劉銘霄，吳麗紅，江千舟，謝微，王羽儀，于淼

（廣州醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院牙周病科，廣州市口腔再生醫(yī)學基礎(chǔ)與應用研究重點實驗室，廣州 510182）

牙周炎是以菌斑生物膜為始動因素的口腔慢性感染性疾病，可破壞患者的牙周支持組織，造成附著喪失及牙槽骨吸收，最終導致牙脫落，為中國成年人失牙的首位原因［1］。由于牙周炎進展速度較慢，早期癥狀不明顯，就診時多已發(fā)展為Ⅲ期［2］。牙周炎患者的主要治療目標是清除菌斑生物膜。傳統(tǒng)牙周基礎(chǔ)治療主要采用齦下刮治和根面平整術(shù)（scaling and root planning，SRP）。但單純運用傳統(tǒng)牙周基礎(chǔ)治療難以清理到較為狹窄的區(qū)域，形成的玷污層不利于牙周組織愈合［3-4］，且無法有針對性地清除存留于牙周袋內(nèi)的牙周致病菌［5-6］，常輔助應用全身抗生素治療，但易產(chǎn)生耐藥性［7］。

鉺：釔鋁-石榴石（erbium：yttrium aluminum garnet，Er：YAG）激光可在不造成熱損傷的前提下清除軟硬組織［3］，能較好地清潔根分叉區(qū)等狹窄區(qū)域［8］，具有殺菌潛能和延緩細菌再定植進程的作用［9］。目前一般采用探診深度（probing depth，PD）、附著喪失水平（attachment loss，AL）、菌斑指數(shù)（plaque index，PLI）等評估Er：YAG激光的臨床療效，缺乏微生物學指標，而降低牙周致病菌在齦下菌斑中的比例是牙周炎治療成功的標準之一［10］。本研究從微生物學角度出發(fā)，擬通過觀察對比廣泛型Ⅲ期C級牙周炎（generalized stage Ⅲ grade C periodontitis，GPⅢ-C）患者治療前后的齦下菌斑菌群多樣性及相對豐度等指標，探討Er：YAG激光輔助傳統(tǒng)牙周基礎(chǔ)治療的微生物學療效，為Er：YAG激光的臨床應用提供科學指導依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

本研究招募了2019年9月至2020年8月于廣州醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院牙周科就診的GPⅢ-C患者10例（男5例，女5例），年齡（45.8±11.36）歲，采用歐洲牙周病聯(lián)合會與美國牙周病學會2018年制定的牙周病新分類中GPⅢ-C的診斷標準［11］。排除標準：近3個月內(nèi)進行牙周治療，服用抗生素、非激素類抗炎藥物及免疫抑制劑，有影響牙周治療的全身疾病等。本研究已獲得廣州醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院倫理委員會審批（LCYJ2021010），所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床處理：傳統(tǒng)牙周基礎(chǔ)治療均進行齦上潔治術(shù)，再行超聲齦下潔治術(shù)，隨后用齦下刮治器行SRP，清除根面病變牙骨質(zhì)及齦下牙石；Er：YAG治療應用Er：YAG激光（德國Fotona公司，模式為SP，30 mJ，30 Hz，0.90 W，水8，氣4；LP，120 mJ，15 Hz，1.80 W，水4，氣4）照射經(jīng)傳統(tǒng)牙周基礎(chǔ)治療后的牙根表面及牙周袋內(nèi)壁。

1.2.2 取樣及分組：本研究采用單盲（對臨床指標評價者設(shè)盲）隨機對照研究。每例受試者行自身對照。G1為治療前對照組，G2為牙周基礎(chǔ)治療組，G3為Er：YAG激光治療組。牙周基礎(chǔ)治療與Er：YAG激光輔助治療均于初診時完成。將患者口腔分為4個區(qū)段，選取牙周PD≥6 mm、臨床AL≥5 mm、探診出血陽性患牙，采集每個區(qū)段內(nèi)PD最深位點的齦下菌斑，并將4個位點的集合菌斑迅速放入1.8 mL凍存管，-80 ℃冰箱保存，G1、G2、G3 3次采集位點相同。

1.2.3 16S rDNA測序：采用PowerSoil?DNA Isolation Kit（美國MoBio公司）提取樣本細菌的全部DNA，隨后對16S rDNA基因V3～V4區(qū)進行PCR擴增，使用高通量測序平臺Illumina Miseq（美國Illumina公司）對擴增序列進行測序。

1.2.4 菌群數(shù)據(jù)的生物信息分析：測序數(shù)據(jù)通過自編的生物信息工具進行低質(zhì)量過濾，并采用FLASH軟件v1.2.11（http：//ccb.jhu.edu/software/FLASH/index.shtml）進行序列拼接，再通過USEARCH聚合成OTUs（可分類元件）比對細菌庫（Greengene v13.5）進行細菌分類注釋，從而獲得所有樣本的菌群組成數(shù)據(jù)。隨后，對各組樣本的細菌豐度在門、綱、目、科和屬水平進行差異檢驗分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

運用R軟件（v3.6.0）進行統(tǒng)計學分析。對3組樣本的菌群結(jié)構(gòu)進行差異檢驗，2組比較采用Wilcoxon秩和檢驗，3組間比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 3組樣本菌群整體結(jié)構(gòu)變化

3組樣本alpha多樣性分析顯示，G1組Shannon指數(shù)（2.84）與G2組（4.17）比較差異顯著（P=0.009），G2組菌群多樣性（4.17）明顯高于G1組（2.84），G3組（4.01）菌群多樣性較G2組略有下降（圖1A）。菌斑組成的主成分分析（principal components analysis，PCA）結(jié)果提示，G1組與G3組的樣本呈現(xiàn)各自聚集趨勢，而G2組則為G1和G3組的中間過渡形式（圖1B）。

圖1 齦下菌斑菌群分布PCA分析及alpha多樣性分析Fig.1 PCA and alpha diversity analysis of subgingival plaque

2.2 屬水平優(yōu)勢菌及組成差異分析

對各組進行菌屬結(jié)構(gòu)分析（表1，圖2），G1組優(yōu)勢菌屬分別為梭形桿菌屬（25.3%）、卟啉單胞菌屬（17.7%）、二氧化碳嗜纖維菌屬（9.6%）、普雷沃氏菌屬（8.4%）、纖毛菌屬（7.2%）；G2組分別為未分類屬（29.3%）、梭形桿菌屬（19.3%）、二氧化碳嗜纖維菌屬（7.3%）、放線菌屬（6.8%）、卟啉單胞菌屬（4.8%）；G3組分別為未分類屬（29.9%）、四合球菌屬（12.1%）、放線菌屬（10.2%）、羅斯氏菌屬（7.9%）、梭形桿菌屬（7.3%）。對3組菌屬相對豐度差異性比較（表2），梭形桿菌屬（G1組25.38%，G2組19.29%，G3組7.31%）、卟啉單胞菌屬（G1組17.72%，G2組4.79%，G3組3.09%）、普雷沃氏菌屬（G1組8.44%，G2組2.54%，G3組2.13%）、坦納氏菌屬（G1組1.83%，G2組1.67%，G3組0.52%）的相對豐度有統(tǒng)計學差異（P＜ 0.05），在G1、G2、G3組的比例呈逐漸下降趨勢。

圖2 3組齦下菌斑菌群在屬水平的組成柱狀圖Fig.2 Histogram of composition of subgingival plaque flora at genus level

表1 G1、G2、G3組齦下菌斑中前10位優(yōu)勢菌屬（）Tab.1 Top 10 bacteria in subgingival plaque of G1，G2 and G3 at genus level（）

表1 G1、G2、G3組齦下菌斑中前10位優(yōu)勢菌屬（）Tab.1 Top 10 bacteria in subgingival plaque of G1，G2 and G3 at genus level（）

G1，before treatment;G2，after conventional mechanical treatment;G3，after both conventional mechanical treatment and Er:YAG laser adjunctive treatment.

經(jīng)Er：YAG激光治療后，G3組與G2組相比（表2），二氧化碳嗜纖維菌屬（7.36% vs 0.98%）、梭形桿菌屬（19.29% vs 7.31%）、坦納氏菌屬（1.67% vs 0.52%）等革蘭氏陰性菌屬的比例均顯著下降（P＜ 0.05），而四合球菌屬、放線菌屬、羅斯氏菌屬、產(chǎn)線菌屬等革蘭氏陽性菌屬的相對豐度無顯著差異，甚至存在羅斯氏菌屬（G2組3.54%，G3組7.95%）和四合球菌屬（G2組4.08%，G3組12.08%）的相對豐度升高的現(xiàn)象。G1組與G3組相比，菌屬相對豐度差異大于僅經(jīng)傳統(tǒng)牙周基礎(chǔ)治療（G2組），主要體現(xiàn)在卟啉單胞菌屬（G2組下降73.0%，G3組下降82.6%）和普雷沃氏菌屬（G2組下降69.9%，G3組下降74.8%）。且G3組的梭形桿菌屬（下降71.2%）、坦納氏菌屬（下降71.6%）、產(chǎn)線菌屬（下降67.4%）較G1組顯著下降，四合球菌屬（上升46.20倍）較G1組顯著上升（P＜ 0.05），但上述菌屬在G1組與G2組間均無統(tǒng)計學差異。

表2 屬水平豐度顯著差異的優(yōu)勢菌屬（%）Tab.2 Dominant bacteria with significant difference in abundance at the genus level（%）

2.3 種水平優(yōu)勢菌及組成差異分析

各組前10位優(yōu)勢菌種的相對豐度見表3和圖3。3組之間存在顯著統(tǒng)計學差異的菌種見表4，具核梭桿菌（G1組24.89%，G2組18.99%，G3組6.93%）、牙髓卟啉單胞菌（G1組3.97%，G2組1.96%，G3組0.48%）、福賽坦氏菌（G1組1.83%，G2組1.67%，G3組0.52%）、中間普氏菌（G1組3.21%，G2組0.55%，G3組0.28%）、直腸彎曲桿菌（G1組2.20%，G2組0.95%，G3組0.24%）等牙周致病菌比例呈逐漸下降趨勢。牙齦卟啉單胞菌的相對豐度（G1組13.12%，G2組2.59%，G3組2.47%）雖呈降低趨勢，但Er：YAG激光治療前后其相對豐度無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表4 種水平豐度顯著差異的優(yōu)勢菌種（%）Tab.4 Dominant bacteria with significant difference in abundance at the species level（%）

圖3 3組齦下菌斑菌群在種水平的組成柱狀圖Fig.3 Histogram of composition of subgingival plaque at species level

表3 G1、G2、G3齦下菌斑中前15位優(yōu)勢菌種（）Tab.3 Top 15 bacteria in subgingival plaque of G1，G2 and G3 at species level（）

表3 G1、G2、G3齦下菌斑中前15位優(yōu)勢菌種（）Tab.3 Top 15 bacteria in subgingival plaque of G1，G2 and G3 at species level（）

G2組與G3組相比，經(jīng)Er：YAG激光治療后，G3組具核梭桿菌（18.99% vs 6.93%）、牙髓卟啉單胞菌（1.96% vs 0.48%）、福賽坦氏菌（1.67% vs 0.52%）、直腸彎曲桿菌（0.95% vs 0.24%）、利氏二氧化碳嗜纖維菌（0.92% vs 0.12%）等革蘭氏陰性菌的比例均顯著下降（P＜ 0.05），但Tessaracoccus lapidicaptus（4.08%vs 12.08%）、空間羅氏菌（3.5% vs 7.92%）等革蘭氏陽性菌的比例上升。且G3組中間普氏菌（下降91.4%）較G1組顯著下降（P＜ 0.05），但中間普氏菌的相對豐度在G1與G2組間無統(tǒng)計學差異。

3 討論

3.1 Er：YAG激光可降低牙周致病菌的相對豐度進而削弱致病能力

牙周炎在多種牙周致病菌的作用下發(fā)生發(fā)展，有效清除牙周致病菌是牙周治療的關(guān)鍵［10，12］。多項研究［13-15］結(jié)果表明，增設(shè)Er：YAG激光輔助治療的臨床療效參數(shù)優(yōu)于單純傳統(tǒng)牙周基礎(chǔ)治療。雖然牙齦卟啉單胞菌被認為是關(guān)鍵牙周致病菌，但本研究從微生物學角度發(fā)現(xiàn)，Er：YAG激光輔助治療取得良好療效的作用機制為它能顯著降低具核梭桿菌、牙髓卟啉單胞菌、福賽坦氏菌等牙周致病菌的相對豐度（P＜ 0.05），而不在于清除牙齦卟啉單胞菌（P=0.76）。ZENGIN 等［16］的研究也發(fā)現(xiàn)，Er：YAG激光輔助治療雖然能取得良好的臨床療效，但并不會顯著降低齦下菌斑中牙齦卟啉單胞菌的豐度。這可能是由于牙齦卟啉單胞菌對波長為2 940 nm的Er：YAG激光吸收系數(shù)較低，Er：YAG激光無法使牙齦卟啉單胞菌內(nèi)部壓力升高產(chǎn)生微爆破作用和顯著降低脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），從而清除牙齦卟啉單胞菌。本研究中，豐度最高、致病性較強的具核梭桿菌（下降63.5%）為主要牙周致病菌，它存在的部位常伴隨著牙齦卟啉單胞菌［17］。因其具有較強的黏附和入侵細胞能力，能使牙齦卟啉單胞菌黏附于其表面從而助長牙齦卟啉單胞菌入侵牙齦上皮細胞和主動脈內(nèi)皮細胞的能力［18］，增強了牙齦卟啉單胞菌的致病性。不僅如此，DIAZ等［19］研究發(fā)現(xiàn)，在缺乏具核梭桿菌的環(huán)境下牙齦卟啉單胞菌無法存活，提示具核梭桿菌可以為牙齦卟啉單胞菌提供必要的生存條件。因此，Er：YAG激光雖然不能選擇性作用于牙齦卟啉單胞菌，但其能顯著降低具核梭桿菌的相對豐度，進而間接降低牙齦卟啉單胞菌的致病能力，對牙周炎的治療具有積極意義。

3.2 Er：YAG激光對齦下菌斑微生物膜的改善作用

牙周炎發(fā)病過程中齦下微生物群發(fā)生了從革蘭氏陽性菌占優(yōu)勢向革蘭氏陰性菌占優(yōu)勢的轉(zhuǎn)變［20］，慢性牙周炎患者齦下微生物群中革蘭氏陰性菌占75%左右［21］。因此，牙周炎的治療目標不僅在于清除菌斑和牙石，還在于實現(xiàn)將齦下菌斑生物膜轉(zhuǎn)變?yōu)楦锾m氏陽性菌占優(yōu)勢的微生物膜。本研究發(fā)現(xiàn)，Er：YAG激光缺乏對放線菌屬、四合球菌屬、羅斯氏菌屬、產(chǎn)線菌屬等革蘭氏陽性菌屬以及Tessaracoccus lapidicaptus、空間羅氏菌等革蘭氏陽性菌種的清除作用，因而表現(xiàn)為優(yōu)勢菌屬中Er：YAG激光治療前后革蘭氏陽性菌的相對豐度升高和革蘭氏陰性菌的相對豐度下降。這與Er：YAG激光的殺菌機制密切相關(guān)，Er：YAG激光（波長2.94 μm）通過作用于革蘭氏陰性菌細胞壁上的LPS（波長2.92 μm）而達到滅菌的目的［22-23］，而上述革蘭氏陽性菌細胞壁缺乏LPS。不僅如此，具核梭桿菌通過為密螺旋體、福賽坦氏菌、牙齦卟啉單胞菌附著于齦下菌斑提供結(jié)合位點［24］，促進齦下菌斑由革蘭氏陽性菌占優(yōu)勢的微生物膜向革蘭氏陰性菌占優(yōu)勢的微生物膜轉(zhuǎn)變。而Er：YAG激光對具核梭桿菌的殺滅作用能一定程度上阻斷轉(zhuǎn)變過程。故Er：YAG激光輔助治療不僅有利于殺滅牙周致病菌（多為革蘭氏陰性菌），還能促進齦下菌斑生物膜向革蘭氏陽性菌占優(yōu)勢的微生物膜轉(zhuǎn)變。提示傳統(tǒng)牙周基礎(chǔ)治療存在局限性，單獨運用無法選擇性降低革蘭氏陰性菌的相對豐度，而Er：YAG激光輔助治療具有優(yōu)越性。

本研究納入了10例GPⅢ-C患者，共采集30個齦下菌斑樣本，G2組、G3組分別有1個和3個樣本擴增失敗，可能是由于經(jīng)傳統(tǒng)牙周基礎(chǔ)治療及Er：YAG激光輔助治療后，齦下菌斑余留量較少，采集量不足，也從側(cè)面反映了Er：YAG激光輔助治療能進一步降低齦下菌斑菌群豐度，尚需擴大樣本量進一步深入研究。本研究探討了Er：YAG激光作用后的即刻效應，未來可增設(shè)定期隨訪研究，同時，今后將采用平行對照設(shè)計，擴大研究的樣本量，以驗證本研究結(jié)果。

綜上所述，Er：YAG激光輔助治療雖對牙齦卟啉單胞菌的作用有限，但能在單純應用傳統(tǒng)牙周基礎(chǔ)治療的基礎(chǔ)上，進一步選擇性清除具核梭桿菌、福賽坦氏菌、牙髓卟啉單胞菌等牙周致病菌，且有利于齦下菌斑向革蘭氏陽性菌占優(yōu)勢的微生物膜轉(zhuǎn)變，值得臨床上作為輔助治療應用和推廣。