李達

（汝陽縣中醫(yī)院 檢驗科，河南 洛陽 471200）

乙型肝炎是臨床常見疾病。我國慢性乙型肝炎患者高達2 億，其中1%患者會發(fā)展成為重度乙型肝炎［1］。目前關于乙型肝炎發(fā)生機制尚未完全明確，與乙型肝炎病毒（HBV）、肝細胞免疫損傷有關，及早診斷乙型肝炎有利于預后［2］。乙型肝炎主要作用的靶器官是肝臟，通過引起肝細胞結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，造成肝炎、肝硬化和肝功能衰竭等疾?。?］。乙型肝炎患者及乙肝病毒攜帶者是主要污染源，傳播途徑為血液、血制品、體液傳播和母嬰傳播等。乙型肝炎病毒包含乙型肝炎表面抗原（HBsAg）［4］，是機體感染乙肝病毒最早出現(xiàn)在血清中的物質(zhì)，也是診斷是否感染乙肝病毒的重要標志物。酶聯(lián)免疫吸附法是臨床常用的病毒檢查方法，但往往會出現(xiàn)假陽性，不利于臨床診治。本研究對酶聯(lián)免疫分析法檢測乙肝表面抗原常見影響因素進行探討，旨在為臨床提高診斷質(zhì)量提供可靠數(shù)據(jù)支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性選擇汝陽縣中醫(yī)院醫(yī)院2019 年10 月至2021 年5 月接收的慢性乙型肝炎患者44 例血清樣本作為研究對象。納入標準：①符合全國中西醫(yī)結(jié)合肝病學術會議制定乙型肝炎診斷標準；②患者知情同意；③既往病史明確。排除標準：①血樣污染的患者；②合并其他肝疾病患者；③合并嚴重性基礎疾病患者；④妊娠期、哺乳期患者。收集44 例患者血樣，獲得44 份HBsAg 陽性血清樣本。試劑盒是安圖試劑盒檢測OD 值。檢測儀器是URUANS 酶聯(lián)免疫吸附檢查儀。44 例患者中男21 例，女12 例；年齡18～74 歲，平均（52.57±3.74）歲；病程1～8 年，平均（5.17±0.39）年。

1.2 方法

抽取患者肘靜脈血5 mL，離心處理后留下血清，將44 份血清平均分成四等份，計為A、B、C、D。

A 等份：44 份HBsAg 陽性血清樣本按照陰性、陽性和空白對照組各設置2 個孔。加顯色劑后，使用空白孔調(diào)零，為了更好的了解不同時間底物的顯色情況，不加終止劑，但要在酶標儀上每5 min 檢測1 次410 nm OD 值。

B 等份：在44 份HBsAg 陽性血清樣本上做上下兩排雙孔，進行常規(guī)檢測，空白對照處理同A份。加顯色劑，將其再分成兩等份。一份放在37℃水浴箱孵育15 min。另一份放在12℃室溫內(nèi)，孵育15 min，加上終止劑，在酶標儀上測定450 nm OD 值。

C 等份：將44 份HBsAg 陽性血清樣本上做上下兩排的雙孔，進行常規(guī)檢測，空白對照處理同A、B 份。加顯色劑，將其再分成兩等份，一份用試劑盒洗液洗板5 次，另一份使用自來水洗板5 次，并在37℃水育15 min，終止檢測OD 值。

D 等份：將44 份HBsAg 陽性血清樣本做三排孔檢測，使用酶標記抗體40 μL、50 μL、60 μL，其余按照酶標操作說明書測定OD 值。

陽性標準：參考臨界值進行評定。臨界值=陰性對照孔OD 均值乘以2.1。臨界值＜0.05 時計算結(jié)果，且結(jié)果需乘以0.05。陽性標準：臨界值≥1，陰性＜1。

1.3 評價指標

比較不同時間HBsAg 陽性血清樣本滴度平均OD 值、不同溫度HBsAg 陽性血清樣本滴度的OD值、不同洗扳OD 值和三種不同酶標記抗體加入量OD 值。

1.4 統(tǒng)計學方法

本文數(shù)據(jù)均使用SPSS 19.00 軟件處理。計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，兩兩比較用t檢驗，三組及以上比較用方差分析；計數(shù)資料以百分率（%）表示，用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同時間HBsAg 陽性血清樣本滴度平均OD值比較

不同時間點5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min、35 min、40 min 平均OD 值比較差異有統(tǒng)計學意義（F=260.01,P＜0.001）。其中40 min 平均OD 值（0.71±0.02）最高，5 min 平均OD 值（0.41±0.02）最低。見表1。

表1 不同時間HBsAg 陽性血清樣本滴度平均OD 值比較（n=44,）

表1 不同時間HBsAg 陽性血清樣本滴度平均OD 值比較（n=44,）

2.2 兩種不同溫度HBsAg 陽性血清樣本滴度OD值比較

37℃時HBsAg 陽性血清樣本滴度OD 值為（0.99±0.32），高于12℃時HBsAg 陽性血清樣本滴度OD 值（0.81±0.36），差異有統(tǒng)計學意義（t=6.94,P＜0.001）。

2.3 不同洗扳HBsAg 陽性血清樣本OD 值比較

自來水HBsAg 陽性血清樣本OD 值為（0.62±0.16），高于試劑盒洗液HBsAg 陽性血清樣本OD 值（0.51±0.14），差異有統(tǒng)計學意義（t=8.09,P＜0.001）。

2.4 三種不同的酶標記抗體加入量OD 值比較

酶標記抗體加入量分別為40 μL、50 μL、60 μL 時的OD 值比較差異有統(tǒng)計學意義（F=8.87,P＜0.001）。其中50 μL 酶標記抗體加入量OD 值（0.77±0.19）最高，40 μL 酶標記抗體加入量OD值（0.72±0.12）最低，見表2。

表2 三種不同的酶標記抗體加入量OD 值比較（n=44,）

表2 三種不同的酶標記抗體加入量OD 值比較（n=44,）

3 討論

乙型肝炎是臨床一種常見和多發(fā)的疾病，病情較隱秘，在我國常見。最近幾年，乙型肝炎發(fā)生率呈上升趨勢。乙型肝炎臨床表現(xiàn)有惡心、乏力和腹脹等癥狀?；颊卟∏橥砥冢卫w維化明顯，嚴重影響患者生命健康。酶聯(lián)免疫吸附法最早見于1971 年，是一種非均相高通量免疫分析技術，其原理是通過固相載體表面進行免疫學反應，使用酶作為免疫標記，建立起與檢測物之間的反應署聯(lián)合關系［5］。酶聯(lián)免疫吸附法常見方法有雙抗體較夾心法測抗體、雙抗原夾心法測抗體、間接法測抗體、競爭法測抗體和捕獲包被法測抗體等。其中雙抗體夾心法測抗原主要用于二價或二價以上的大分子抗原。雙抗原夾心法測抗體主要適用于小分子激素、藥物或毒素［6］。捕獲包被法主要適用于病毒性感染的早期診斷。與其他檢測方法相比，酶聯(lián)免疫吸附法有成本低、穩(wěn)定性好、特異性強的優(yōu)點，對HBsAg 的檢測對診斷、治療和預防等有重要意義［7］。但酶聯(lián)免疫吸附法檢測HbsAg 結(jié)果容易受到溶血、酶標記抗體加入量和溫度等影響，其OD 值存在差異［8］。

本研究發(fā)現(xiàn)，在酶聯(lián)免疫吸附法中加樣、孵育和洗板等整個過程中的各個細胞中出現(xiàn)問題會導致乙型肝炎病毒表面抗體假陽性的情況。尤其是在此過程中要注意患者的OD 值較大時要進行復查。研究結(jié)果顯示，不同時間點5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min、35 min、40 min平均OD 值存在明顯不同。其中40 min 平均OD值最高，5 min 平均OD 值最低。37℃下HBsAg 陽性血清樣本滴度OD 值高于12℃。不同洗板中，自來水HBsAg 陽性血清樣本OD 值最高。40 μL、50 μL、60 μL 酶標記抗體加入量OD 值中50 μL 酶標記抗體加入量OD 值最高，40 μL 酶標記抗體加入量OD 值最低。說明檢測時間點、反應溫度、洗板和酶標記抗體加入量均影響HbsAg 的OD 值。隨著時間延長，OD 值顯色越深，因此要準確把握顯色時間。過早或過晚檢測均會導致靈敏度的樣本漏檢，其中過長時間會導致浪費。顯色溫度過低會導致結(jié)合反應速度延緩，導致顯色不充分［9］，會導致低值陽性樣本的漏檢。一般來說，洗板并不是酶聯(lián)免疫吸附法的反應步驟，但卻影響著試驗結(jié)果。通過洗板分離和固相抗原、抗體結(jié)合的游離物質(zhì)，可以顯著減少血清樣品中與反應無關的蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)從而提升特異性吸附［10］。洗板處理不徹底，會導致底本增高。酶聯(lián)免疫吸附法測定中PBS 洗滌液中洗滌效果較好，但自來水洗板會增加本底增高，使假陽性增加［11］。

目前關于酶聯(lián)免疫吸附法檢測導致HbsAg 假陽性原因包括：①試劑盒因素。試劑盒是最直接影響酶聯(lián)免疫吸附法檢測結(jié)果的因素，選擇合格、靈敏的試劑盒能提升檢查結(jié)果。②血液標本。目前認為溶血會導致酶聯(lián)免疫吸附試驗假陽性，溶血后，血清中含有血紅蛋白，血紅蛋白會減弱過氧化酶活性，一步法難以完全脫洗，殘留的過氧化酶能與包被抗體結(jié)合，從而增加假陽性風險［12］。③標本離心。部分血樣離心不全，血液未能完全凝固導致血清沒有分離完全時進行檢查會導致檢測反應孔出現(xiàn)凝血現(xiàn)象或殘留細胞成分干擾，其中免疫復合物吸附在塑料表面，導致非特異性結(jié)果，從而影響檢測結(jié)果，檢測過程中盡可能選擇血清，靜止2 h 后再實行檢測，同時加樣后要及時孵育。④加樣時間和洗板影響。前后血樣標本加樣時間過長，特別是夏天溫度過高會導致HbsAg結(jié)果影響較大，溫度和時間對顯色非常重要，溫度37℃的時間與顯色的顏色深淺呈正比。加樣過程中要保持顯色劑不會出現(xiàn)外流現(xiàn)象。⑤操作不當。在檢測過程中操作不當會影響HbsAg 結(jié)果，加樣不準確或錯誤使用標本會影響檢測質(zhì)量。加樣時必須使用一次性吸頭，最好使用洗板機代替人工操作，堅持室內(nèi)質(zhì)控和陰、陽性空白對照組同時進行。

綜上所述，酶聯(lián)免疫吸附法檢測HbsAg 結(jié)果多受溫度、孵育時間和洗板和酶標記抗體加入量等影響，應準確處理。