佟麗斐，張霞，楊玉蝶，李起征，劉鵬

（大連醫(yī)科大學(xué) 1.附屬大連市第五人民醫(yī)院放療科，遼寧 大連 116021；2.附屬大連市第五人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，遼寧 大連 116021；3.附屬第一醫(yī)院腫瘤科，遼寧 大連 116011；4.附屬大連市中心醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，遼寧 大連 116033）

前列腺癌是一種危及生命的男性惡性腫瘤，2018年約新增130萬例，死亡35.9萬人［1］。盡管隨著診斷和治療的不斷進展，患者的生存時間極大延長，但部分高度惡性患者的5年總生存率仍很低［2］。因此，研究前列腺癌惡性發(fā)生、發(fā)展的分子機制，有助于臨床減緩甚至抑制前列腺癌的惡性進展。近年來，大量證據(jù)證實長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）在前列腺癌中發(fā)揮關(guān)鍵作用［3-4］。lncRNA可以競爭性結(jié)合微RNA，或作為橋接分子與其他功能蛋白形成功能復(fù)合體，從而調(diào)控腫瘤生長、轉(zhuǎn)移過程關(guān)鍵基因的表達(dá)［3］。最近研究［5-7］發(fā)現(xiàn)，lncRNA小核仁RNA宿主基因7（small nucleolar RNA host gene 7，SNHG7）在多種腫瘤中呈異常高表達(dá)，而SNHG7異常高表達(dá)與乳腺癌、肺腺癌、膠質(zhì)瘤的不良預(yù)后相關(guān)。盡管近期有研究［8］發(fā)現(xiàn)SNHG7在前列腺癌中高表達(dá)，但SNHG7在前列腺癌惡性進展中的功能仍有待進一步探索。

Rho關(guān)聯(lián)含卷曲螺旋蛋白激酶1（Rho-associated coiled-coil domain containing protein kinase 1，ROCK1）是轉(zhuǎn)化生長因子β/Smads信號通路調(diào)控因子，編碼一種蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶，當(dāng)與Rho的鳥苷三磷酸結(jié)合時將被激活［9］。前期研究［10］表明，ROCK1參與多種疾病的發(fā)病過程。此外，ROCK1在多種腫瘤的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用，激活ROCK1信號通路已被證實可促進胰腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［10］，ROCK1還可通過抑制PTEN/FAK通路促進非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展［11］。盡管已經(jīng)在多種腫瘤中明確其作用，但ROCK1在前列腺癌中的具體調(diào)控機制尚不清楚。本研究通過Western blotting、Transwell實驗、熒光原位雜交實驗等深入探討SNHG7對前列腺癌細(xì)胞的惡性調(diào)節(jié)能力及可能機制，從而為前列腺癌的治療提供有效策略。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人正常前列腺上皮細(xì)胞系RWPE、前列腺癌細(xì)胞系PC-3購自中國科學(xué)院上海分院，細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)基（北京賽默飛），并添加10%胎牛血清（美國Gemini Bio-Products）和100 U青霉素和鏈霉素雙抗（北京索萊寶）。VCaP和DU145細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基，并添加10%胎牛血清和100 U青霉素和鏈霉素雙抗。細(xì)胞于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 轉(zhuǎn)染

使用Lipofectamine 3000試劑盒（美國Invitrogen）轉(zhuǎn)染SNHG7，根據(jù)說明書進行操作。SNHG7敲低質(zhì)粒和ROCK1過表達(dá)質(zhì)粒由上海吉瑪公司合成（si-NC和pcDNA3.1分別為敲低和過表達(dá)空白載體，即陰性對照組）。細(xì)胞生長融合度達(dá)到90%時進行傳代，傳代按照1 ∶3比例進行。待細(xì)胞生長鋪滿皿底50%左右進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染過程根據(jù)說明書添加Lipofectamine 3000和P3000，轉(zhuǎn)染后6 h換液，換液后24～48 h進行PCR檢測，48～72 h進行Western blotting。SNHG7敲低序列（si-SNHG7）：5’-GCUGGAAUAAA GAGUAACAUU-3’；陰性對照（si-NC）序列：5’-UU CUCCGAACGUGUCACGUTT-3’。

1.3 MTT實驗

將5×103個細(xì)胞置于96孔板中，37 ℃培養(yǎng)。待細(xì)胞進行SNHG7轉(zhuǎn)染后，每孔加入10 μL MTT溶液，于37 ℃孵育4 h。在490 nm處測定各樣品的分光光度。所有實驗重復(fù)3次，計算平均值。

1.4 Transwell實驗

通過Transwell實驗（美國Costar）體外評估前列腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，將1×105個細(xì)胞接種于上室，并加入300 μL 培養(yǎng)基，下室加入等量培養(yǎng)基。48 h后擦除膜表面的細(xì)胞，使用甲醛固定20 min，隨后PBS清洗3遍，最后用0.5%結(jié)晶紫染色。在顯微鏡下隨機分為5個區(qū)，計數(shù)浸潤和遷移細(xì)胞數(shù)目。

1.5 總RNA提取和PCR

按照說明書使用TRIzol試劑分離總RNA。使用PrimeScript試劑盒（日本TaKaRa），根據(jù)說明書進行逆轉(zhuǎn)錄和實時PCR。使用SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ在Bio-Rad CFX 96實時PCR系統(tǒng)上進行實時PCR。GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法測定基因相對表達(dá)量。引物序列：SNHG7，正義5’-GTTGGGGTGTTGGCAT TCTTGTT-3’，反 義5’-GCGCCCAATACGACCAAAT C-3’；ROCK1，正 義5’-CTGCAACTGGAACTCAACC AAGAA-3’，反 義5’-TTAGCACGCAATTGCTCAATA TCAC-3’；GAPDH，正義5’-CGTCGCTAGCGATCGT TACA-3’，反義5’-CTAAATGCTAGTCTTTACGA-3’。

1.6 Western blotting

將SNHG7轉(zhuǎn)染后的前列腺癌細(xì)胞溶解于含有蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液。蛋白（20 μg）經(jīng)過10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移到聚偏二乙烯膜上。使用針對ROCK1（中國CST公司）和GAPDH（中國CST公司）的一抗進行孵育，4 ℃過夜，翌日TBST清洗，每次5 min；隨后熒光二抗室溫孵育2 h（中國CST公司）。使用增強化學(xué)發(fā)光試劑進行發(fā)光成像（型號：FD8020，杭州富德生物科技有限公司）。

1.7 熒光原位雜交實驗

將細(xì)胞均勻鋪在6孔板中，使用4%多聚甲醛固定20 min，PBS清洗3次，每次5 min；隨后使用甘氨酸處理5 min，PBS再次沖洗5 min；使用0.5% Triton-100對細(xì)胞進行透膜10 min；PBS清洗3次，每次3 min；滴加雜交液預(yù)處理1 h，然后使用生物素標(biāo)記的SNHG7探針（武漢塞維爾）進行細(xì)胞孵育，4 ℃過夜；抗生物素抗體（北京賽默飛）進行雜交過夜，最后滴加熒光二抗（北京CST），進行DAPI（北京碧云天）顯色。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用GraphPad Prism 5軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。每個實驗重復(fù)3次，結(jié)果以表示。采用t檢驗進行2組間比較。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SNHG7在前列腺癌中高表達(dá)并提示預(yù)后不良

為了分析SNHG7在前列腺癌中的表達(dá)，首先通過癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫（http：//gepia.cancer-pku.cn）對其進行癌和癌旁組織表達(dá)差異分析。結(jié)果顯示，SNHG7在前列腺癌組織中高表達(dá)（圖1A）。此外，生存分析提示，高表達(dá)SNHG7與患者生存時間較短明顯相關(guān)（圖1B）。細(xì)胞學(xué)實驗發(fā)現(xiàn)，與人正常前列腺上皮細(xì)胞（RWPE）相比，前列腺癌細(xì)胞（PC-3、VCaP和DU145）中SNHG7明顯高表達(dá)（圖1C）。這些結(jié)果提示，SNHG7在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。

圖1 SNHG7在前列腺癌中高表達(dá)并提示預(yù)后不良Fig.1 SNHG7 is highly expressed in prostate cancer and indicates a poor prognosis

2.2 SNHG7主要位于細(xì)胞質(zhì)

鑒于SNHG7在腫瘤組織和細(xì)胞中高表達(dá)，為進一步了解其功能和機制，通過熒光原位雜交實驗檢測SNHG7的亞細(xì)胞分布情況。結(jié)果提示，SNHG7主要位于細(xì)胞質(zhì)。見圖2。

圖2 SNHG7主要位于細(xì)胞質(zhì)中 ×400Fig.2 SNHG7 is mainly located in the cytoplasm ×400

2.3 敲低SNHG7抑制了前列腺癌細(xì)胞的增殖和遷移能力

為了進一步分析SNHG7的功能，構(gòu)建SNHG7敲低細(xì)胞系。通過PCR對敲低細(xì)胞系進行SNHG7檢測（圖3A），結(jié)果顯示，成功構(gòu)建了敲低細(xì)胞系。隨后使用SNHG7敲低細(xì)胞系進行MTT檢測，評估SNHG7對PC-3細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其抑制了細(xì)胞增殖（圖3B）。Transwell遷移實驗也發(fā)現(xiàn)，其抑制了前列腺癌細(xì)胞遷移（圖3C）。這些結(jié)果提示，SNHG7在前列腺癌細(xì)胞的增殖和遷移中發(fā)揮重要作用。

圖3 敲低SNHG7可抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖和遷移Fig.3 SNHG7 knockdown inhibits prostate cancer cell proliferation and migration

2.4 SNHG7調(diào)控ROCK1的表達(dá)

為了分析SNHG7能否通過ROCK1調(diào)節(jié)前列腺癌細(xì)胞的惡性進展，采用PCR檢測ROCK1的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ROCK1在多種前列腺癌細(xì)胞中高表達(dá)（圖4A）。而當(dāng)敲低SNHG7后，ROCK1mRNA表達(dá)減少（圖4B），蛋白表達(dá)減少（圖4C）。這說明SNHG7的對前列腺癌細(xì)胞惡性能力的調(diào)控可能是ROCK1介導(dǎo)的。

圖4 敲低SNHG7可抑制ROCK1的表達(dá)Fig.4 SNHG7 knockdown inhibited ROCK1 expression

2.5 SNHG7通過ROCK1調(diào)控前列腺癌細(xì)胞的增殖和遷移

進一步分析SNHG7與ROCK1及前列腺癌細(xì)胞增殖和遷移能力的關(guān)系，進行挽救實驗。首先構(gòu)建ROCK1過表達(dá)細(xì)胞系，通過PCR（圖5A）和Western blotting（圖5B）檢測轉(zhuǎn)染后ROCK1的表達(dá)，結(jié)果證實，ROCK1過表達(dá)細(xì)胞系成功構(gòu)建。隨后使用SNHG7敲低細(xì)胞系同時進行ROCK1敲低，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，前列腺癌PC-3細(xì)胞的增殖（圖5C）和遷移能力（圖5D）恢復(fù)。以上結(jié)果表明，SNHG7通過ROCK1調(diào)控前列腺癌細(xì)胞的增殖和遷移。

圖5 SNHG7通過ROCK1調(diào)控前列腺癌細(xì)胞的增殖和遷移Fig.5 SNHG7 regulates prostate cancer cell proliferation and migration through ROCK1

3 討論

近幾十年來，lncRNA在疾病特別是癌癥中的重要作用越來越受到人們的關(guān)注。研究［12］已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，許多l(xiāng)ncRNA作為癌基因或腫瘤抑制因子，可以調(diào)控前列腺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移，但不同lncRNA在不同腫瘤中的作用尚不明確。lncRNA SNHG7是近年發(fā)現(xiàn)的新型非編碼RNA，多項研究［13］表明，lncRNA SNHG7在多種癌癥中過表達(dá)，包括肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌和膀胱癌，通過多種途徑促進腫瘤的發(fā)生。最近有研究［14］報道了SNHG7加速前列腺癌的惡性進展，但SNHG7在其中的調(diào)節(jié)機制需要進一步探索。

本研究發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，lncRNA SNHG7在癌組織中明顯上調(diào)，并且SNHG7高表達(dá)提示患者生存時間縮短，體外細(xì)胞實驗同樣證明其在多種腫瘤細(xì)胞系中高表達(dá)。這些結(jié)果提示，SNHG7在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展中可能起到重要作用。為了闡明SNHG7異常高表達(dá)的意義，本研究通過細(xì)胞增殖實驗和Transwell實驗檢測細(xì)胞增殖和遷移能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SNHG7敲低后前列腺癌PC-3細(xì)胞的增殖和遷移能力都被抑制。近年發(fā)現(xiàn)ROCK1與多種腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，包括骨肉瘤、胰腺癌甚至血液系統(tǒng)腫瘤。ROCK1功能多樣化，廣泛參與多種細(xì)胞過程，包括凋亡、侵襲、纖維化等［15］。然而，SNHG7與ROCK1之間的調(diào)控關(guān)系尚不清楚。為此，本研究構(gòu)建了SNHG7敲低前列腺癌細(xì)胞系，通過共轉(zhuǎn)染實驗發(fā)現(xiàn)，敲低SNHG7后ROCK1的表達(dá)明顯減少；并且通過MTT實驗和Transwell實驗發(fā)現(xiàn)，SNHG7敲低后細(xì)胞的增殖和遷移能力可被過表達(dá)ROCK1恢復(fù)。

綜上所述，SNHG7對于前列腺癌生長、轉(zhuǎn)移的調(diào)控是通過ROCK1介導(dǎo)的，以SNHG7或ROCK1為靶點的腫瘤治療方式可能成為治療前列腺癌的一種有效策略。