邵帥，魯美麗，高秀秋，王洪新

（錦州醫(yī)科大學(xué) 1.附屬第二醫(yī)院牙周科；2.藥學(xué)院藥理教研室，遼寧 錦州 121000）

牙周炎是一種發(fā)生在牙周支持組織的慢性破壞性疾病。而牙周袋袋壁的炎癥與牙槽骨的吸收是牙周炎的典型特點(diǎn)［1］。牙周炎的發(fā)生及發(fā)展過程與牙周致病菌有著密不可分的聯(lián)系，牙周致病菌釋放的毒力因子如白細(xì)胞毒素、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、牙齦素等能夠直接引起牙周局部刺激，致使白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等炎性細(xì)胞因子水平顯著上升［2］。大量證據(jù)表明，過度分泌核因子受體激活因子κB配體（the receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）是破骨形成的關(guān)鍵因素。骨保護(hù)素（osteoclastogenesis inhibitory factor，OPG）是RANKL的誘餌受體，增加OPG的表達(dá)可抑制或延遲破骨細(xì)胞的發(fā)生。因此，OPG與RANKL的比值表示骨穩(wěn)態(tài)［3］。

黃芪甲苷（astragaloside Ⅳ，AS-Ⅳ）為羊毛酯醇形的四環(huán)三萜皂苷，是中藥黃芪的主要活性成分之一。研究［4］發(fā)現(xiàn)AS-Ⅳ有很好的抗炎效果，如LPS誘導(dǎo)的器官損傷、缺血再灌注損傷、過敏性疾病等。然而，對AS-Ⅳ在牙周炎癥及骨穩(wěn)態(tài)方面藥理作用的相關(guān)研究較少，ZHANG等［5］探討了AS-Ⅳ對實(shí)驗(yàn)性牙周炎大鼠炎癥和免疫功能的影響，但對研究機(jī)制并沒有明確的闡述。因此，本研究擬探討AS-Ⅳ在體外對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥的作用，以及對RANKL/OPG表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑

AS-Ⅳ（含量＞98%）購自南京景竹生物科技有限公司。小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7購自中國上海細(xì)胞庫；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Bio-Rad公司；LPS和DMSO購自美國Sigma公司；細(xì)胞計數(shù)試劑（cell counting kit-8，CCK-8）、ELISA試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；β-actin、Toll樣受體4（Tolllike receptor 4，TLR4）、磷酸化核因子κB抑制劑α（phosphonated inhibitor of kappa-B，P-IκBα）、磷酸化核因子κB（phospho-nuclear factor kappa-B P65，P-NF-κB P65）、RANKL、OPG抗體購自美國Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

RAW264.7細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。收集對數(shù)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞活力檢測

1.3.1 細(xì)胞活力：RAW264.7細(xì)胞懸液以5 000/孔的細(xì)胞密度接種于96孔板，每孔100 μL。設(shè)置調(diào)零組（培養(yǎng)基）、對照組（細(xì)胞+培養(yǎng)基）、AS-Ⅳ 組（10、25、50、100 μg/mL），每組3個復(fù)孔，處理24 h后每孔加入10 μL CCK-8，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h后，酶標(biāo)儀在 450 nm 處測量吸光度。

1.3.2 細(xì)胞毒性：設(shè)置調(diào)零組、對照組、LPS（2 μg/mL）組和LPS+AS-Ⅳ組（10、25、50、100 μg/mL），細(xì)胞懸液以5 000/孔的細(xì)胞密度接種于96孔板，每孔100 μL，待細(xì)胞達(dá)到生長對數(shù)期后，LPS+AS-Ⅳ組分別加入相應(yīng)濃度的AS-Ⅳ，培養(yǎng)24 h后，除對照組，調(diào)零組外加入相應(yīng)濃度的LPS共同孵育24 h后每孔加入10 μL CCK-8，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h后，酶標(biāo)儀在450 nm 處測量吸光度。

1.4 ELISA檢測IL-1β、IL-6、TNF-α炎性細(xì)胞因子含量

將細(xì)胞分為空白對照組、LPS組、AS-Ⅳ 50 μg/mL和AS-Ⅳ 100 μg/mL 4個組。以1×106/孔的接種密度接種于6孔板中。藥物處理后，吸取細(xì)胞培養(yǎng)基，收集上清，3 000 r/min 離心 10 min。按照 ELISA 試劑盒說明書，測定細(xì)胞培養(yǎng)基中IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)水平。

1.5 實(shí)時PCR檢測RANKL和OPG mRNA的表達(dá)

實(shí)時PCR檢測RAW264.7細(xì)胞中RANKL和OPGmRNA的表達(dá)。提取細(xì)胞的總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，擴(kuò)增。按照試劑盒的步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃、30 s；循環(huán)反應(yīng) 95 ℃、5 s；60 ℃、30 s，共40個循環(huán)；溶解曲線95 ℃、15 s、60 ℃、1 min、95 ℃、15 s。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法分析。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.6 Western blotting 檢測相關(guān)蛋白表達(dá)

用裂解液提取細(xì)胞中蛋白，然后使用 BCA 蛋白測定試劑盒測量蛋白濃度。將樣品蛋白在8%～12%SDS-PAGE 凝膠上分離，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。膜用1%BSA封閉1.5h，然后分別與TLR4、P-IκBα、P-NFκB P65、RANKL和OPG一抗 4 ℃孵育過夜。二抗在室溫孵育 2 h。采用 Image-J 軟件分析結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用 SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)均以表示。多組間顯著性檢驗(yàn)采用單因素方差分析和 LSD 法。P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AS-Ⅳ對RAW264.7對細(xì)胞活力的影響

RAW264.7細(xì)胞經(jīng)不同濃度AS-Ⅳ處理后，其細(xì)胞活力無顯著變化（P＞ 0.05），見圖1。RAW264.7細(xì)胞在不同濃度的AS-Ⅳ預(yù)處理24 h后，再經(jīng)LPS刺激24 h，與對照組相比，LPS組細(xì)胞活力顯著下降（P＜0.01）；10 μg/mL組細(xì)胞活力與LPS組無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞ 0.05）；25 μg/mL組與LPS組比較細(xì)胞活力有顯著差異（P＜ 0.05）；50 μg/mL、100 μg/mL組與LPS組比較細(xì)胞活力有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜ 0.01）。見圖2。

圖1 不同濃度AS-Ⅳ對RAW264.7細(xì)胞活力的影響Fig.1 Effects of different concentrations of AS-Ⅳ on RAW264.7 cell viability

圖2 不同濃度AS-Ⅳ對LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞活力的影響Fig.2 Effects of different concentrations of AS-Ⅳ on viability of RAW264.7 cells stimulated by LPS

2.2 AS-Ⅳ對IL-1β、IL-6、TNF-α炎性細(xì)胞因子釋放的影響

與對照組相比，LPS組IL-1β（741.00±11.00）、IL-6（915.33±12.22）和TNF-α（616.33±11.15）釋放量顯著增高（P＜0.01）；與LPS組相比50μg/mL和100μg/mL組IL-1β（523.3±14.05，234.3±12.10）、IL-6（611.33±8.51，305±11.14）和TNF-α（407.67±14.98，193.67±9.45）釋放量顯著降低（P＜0.01）。見圖3。

圖3 AS-IV對炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響Fig.3 Effect of AS-IV on expression of cytokines

2.3 AS-Ⅳ對RANKL和OPGmRNA表達(dá)的影響

與對照組相比，LPS組RANKLmRNA（0.17±0.06）表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01）；與LPS組相比，50μg/mL和100μg/mL組RANKLmRNA（0.43±0.08，0.61±0.04）表達(dá)顯著降低（P＜0.01）；與對照組相比，LPS組OPGmRNA（5.27±0.63）的表達(dá)顯著下降（P＜0.01）；與LPS組相比，50μg/mL和100μg/mL組OPGmRNA（3.09±0.44；2.20±0.36）表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.01）；與對照組相比，LPS組OPG/RANKL的比值（0.03±0.01）大幅度降低（P＜0.01）；與LPS組相比50μg/mL組OPG/RANKL的比值（0.14±0.03）升高（P＜0.05），100μg/mL組OPG/RANKL的比值（0.28±0.02）顯著上升（P＜0.01）。見圖4。

圖4 AS-IV對RANKL/OPG系統(tǒng)的影響Fig.4 Effect of AS-IV on the RANKL/OPG system

2.4 AS-Ⅳ對NF-κB信號通路以及OPG、RANKL蛋白表達(dá)的影響（圖5）

圖5 AS-Ⅳ對NF-κB信號通路以及OPG、RANKL蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effects of AS-IV on the NF-κB signaling pathway and RANKL/OPG protein expression

與對照組相比，LPS組TLR4（3.66±0.50）、P-P65（3.36±0.13）、P-IκBα（6.73±0.05）和RANKL（3.82±0.23）蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.01），OPG（0.20±0.09）蛋白表達(dá)、OPG/RANKL比值（0.05±0.005）顯著降低（P＜0.01）；與LPS組相比，50μg/mL和100μg/mL組TLR4（2.57±0.35，1.84±0.25）、P-P65（2.25±0.15，1.59±0.14）、P-IκBα（3.34±0.02，1.49±0.07）和RANKL（1.88±0.06，1.15±0.04）蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.01）；OPG（0.27±0.07，0.62±0.05）蛋白表達(dá)、OPG/RANKL比值（0.14±0.01，0.54±0.03）顯著升高（P＜0.01）。

3 討論

牙周炎的特點(diǎn)是牙周組織的炎癥和牙槽骨的吸收［3］。牙周炎癥的發(fā)生加速了炎癥細(xì)胞浸潤［6］。本研究探討了AS-Ⅳ對LPS介導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)的抑制作用以及對細(xì)胞內(nèi)骨代謝相關(guān)蛋白表達(dá)產(chǎn)生影響。

LPS是革蘭氏陰性菌的外膜成分，是巨噬細(xì)胞表面TLR4表達(dá)的配體［7］。LPS介導(dǎo)炎癥反應(yīng)主要通過介導(dǎo)NF-κB信號通路來實(shí)現(xiàn)。NF-κB是一類由P50和P65組成的蛋白家族。其中，P65是促炎基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)因子［8］。不僅如此，NF-κB控制TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)在炎癥反應(yīng)中起到重要作用。TNF-α、IL-1β和IL-6作為重要的促炎介質(zhì)，在牙周炎過程中顯著上調(diào)，通過影響白細(xì)胞的活性積極參與牙周組織的危害［9］。這些細(xì)胞因子通過炎癥細(xì)胞的招募和激活在不同程度上參與炎癥的產(chǎn)生和發(fā)展。因此，本研究中選擇了TNF-α、IL-1β和IL-6來檢測AS-Ⅳ對這些細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響。大量研究［10-11］已經(jīng)證實(shí)NF-κB信號通路在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)方面的重要作用。牙周炎癥可能通過抑制NF-κB的激活得到緩解。Western blotting結(jié)果顯示，AS-Ⅳ能過抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB激活與TLR4的表達(dá)。LI等［12］研究證實(shí)TLR4可介導(dǎo)LPS刺激的人牙齦成纖維細(xì)胞中NF-κB的激活。通常，NF -κB與其抑制劑IκBα結(jié)合，并以非活性形式存在于細(xì)胞質(zhì)中［13］。在LPS的刺激下，IκB-α蛋白被磷酸化和降解，而NF-κBP65可能從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，上調(diào)炎癥介質(zhì)［14］。ELISA和Western blotting結(jié)果顯示，AS-Ⅳ通過調(diào)節(jié)NF-κB通路抑制了這些炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，證實(shí)了AS-Ⅳ在調(diào)節(jié)相關(guān)的免疫應(yīng)答方面具有潛在的作用。

破骨細(xì)胞的分化是通過破骨前細(xì)胞表面的RANK與其配體RANKL［15］結(jié)合來調(diào)控的，從而激活NF-κB信號通路。研究［16］表明，NF-κB亞單位P50和P52的缺失導(dǎo)致小鼠破骨細(xì)胞分化缺陷和骨硬化，NF-κB通路控制破骨形成。AMARASEKARA等［17］證明LPS可與破骨細(xì)胞前體相互作用，如骨髓巨噬細(xì)胞，或間接激活牙齦成纖維細(xì)胞和支持破骨細(xì)胞形成的成骨細(xì)胞，還通過誘導(dǎo)RANKL表達(dá)參與破骨細(xì)胞分化。因此，在骨穩(wěn)態(tài)中，OPG和RANKL的表達(dá)與激活對牙槽骨吸收和代謝至關(guān)重要。OPG是一種分泌蛋白，是RANKL的誘餌受體，在成骨細(xì)胞分化過程中分泌［18］。分泌型OPG與RANKL結(jié)合，通過阻止RANKL-RANK的結(jié)合，抑制破骨細(xì)胞形成，從而降低破骨細(xì)胞形成和骨吸收［19］。此外，IL-1和TNF-α也能通過促進(jìn)RANKL的產(chǎn)生，促進(jìn)破骨細(xì)胞的聚集，并促進(jìn)骨破壞［20］。Western blotting和實(shí)時PCR結(jié)果顯示，AS-Ⅳ增加了OPG的表達(dá)，降低RANKL的表達(dá)。此外，AS-Ⅳ增加了OPG/RANKL比值。這表明AS-Ⅳ可能通過阻斷RANKL-RANK結(jié)合和牙槽骨重塑來抑制破骨細(xì)胞的形成。

綜上，AS-Ⅳ可以抑制 LPS 誘導(dǎo)的 RAW264.7巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，其抗炎作用主要體現(xiàn)在介導(dǎo)NF-κB信號通路抑制炎性細(xì)胞因子 TNF-α、IL-6 和IL-1β 的生成，并且AS-Ⅳ還可以調(diào)節(jié)OPG/RANKL通路調(diào)節(jié)骨代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)。這可能是其防治各種慢性炎癥疾病重要作用機(jī)制。本研究為臨床應(yīng)用AS-Ⅳ治療牙周炎提供了理論依據(jù)。