)樣，分析前先進(jìn)10 次相應(yīng)QC 樣本平衡分析系統(tǒng)后，正式進(jìn)樣。每進(jìn)樣6 個(gè)樣品，進(jìn)1 針相應(yīng)QC 樣本以平衡系統(tǒng)，從而降低進(jìn)樣次序?qū)Ψ治鼋Y(jié)果的影響。

2.5 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

UPLC－Q－TOF－MS/MS 采集的原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)Marker－ViewTM軟件進(jìn)行峰提取，峰對(duì)齊，峰濾波和歸一化預(yù)處理，將得到的數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入SIMCA－P 軟件進(jìn)行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS－DA），篩選差異代謝物。將差異代謝物的質(zhì)荷比、保留時(shí)間以及質(zhì)譜碎片等信息與公共數(shù)據(jù)庫(kù)KEGG（http：//www.genome.jp/kegg/）、HMDB（http：//www.hmdb.ca/）及文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行比對(duì)和確認(rèn)，鑒定差異代謝物。合并正、負(fù)離子模式下的血漿和尿液差異代謝物。通過MetaboAnalyst 5.0（http：//www.metaboanalyst.ca/）基于網(wǎng)絡(luò)的高通量代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)綜合分析差異代謝物的代謝途徑。

血液流變學(xué)指標(biāo)和差異代謝物含量差異通過SPSS 25.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗(yàn)，血液流變學(xué)指標(biāo)結(jié)果以±s表示，差異代謝物含量的變化趨勢(shì)用“↑”表示上調(diào)，“↓”表示下調(diào)，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 外傷血瘀證模型評(píng)價(jià)分析

3.1.1 各組大鼠血液流變學(xué)結(jié)果比較

模型組大鼠造模后血液流變學(xué)相關(guān)指標(biāo)均顯著高于空白組（P＜0.01），說明造模成功；與模型組相比，不同藥物組血液流變學(xué)相關(guān)指標(biāo)均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；與陽性藥組相比，三七－丹參3∶1 組所有血液流變學(xué)指標(biāo)均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），其余藥物組血液流變學(xué)指標(biāo)與陽性藥組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜上，三七、丹參單味入藥及三七－丹參不同比例配伍的藥對(duì)均能改善外傷血瘀證的血液黏稠狀態(tài)，且三七－丹參3∶1 組改善血液黏稠的效果最好。見表1。

表1 各組大鼠血液流變學(xué)結(jié)果比較（±s，n=6）

表1 各組大鼠血液流變學(xué)結(jié)果比較（±s，n=6）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與陽性藥組比較，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01。

組別空白組模型組陽性藥組三七組丹參組三七－丹參3∶1組三七－丹參1∶1組三七－丹參1∶3組全血黏度（mPa·s）低切16.07±2.40 22.70±7.49**9.98±2.06##11.57±1.11##15.04±1.35##9.02±2.58##Δ 10.64±1.63##11.43±1.74##200 1/s 3.71±0.15 5.08±0.13**3.31±0.27##3.16±0.33##3.52±0.14#2.82±0.57##Δ 3.31±0.30##3.36±0.20##50 1/s 4.49±0.23 6.02±0.23**3.88±0.21##3.73±0.40##4.24±0.17#3.03±0.73##Δ 3.90±0.37##4.02±0.28##30 1/s 4.98±0.28 6.62±0.21**4.23±0.19##4.08±0.44##4.69±0.18#3.64±0.24##Δ 4.27±0.42##4.42±0.36##5 1/s 8.70±0.77 10.22±1.11**6.48±1.21##6.75±0.76##8.12±0.33##5.57±0.43##Δ 7.03±0.82##7.54±0.83##1 1/s 19.80±2.46 24.28±4.01**14.23±3.19##14.47±1.74##18.30±0.88##12.94±4.28##ΔΔ 15.00±2.12##16.71±2.50##全血相對(duì)黏度（mPa·s）高切3.01±0.16 5.82±1.19**2.43±0.25##2.52±0.20##2.89±0.16##1.98±0.34##Δ 2.34±0.27##2.30±0.13##

3.1.2 各組大鼠傷肢肌肉組織病理分析比較

空白組肌束和肌纖維形狀完整，清晰可見，肌漿染色均勻，細(xì)胞核正常，未見炎細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組肌束消失，肌纖維溶解消失，肌漿顏色極淺，細(xì)胞核碎裂嚴(yán)重，視野中可見大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)；不同藥物可在不同程度上改善傷肢肌肉組織病變，且三七－丹參3∶1 組恢復(fù)程度最接近空白組。見圖1。

圖1 各組大鼠傷肢肌肉組織HE染色結(jié)果（HE，×400）

3.2 代謝組學(xué)分析

3.2.1 代謝輪廓分析

各組大鼠血漿和尿液正、負(fù)離子模式下的總離子流圖見圖2。可見各組大鼠血漿和尿液初步代謝輪廓相似，但不同時(shí)間下的離子強(qiáng)度各有差異，提示不同保留時(shí)間下的血漿和尿液內(nèi)源性成分的含量有差異。

圖2 各組大鼠血漿、尿液總離子流圖

3.2.2 各組大鼠質(zhì)譜數(shù)據(jù)主成分分析（PCA分析）

UPLC－Q－TOF－MS/MS 檢測(cè)后將正、負(fù)離子模式下血漿和尿液樣本及對(duì)應(yīng)的QC 樣本質(zhì)譜數(shù)據(jù)用Marker－ViewTM預(yù)處理后，將所得數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入SIMCA－P 進(jìn)行PCA 分析。正、負(fù)離子模式下血漿及尿液QC 樣本聚集良好，說明儀器方法穩(wěn)定。正離子模式下，各組血漿和尿液樣本實(shí)現(xiàn)較好聚集，且模型組與空白組完全分離，不同給藥組均有向空白組靠近趨勢(shì)；負(fù)離子模式下，各組血漿和尿液樣本較集中，總體差異不明顯，見圖3。因此進(jìn)一步采用區(qū)分能力更強(qiáng)的有監(jiān)督的正交偏最小（OPLS－DA）二乘判別分析。

圖3 各組大鼠PCA得分圖

3.2.3 外傷血瘀證大鼠差異代謝物OPLS－DA分析

分別將空白組和模型組正、負(fù)離子下血漿和尿液質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行OPLS－DA 建模分析。設(shè)定置換檢驗(yàn)參數(shù)為200，對(duì)模型進(jìn)行檢驗(yàn)（血漿正：Q2=0.805、R2X=0.976、R2Y=0.949；血漿負(fù)：Q2=0.891、R2X=0.954、R2Y=0.956；尿液正：Q2=0.885、R2X=0.922、R2Y=0.999；尿液負(fù)：Q2=0.851、R2X=0.901、R2Y=0.999），模型沒有過度擬合，解釋能力較好，數(shù)據(jù)分析可靠。血漿和尿液樣本正、負(fù)離子模式下空白組與模型組分開，外傷血瘀證大鼠造模后血漿和尿液內(nèi)源性成分發(fā)生改變，說明造模成功，見圖4。以VIP＞1 且t檢驗(yàn)后P＜0.05 為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異變量。將篩選出的差異變量的質(zhì)荷比、保留時(shí)間和質(zhì)譜碎片信息，結(jié)合HMDB、KEGG 及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行比對(duì)分析和鑒定，共鑒定出34 個(gè)外傷血瘀證的差異代謝物，其中血漿差異代謝物22 個(gè)，尿液差異代謝物12 個(gè)，見表2。

表2 外傷血瘀證模型大鼠差異代謝物

圖4 OPLS-DA得分圖

3.2.4 陽性藥、三七、丹參及三七－丹參不同配比藥對(duì)對(duì)差異代謝物的影響

各藥物組血漿和尿液質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)Marker－ViewTM預(yù)處理，分別對(duì)上述差異代謝物進(jìn)行提取，將各差異代謝物在各藥物組內(nèi)的響應(yīng)值與模型組進(jìn)行比較，以不同藥物對(duì)差異代謝物的回調(diào)個(gè)數(shù)來比較治療效果。結(jié)果顯示，陽性藥、三七、丹參和三七－丹參不同比例藥對(duì)均干預(yù)了血漿和尿液內(nèi)源性成分代謝，分別回調(diào)了23、17、17、26、23、21 個(gè)差異代謝物，見表3。綜上，不同藥物均可以通過回調(diào)外傷血瘀證模型大鼠差異代謝物，且三七－丹參3∶1 組回調(diào)差異代謝物最多。

表3 各藥物組對(duì)血漿和尿液差異代謝物的回調(diào)結(jié)果

3.2.5 分層聚類分析

聚類分析熱圖能更加直觀地反映各組間34 個(gè)差異代謝物的含量差異及變化趨勢(shì)。血漿和尿液樣本經(jīng)Marker－ViewTM提取上述差異代謝物對(duì)應(yīng)響應(yīng)值，所得響應(yīng)值矩陣經(jīng)微生信在線數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.bioinformatics.com.cn/）進(jìn)行分層聚類分析。其中，橫向代表樣本信息，縱向代表差異代謝物信息，顏色的深淺則代表差異代謝物含量的高低，紅色表示含量高響應(yīng)值大，綠色表示含量低響應(yīng)值低?？瞻捉M與模型組分于左右兩側(cè)，表明造模后上述差異代謝物含量出現(xiàn)變化；給予陽性藥、三七、丹參和三七－丹參不同比例藥對(duì)后，不同藥物組均有偏離模型組向空白組靠近的趨勢(shì)，說明給予藥物治療后上述差異代謝物含量有向空白組回調(diào)的趨勢(shì)；且陽性藥組和三七－丹參3∶1組較模型組偏離程度最大，更靠近空白組；三七、丹參組較模型組偏離程度低，離模型組最近；三七－丹參1∶1、1∶3 組較模型組偏離程度中等。上述結(jié)果提示三七、丹參及三七－丹參不同配比均可改善外傷血瘀證大鼠血漿和尿液內(nèi)源性成分代謝紊亂，且三七－丹參3∶1組的改善 效果優(yōu)于兩者單用和其他配比組。見圖5。

圖5 血漿樣本聚類分析圖

3.2.6 差異代謝物的通路分析

基于MetaboAnalyst 數(shù)據(jù)庫(kù)Pathway analysis 模塊，導(dǎo)入34個(gè)外傷血瘀證差異代謝物進(jìn)行KEGG代謝通路富集分析，選擇通路影響值（Pathway Impact）＞0.1 的代謝通路作為外傷血瘀證干預(yù)的靶標(biāo)代謝通路。外傷血瘀證大鼠血漿和尿液差異代謝物的含量變化主要干擾了亞油酸代謝，類固醇激素生物合成，α－亞麻酸代謝，花生四烯酸代謝，苯丙氨酸代謝，戊糖和葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)化，賴氨酸降解，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，共8條代謝通路（Impact＞0.1），見圖6。分別導(dǎo)入陽性藥、三七、丹參以及三七－丹參藥對(duì)回調(diào)的差異代謝物，得到不同藥物對(duì)上述外傷血瘀證干預(yù)的代謝通路的調(diào)控結(jié)果，見表4。陽性藥組、三七組、丹參組以及三七－丹參3∶1組、三七－丹參1∶1組、三七－丹參1∶3組分別調(diào)控了7、5、5、8、6、5條上述代謝通路（Impact＞0.1），見表4。綜上，三七、丹參單用或三七－丹參不同配比的藥對(duì)均可調(diào)節(jié)外傷血瘀證大鼠紊亂的代謝通路，且三七－丹參3∶1組調(diào)節(jié)的通路最多，干預(yù)范圍更大。

表4 不同藥物組調(diào)節(jié)血瘀干預(yù)通路Impact值

圖6 代謝通路圖

4 討論

本研究復(fù)制了大鼠外傷血瘀證模型并且通過UPLC－Q－TOF－MS/MS 技術(shù)對(duì)外傷血瘀證大鼠血漿和尿液代謝組進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)大鼠外傷致血瘀后，血液黏度上升，傷肢肌肉組織病變，在血漿和尿液中共鑒定出34 個(gè)差異代謝物，給予陽性藥、三七、丹參以及三七－丹參藥對(duì)不同配比（3∶1、1∶1、1∶3）后，血液黏度和組織病變發(fā)生不同程度改善，分別回調(diào)了23、17、17、26、23、21 個(gè)差異代謝物，干預(yù)了7、5、5、8、6、5 條代謝通路，且均顯示三七－丹參比例為3∶1 時(shí)改善和回調(diào)結(jié)果最好，主要涉及：①炎癥相關(guān)通路，如亞油酸代謝、α－亞麻酸代謝及花生四烯酸代謝通路；②氨基酸代謝相關(guān)通路，如苯丙氨酸代謝、賴氨酸降解及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝；③類固醇激素生物合成；④糖代謝相關(guān)通路，如戊糖和葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)化。

4.1 與血瘀相關(guān)的炎癥通路

外傷血瘀證模型大鼠血漿中亞油酸和花生四烯酸含量均顯著上升，亞油酸是脂肪酸代謝的關(guān)鍵物質(zhì)，也是花生四烯酸合成的前體物質(zhì)，花生四烯酸可以介導(dǎo)炎癥，而炎癥和血瘀呈正相關(guān)［14］，因此模型組中亞油酸和花生四烯酸含量升高導(dǎo)致炎癥加強(qiáng)，從而誘導(dǎo)大鼠出現(xiàn)外傷血瘀證的相關(guān)癥狀。α－亞麻酸可以生成二十碳五烯酸（EPA），可以通過靶向IL－6和TNF－α，從而抑制炎癥［15］。因此模型組血漿中α－亞麻酸含量降低，減少了EPA 的生成，機(jī)體對(duì)炎癥的抑制減弱，從而導(dǎo)致血瘀。陽性藥組、三七組及三七－丹參不同配比藥對(duì)組中，花生四烯酸含量均向空白組回調(diào)；在陽性藥組、三七組及三七－丹參3∶1組和藥對(duì)三七－丹參1∶1組中α－亞麻酸含量向空白組回調(diào)；在所有給藥組中亞油酸含量均向空白組回調(diào)。以上結(jié)果表明各給藥組可以不同程度地調(diào)控外傷血瘀證模型大鼠相關(guān)的炎癥通路，從而達(dá)到治療外傷血瘀證的目的。

4.2 與血瘀相關(guān)的氨基酸代謝通路

谷氨酰胺作為一種條件必需氨基酸，正常情況下通過攝食和體內(nèi)合成就能滿足機(jī)體需求［16］。但當(dāng)機(jī)體處于創(chuàng)傷、術(shù)后、燒傷及腫瘤等嚴(yán)重消耗性疾病狀態(tài)時(shí)，機(jī)體谷氨酰胺的需求增大，血漿中谷氨酰胺濃度下降［17－18］，模型組經(jīng)外傷造模后，血漿樣本中L－谷氨酰胺含量顯著下降，是因?yàn)闄C(jī)體處于創(chuàng)傷狀態(tài)增加了L－谷氨酰胺的消耗。苯丙酮酸作為苯丙氨酸代謝通路的關(guān)鍵物質(zhì)，可以生成L－苯丙氨酸。而L－苯丙氨酸可以在機(jī)體內(nèi)生成酪氨酸，從而促進(jìn)腎上腺素和去甲腎上腺素的生成，兩者會(huì)導(dǎo)致血管收縮，血液黏度增加，產(chǎn)生血瘀［15］。模型組大鼠尿液中苯丙酮酸含量顯著上升，外傷引起的血瘀則導(dǎo)致機(jī)體苯丙氨酸代謝紊亂。同時(shí)，研究表明血瘀狀態(tài)的存在會(huì)導(dǎo)致機(jī)體氨基己二酸水平明顯上升［19］，而氨基己二酸是賴氨酸降解途徑的中間產(chǎn)物，模型組大鼠尿液中氨基己二酸水平顯著上升表明外傷致瘀導(dǎo)致大鼠體內(nèi)賴氨酸降解通路紊亂。給予丹參、三七－丹參3∶1及三七－丹參1∶3藥對(duì)后外傷血瘀證模型大鼠血漿中L－谷氨酰胺含量顯著上升；給予陽性藥、三七及不同比例三七－丹參后血瘀證模型大鼠尿液中苯丙酮酸含量顯著降低；給予陽性藥、丹參、三七－丹參3∶1及三七－丹參1∶1藥對(duì)后尿液中氨基己二酸含量顯著降低。以上研究結(jié)果表明，給予三七、丹參和三七－丹參不同比例藥對(duì)均可調(diào)控外傷血瘀證相關(guān)的氨基酸代謝通路，從而達(dá)到治療外傷血瘀證的目的。

4.3 與血瘀相關(guān)的類固醇生物激素合成

血瘀導(dǎo)致上述亞油酸代謝及花生四烯酸代謝紊亂后，花生四烯酸含量會(huì)上升，其可誘導(dǎo)類固醇合成急性調(diào)節(jié)蛋白（StAR）生成，從而導(dǎo)致類固醇激素生物合成通路上的代謝物含量增加［20］，因此，外傷導(dǎo)致血瘀后，模型組血漿中類固醇類物質(zhì)代謝物21－脫氧皮質(zhì)酮和雄烯二酮含量顯著上升，尿液中17－羥基孕酮、21－羥基孕烯醇酮、脫氫表雄酮、雌酮葡糖苷酸和四氫脫氧皮質(zhì)酮含量上升，以上結(jié)果表明外傷導(dǎo)致的血瘀可使亞油酸代謝及花生四烯酸代謝通路紊亂，然后會(huì)間接干擾機(jī)體內(nèi)的類固醇生物激素合成通路，導(dǎo)致類固醇生物激素合成代謝紊亂。給予陽性藥、丹參及三七－丹參不同比例藥對(duì)治療后，外傷血瘀證模型大鼠血漿中21－脫氧皮質(zhì)酮和雄烯二酮含量顯著降低；給予陽性藥、三七及三七－丹參不同比例藥對(duì)治療后，外傷血瘀證模型大鼠尿液中17－羥基孕酮、21－羥基孕烯醇酮、脫氫表雄酮、雌酮葡糖苷酸和四氫脫氧皮質(zhì)酮含量降低，說明上述不同藥物均可以通過調(diào)節(jié)類固醇生物激素合成從而治療外傷血瘀證。

4.4 與血瘀相關(guān)的戊糖和葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化

血瘀會(huì)導(dǎo)致多條糖代謝紊亂，提示機(jī)體存在糖氧化供能障礙［21］。戊糖和葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化屬糖代謝途徑的一種，模型組尿液中6－羥基－5－甲氧基吲哚葡萄糖醛酸含量降低，說明機(jī)體發(fā)生血瘀癥狀時(shí)，戊糖和葡萄糖相互轉(zhuǎn)化通路發(fā)生紊亂。而給予陽性藥、丹參和三七－丹參3∶1藥對(duì)后6－羥基－5－甲氧基吲哚葡萄糖醛酸含量向空白組回調(diào)，說明上述藥物可以通過調(diào)節(jié)戊糖和葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化治療外傷血瘀證。

綜上，外傷血瘀證的發(fā)生將導(dǎo)致大鼠體內(nèi)多條代謝通路紊亂，三七、丹參及三七－丹參不同配比藥對(duì)均能在一定程度上治療外傷血瘀證，發(fā)揮一定的活血功效。但在回調(diào)差異代謝物數(shù)量上來看，三七－丹參3∶1 組＞三七－丹參1∶1 組=陽性藥組＞三七－丹參1∶3組＞三七組=丹參組；從干預(yù)的重要代謝通路來看，三七－丹參3∶1 組＞陽性藥組＞三七－丹參1∶1 組＞三七－丹參1∶3 組=三七組=丹參組。以上結(jié)果顯示，三七、丹參及其不同比例配伍回調(diào)外傷血瘀證大鼠血漿和尿液差異代謝物的作用不盡相同，三七－丹參3∶1配伍時(shí)治療外傷血瘀證的作用更好。