劉綱勇，黃錦波

(1.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣州 510000； 2.廣州金評檢測研究院有限公司，廣州 510000)

茶枯粉是壓榨野山茶油后留下的天然粉渣(茶粕)，含有豐富的粗蛋白及多種氨基酸、淀粉、糖類、纖維等營養(yǎng)物質(zhì)，用其洗護頭發(fā)可以去屑止癢、烏發(fā)防脫，使頭發(fā)更加松軟亮澤［1］，因此常常被用作洗發(fā)護發(fā)產(chǎn)品的原料。部分商家為使效果更明顯，會添加生發(fā)類激素如米諾地爾或雄胺類激素，而《化妝品安全技術(shù)規(guī)范中》（2015年版）中明確禁止添加此類激素［2］。長期使用非法添加米諾地爾或雄胺激素類的化妝品，短期內(nèi)的確可以大量長發(fā)，但是副作用非常明顯，如頭屑增多、皮膚瘙癢、甚至脫發(fā)加劇等，同時容易造成人體內(nèi)分泌失調(diào)［3］，因此有必要對茶枯粉中米諾地爾與雄胺類激素進行準確分析。

目前，檢測激素的主要方法為液相色譜法［4-5］、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［6-7］。其中液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法能同時檢測出幾十種激素［8］，可以縮短分析時間，且有利于辨別假陽性，但是質(zhì)譜法測定米諾地爾時，普通LC-MS儀的靈敏度相對較低，需要高分辨率的液相二級質(zhì)譜儀（LC-MS／MS）才能準確有效的定量［9］，而一般實驗室缺少如此昂貴的儀器。因此，在實際工作中，首選液相色譜法測定激素，其穩(wěn)定性好，靈敏度高，如楊德輝等利用高效液相色譜法測定了化妝品中7種甾體激素［10］、李娟等利用高效液相法測定了化妝品中的6種糖皮質(zhì)激素［11］，高衛(wèi)東等利用高效液相法，測定了地塞米松等11種激素［12］。

目前采用液相色譜法測定米諾地爾與非那雄胺的檢測方法相對較多［13］，但是度他雄胺的檢測方法較少，主要集中在藥物領(lǐng)域［14-16］。同時檢測茶枯粉中的米諾地爾、非那雄胺、度他雄胺三種激素的相關(guān)報道暫未發(fā)現(xiàn)。因此筆者通過優(yōu)化前處理條件與色譜條件，建立了液相色譜儀測定茶枯粉中3種激素含量的方法。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜儀：1260型，配有自動進樣器、二極管陣列檢測器（DAD）、柱溫箱、自動程序升溫系統(tǒng)，美國安捷倫科技有限公司。

固相萃取小柱：Oasis HLB型、Aisimo WAX型，深圳逗點生物技術(shù)有限公司。

超聲波清洗器：ZY-1001型，吉姆斯（廣州）實驗技術(shù)有限公司。

臺式離心機：TDL-5A型，常州市金壇友聯(lián)儀器研究所。

電子天平：BSA124S型，感量為0.000 1 g，德國賽多利斯集團。

米諾地爾標(biāo)準品：質(zhì)量分數(shù)為99.9%，批號為CDAA-740198，上海安譜實驗科技股份有限公司。

非那雄胺標(biāo)準品：質(zhì)量分數(shù)為99.5%，批號為CDGO-100611，上海安譜實驗科技股份有限公司。

度他雄胺標(biāo)準品：質(zhì)量分數(shù)為99.5%，批號為CDDM-D735002，上海安譜實驗科技股份有限公司

甲醇、乙醇、乙腈：均為色譜純。

三氯甲烷：分析純。

茶枯粉樣品：市售。

1.2 溶液配制

米諾地爾、非那雄胺、度他雄胺混合標(biāo)準儲備液：分別稱量米諾地爾0.010 2 g、非那雄胺0.010 4 g、度他雄胺0.010 6 g于同一只10 mL的棕色容量瓶中，甲醇稀釋并定容，使得三種激素的質(zhì)量濃度分別為1 018.98、1 034.80、1 054.70 μg/mL，冷凍避光保存。

米諾地爾、非那雄胺、度他雄胺混合標(biāo)準中間液：準確移取0.010 mL米諾地爾、非那雄胺、度他雄胺混合標(biāo)準溶液于100 mL容量瓶中，以甲醇定容，使得米諾地爾、非那雄胺與度他雄胺的質(zhì)量濃度分別為101.91、103.48、105.47 μg/L。

質(zhì)控樣品：準確稱量0.5 g空白質(zhì)基樣品于10 mL容量瓶中，并從米諾地爾、非那雄胺、度他雄胺混合標(biāo)準中間液中取0.02 mL溶液加入其中，使其質(zhì)量濃度接近檢出濃度，此時米諾地爾、非那雄胺與度他雄胺的質(zhì)量濃度分別為2.04、2.07、2.10 μg/L。

1.3 色譜條件

檢測器：二極管陣列檢測器（DAD）；色譜柱：Extend-C18型柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美國安捷倫科技有限公司)；檢測波長：250 nm；柱溫箱溫度：35 ℃；進樣體積：10 μL；流動相：體積分數(shù)為90%的甲醇-水溶液，恒流模式，流量為1 mL/min。

1.4 實驗方法

準確稱取均勻的樣品0.5 g（精確到0.001 g）于10 ml離心管中，加入3 mL乙腈進行提取，振蕩1 min，超聲15 min后，于離心機中以5 000 r／min進行離心，重復(fù)用3 mL乙腈提取三遍，合并有機相。合并后的有機相經(jīng)過Oasis HLB固相萃取小柱（分別以5 mL甲醇、10 mL水預(yù)先活化）凈化，待樣品液流盡后，以甲醇自然流下洗脫，最終以甲醇定容于10 mL容量瓶中，樣品溶液經(jīng)過0.45 μm的微孔有機濾膜過濾后，上機待測。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件色選擇

2.1.1 分析波長

對三種激素的混合標(biāo)準溶液進行全波長（190～400 nm）掃描，發(fā)現(xiàn)有較高吸收的波長分別為200、232、280nm，三種激素對短波長的響應(yīng)值均較高，但是在實驗時采用，短波長對目標(biāo)峰的干擾比較大，不利于分離成分復(fù)雜的樣品。為減少干擾，又能保證目標(biāo)物質(zhì)有較高的響應(yīng)值，試驗選取檢測波長為232 nm。

2.1.2 色譜柱的選擇

對標(biāo)準溶液分別進行測試，發(fā)現(xiàn)三種激素均能在C18色譜柱下分離，因此試驗在沒有進行樣品凈化的前提下考察了3種類型的C18色譜柱，分別為Extend-C18、Eclipse XDB-C18、SB-C18，其規(guī)格均為250 mm×4.6 mm，5 μm。

試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三種色譜柱均能有效的分離三種激素的標(biāo)準品。但對于質(zhì)控樣品的分離，采用SB-C18作為分離柱時，米諾地爾的色譜峰與雜質(zhì)色譜峰重疊在一起，完全不能分離，如圖1所示；采用Extend-C18、Eclipse XDB-C18作為分離柱時，Extend-C18能有效地分離米諾地爾與雜質(zhì)峰，其分離度為1.2，如圖2所示；而Eclipse XDB-C18在分離米諾地爾與其它雜質(zhì)峰時，其分離度僅為0.4，如圖3所示。因此試驗選擇Extend-C18色譜柱作為分析柱。

圖1 使用SB-C18柱的色譜圖

圖2 使用Extend-C18柱的色譜圖

圖3 使用Eclipse XDB-C18柱的色譜圖

2.1.3 流動相

確定了檢測波長與色譜柱后，以常見的甲醇-水溶液作為流動相進行試驗，考察流動相配比。分別配制甲醇體積分數(shù)為10%、30%、50%、70%、90%的甲醇-水溶液進行測試。試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)有機相體積分數(shù)小于50%時，三個目標(biāo)峰均檢測不出，而流動相中的有機相體積分數(shù)為90%時，非那雄胺、度他雄胺的分離度與靈敏度明顯大于有機相體積分數(shù)為70%時的流動相。因此試驗采用甲醇體積分數(shù)為90%的甲醇-水溶液作為流動相。

2.2 樣品處理條件的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的選擇

根據(jù)所測目標(biāo)物的極性，試驗考察了甲醇、乙醇、乙腈與三氯甲烷為提取劑時對3種激素回收率的影響（米諾地爾加標(biāo)濃度為0.40 μg/L，非那雄胺與度他雄胺加標(biāo)濃度均為4.00 μg/L），結(jié)果列于表1。由表1可知，甲醇與乙醇對米諾地爾的回收率較低，而三氯甲烷對非那雄胺與度他雄胺的回收率明顯過高。而乙腈作為提取劑時，三個目標(biāo)物的回收率均較理想，因此本試驗選擇乙腈作為樣品提取劑。

表1 不同溶劑作為提取劑的回收率 %

2.2.2 凈化條件的選擇

HLB小柱采用的是苯乙烯二乙烯基苯共聚物作為填料，能有效除去油脂與蛋白質(zhì)的干擾，有助于提高方法的靈敏度，降低基質(zhì)的影響，而WAX小柱為混合型弱陰離子交換小柱，在pH 0～12的范圍內(nèi)穩(wěn)定，對酸性的物質(zhì)具有高選擇性，耐受有機溶劑?？紤]到這兩個小柱的優(yōu)點，試驗在確定提取溶劑后，同時采用Oasis HLB固相萃取柱、Aisimo WAX固相萃取柱對含有同樣濃度的質(zhì)控樣品進行凈化試驗，考察回收率。試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)這兩種固相萃取小柱均能有效地起到凈化的作用，但是采用Aisimo WAX固相萃取小柱進行凈化的色譜峰高度明顯較低，這說明采用Aisimo WAX固相萃取小柱凈化的目標(biāo)物回收率不理想。因此試驗選擇Oasis HLB固相萃取柱作為凈化柱。

2.3 色譜行為

在優(yōu)化的色譜條件下，3種激素混合標(biāo)準溶液的色譜圖見圖4。

圖4 3種激素混合標(biāo)準溶液色譜圖

2.4 標(biāo)準曲線與檢出限

分別移取1.2項配制的混合標(biāo)準中間液0.01、0.05、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mL，置于一組10 mL容量瓶中，得到米諾地爾的質(zhì)量濃度為0.1～20 μg/L，非那雄胺與度他雄胺的質(zhì)量濃度范圍為2～50 μg/L。

取1.1中制備的系列混合標(biāo)準工作溶液，按優(yōu)化后的色譜條件對其進行測定，以各激素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x，μg/L），色譜峰面積為縱坐標(biāo)（y），計算線性方程與相關(guān)系數(shù)。通過1.3項下的樣品處理后，以目標(biāo)物在儀器上的3倍信噪比（3S/N）計算檢出限。線性方程，相關(guān)系數(shù)與檢出限見表1。

表2 3種激素標(biāo)準曲線考察結(jié)果

2.5 加標(biāo)回收與精密度試驗

以不含三種激素目標(biāo)物的茶枯粉作為空白基質(zhì)，分別移取1.1項下的混合標(biāo)準中間液0.2、0.4、2 mL作為加標(biāo)液，置于9只的10 mL離心管中，配制得到低、中、高三個水平的混合標(biāo)準溶液，每個水平測試6次，并計算其加標(biāo)回收率的平均值與測定結(jié)果的相對標(biāo)準偏差，結(jié)果列于表3。由表3可知，加標(biāo)回收率為88.3%～99.8%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準偏差為0.5%～4.1%，表明該方法精密度良好，滿足分析要求。

表3 精密度和加標(biāo)回收試驗結(jié)果（n=6）

2.6 實際樣品測試

市場購買10個不同品牌的茶枯粉，采用實驗建立的方法進行測試。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有一款茶枯粉中含有非那雄胺，如圖5所示，其含量為1.97 μg/kg。因此，本方法能準確有效地檢測茶枯粉中米諾地爾、非那雄胺與度他雄胺含量。

圖5 試劑陽性樣品色譜圖

3 結(jié)語

通過考察提取溶劑、凈化條件與色譜柱，以及流動相的選擇等，確定了以乙腈作為提取溶劑，Oasis HLB固相萃取小柱作為凈化小柱，Extend-C18作為分析柱，建立了高效液相色譜法測定茶枯粉中米諾地爾、非那雄胺與度他雄胺含量的方法。

考察了該方法的精密度、回收率，證明該方法能有效地測定茶枯粉中米諾地爾、非那雄胺與度他雄胺的含量，為廣大試驗工作者提供一種可借鑒的方法。