劉綱勇,黃錦波
(1.廣東食品藥品職業(yè)學院,廣州 510000; 2.廣州金評檢測研究院有限公司,廣州 510000)
茶枯粉是壓榨野山茶油后留下的天然粉渣(茶粕),含有豐富的粗蛋白及多種氨基酸、淀粉、糖類、纖維等營養(yǎng)物質,用其洗護頭發(fā)可以去屑止癢、烏發(fā)防脫,使頭發(fā)更加松軟亮澤[1],因此常常被用作洗發(fā)護發(fā)產(chǎn)品的原料。部分商家為使效果更明顯,會添加生發(fā)類激素如米諾地爾或雄胺類激素,而《化妝品安全技術規(guī)范中》(2015年版)中明確禁止添加此類激素[2]。長期使用非法添加米諾地爾或雄胺激素類的化妝品,短期內的確可以大量長發(fā),但是副作用非常明顯,如頭屑增多、皮膚瘙癢、甚至脫發(fā)加劇等,同時容易造成人體內分泌失調[3],因此有必要對茶枯粉中米諾地爾與雄胺類激素進行準確分析。
目前,檢測激素的主要方法為液相色譜法[4-5]、液相色譜-串聯(lián)質譜法[6-7]。其中液相色譜-串聯(lián)質譜(LC-MS/MS)法能同時檢測出幾十種激素[8],可以縮短分析時間,且有利于辨別假陽性,但是質譜法測定米諾地爾時,普通LC-MS儀的靈敏度相對較低,需要高分辨率的液相二級質譜儀(LC-MS/MS)才能準確有效的定量[9],而一般實驗室缺少如此昂貴的儀器。因此,在實際工作中,首選液相色譜法測定激素,其穩(wěn)定性好,靈敏度高,如楊德輝等利用高效液相色譜法測定了化妝品中7種甾體激素[10]、李娟等利用高效液相法測定了化妝品中的6種糖皮質激素[11],高衛(wèi)東等利用高效液相法,測定了地塞米松等11種激素[12]。
目前采用液相色譜法測定米諾地爾與非那雄胺的檢測方法相對較多[13],但是度他雄胺的檢測方法較少,主要集中在藥物領域[14-16]。同時檢測茶枯粉中的米諾地爾、非那雄胺、度他雄胺三種激素的相關報道暫未發(fā)現(xiàn)。因此筆者通過優(yōu)化前處理條件與色譜條件,建立了液相色譜儀測定茶枯粉中3種激素含量的方法。
液相色譜儀:1260型,配有自動進樣器、二極管陣列檢測器(DAD)、柱溫箱、自動程序升溫系統(tǒng),美國安捷倫科技有限公司。
固相萃取小柱:Oasis HLB型、Aisimo WAX型,深圳逗點生物技術有限公司。
超聲波清洗器:ZY-1001型,吉姆斯(廣州)實驗技術有限公司。
臺式離心機:TDL-5A型,常州市金壇友聯(lián)儀器研究所。
電子天平:BSA124S型,感量為0.000 1 g,德國賽多利斯集團。
米諾地爾標準品:質量分數(shù)為99.9%,批號為CDAA-740198,上海安譜實驗科技股份有限公司。
非那雄胺標準品:質量分數(shù)為99.5%,批號為CDGO-100611,上海安譜實驗科技股份有限公司。
度他雄胺標準品:質量分數(shù)為99.5%,批號為CDDM-D735002,上海安譜實驗科技股份有限公司
甲醇、乙醇、乙腈:均為色譜純。
三氯甲烷:分析純。
茶枯粉樣品:市售。
米諾地爾、非那雄胺、度他雄胺混合標準儲備液:分別稱量米諾地爾0.010 2 g、非那雄胺0.010 4 g、度他雄胺0.010 6 g于同一只10 mL的棕色容量瓶中,甲醇稀釋并定容,使得三種激素的質量濃度分別為1 018.98、1 034.80、1 054.70 μg/mL,冷凍避光保存。
米諾地爾、非那雄胺、度他雄胺混合標準中間液:準確移取0.010 mL米諾地爾、非那雄胺、度他雄胺混合標準溶液于100 mL容量瓶中,以甲醇定容,使得米諾地爾、非那雄胺與度他雄胺的質量濃度分別為101.91、103.48、105.47 μg/L。
質控樣品:準確稱量0.5 g空白質基樣品于10 mL容量瓶中,并從米諾地爾、非那雄胺、度他雄胺混合標準中間液中取0.02 mL溶液加入其中,使其質量濃度接近檢出濃度,此時米諾地爾、非那雄胺與度他雄胺的質量濃度分別為2.04、2.07、2.10 μg/L。
檢測器:二極管陣列檢測器(DAD);色譜柱:Extend-C18型柱(250 mm×4.6 mm,5 μm,美國安捷倫科技有限公司);檢測波長:250 nm;柱溫箱溫度:35 ℃;進樣體積:10 μL;流動相:體積分數(shù)為90%的甲醇-水溶液,恒流模式,流量為1 mL/min。
準確稱取均勻的樣品0.5 g(精確到0.001 g)于10 ml離心管中,加入3 mL乙腈進行提取,振蕩1 min,超聲15 min后,于離心機中以5 000 r/min進行離心,重復用3 mL乙腈提取三遍,合并有機相。合并后的有機相經(jīng)過Oasis HLB固相萃取小柱(分別以5 mL甲醇、10 mL水預先活化)凈化,待樣品液流盡后,以甲醇自然流下洗脫,最終以甲醇定容于10 mL容量瓶中,樣品溶液經(jīng)過0.45 μm的微孔有機濾膜過濾后,上機待測。
2.1.1 分析波長
對三種激素的混合標準溶液進行全波長(190~400 nm)掃描,發(fā)現(xiàn)有較高吸收的波長分別為200、232、280nm,三種激素對短波長的響應值均較高,但是在實驗時采用,短波長對目標峰的干擾比較大,不利于分離成分復雜的樣品。為減少干擾,又能保證目標物質有較高的響應值,試驗選取檢測波長為232 nm。
2.1.2 色譜柱的選擇
對標準溶液分別進行測試,發(fā)現(xiàn)三種激素均能在C18色譜柱下分離,因此試驗在沒有進行樣品凈化的前提下考察了3種類型的C18色譜柱,分別為Extend-C18、Eclipse XDB-C18、SB-C18,其規(guī)格均為250 mm×4.6 mm,5 μm。
試驗結果發(fā)現(xiàn),三種色譜柱均能有效的分離三種激素的標準品。但對于質控樣品的分離,采用SB-C18作為分離柱時,米諾地爾的色譜峰與雜質色譜峰重疊在一起,完全不能分離,如圖1所示;采用Extend-C18、Eclipse XDB-C18作為分離柱時,Extend-C18能有效地分離米諾地爾與雜質峰,其分離度為1.2,如圖2所示;而Eclipse XDB-C18在分離米諾地爾與其它雜質峰時,其分離度僅為0.4,如圖3所示。因此試驗選擇Extend-C18色譜柱作為分析柱。
圖1 使用SB-C18柱的色譜圖
圖2 使用Extend-C18柱的色譜圖
圖3 使用Eclipse XDB-C18柱的色譜圖
2.1.3 流動相
確定了檢測波長與色譜柱后,以常見的甲醇-水溶液作為流動相進行試驗,考察流動相配比。分別配制甲醇體積分數(shù)為10%、30%、50%、70%、90%的甲醇-水溶液進行測試。試驗結果發(fā)現(xiàn),當有機相體積分數(shù)小于50%時,三個目標峰均檢測不出,而流動相中的有機相體積分數(shù)為90%時,非那雄胺、度他雄胺的分離度與靈敏度明顯大于有機相體積分數(shù)為70%時的流動相。因此試驗采用甲醇體積分數(shù)為90%的甲醇-水溶液作為流動相。
2.2.1 提取溶劑的選擇
根據(jù)所測目標物的極性,試驗考察了甲醇、乙醇、乙腈與三氯甲烷為提取劑時對3種激素回收率的影響(米諾地爾加標濃度為0.40 μg/L,非那雄胺與度他雄胺加標濃度均為4.00 μg/L),結果列于表1。由表1可知,甲醇與乙醇對米諾地爾的回收率較低,而三氯甲烷對非那雄胺與度他雄胺的回收率明顯過高。而乙腈作為提取劑時,三個目標物的回收率均較理想,因此本試驗選擇乙腈作為樣品提取劑。
表1 不同溶劑作為提取劑的回收率 %
2.2.2 凈化條件的選擇
HLB小柱采用的是苯乙烯二乙烯基苯共聚物作為填料,能有效除去油脂與蛋白質的干擾,有助于提高方法的靈敏度,降低基質的影響,而WAX小柱為混合型弱陰離子交換小柱,在pH 0~12的范圍內穩(wěn)定,對酸性的物質具有高選擇性,耐受有機溶劑??紤]到這兩個小柱的優(yōu)點,試驗在確定提取溶劑后,同時采用Oasis HLB固相萃取柱、Aisimo WAX固相萃取柱對含有同樣濃度的質控樣品進行凈化試驗,考察回收率。試驗結果發(fā)現(xiàn)這兩種固相萃取小柱均能有效地起到凈化的作用,但是采用Aisimo WAX固相萃取小柱進行凈化的色譜峰高度明顯較低,這說明采用Aisimo WAX固相萃取小柱凈化的目標物回收率不理想。因此試驗選擇Oasis HLB固相萃取柱作為凈化柱。
在優(yōu)化的色譜條件下,3種激素混合標準溶液的色譜圖見圖4。
圖4 3種激素混合標準溶液色譜圖
分別移取1.2項配制的混合標準中間液0.01、0.05、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mL,置于一組10 mL容量瓶中,得到米諾地爾的質量濃度為0.1~20 μg/L,非那雄胺與度他雄胺的質量濃度范圍為2~50 μg/L。
取1.1中制備的系列混合標準工作溶液,按優(yōu)化后的色譜條件對其進行測定,以各激素質量濃度為橫坐標(x,μg/L),色譜峰面積為縱坐標(y),計算線性方程與相關系數(shù)。通過1.3項下的樣品處理后,以目標物在儀器上的3倍信噪比(3S/N)計算檢出限。線性方程,相關系數(shù)與檢出限見表1。
表2 3種激素標準曲線考察結果
以不含三種激素目標物的茶枯粉作為空白基質,分別移取1.1項下的混合標準中間液0.2、0.4、2 mL作為加標液,置于9只的10 mL離心管中,配制得到低、中、高三個水平的混合標準溶液,每個水平測試6次,并計算其加標回收率的平均值與測定結果的相對標準偏差,結果列于表3。由表3可知,加標回收率為88.3%~99.8%,測定結果的相對標準偏差為0.5%~4.1%,表明該方法精密度良好,滿足分析要求。
表3 精密度和加標回收試驗結果(n=6)
市場購買10個不同品牌的茶枯粉,采用實驗建立的方法進行測試。結果發(fā)現(xiàn)有一款茶枯粉中含有非那雄胺,如圖5所示,其含量為1.97 μg/kg。因此,本方法能準確有效地檢測茶枯粉中米諾地爾、非那雄胺與度他雄胺含量。
圖5 試劑陽性樣品色譜圖
通過考察提取溶劑、凈化條件與色譜柱,以及流動相的選擇等,確定了以乙腈作為提取溶劑,Oasis HLB固相萃取小柱作為凈化小柱,Extend-C18作為分析柱,建立了高效液相色譜法測定茶枯粉中米諾地爾、非那雄胺與度他雄胺含量的方法。
考察了該方法的精密度、回收率,證明該方法能有效地測定茶枯粉中米諾地爾、非那雄胺與度他雄胺的含量,為廣大試驗工作者提供一種可借鑒的方法。