陳華燕，徐蘇華，黃敏菊

（廣東省醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，國家藥品監(jiān)督管理局體外循環(huán)器械重點實驗室，廣州市生物醫(yī)用血液凈化材料研究與開發(fā)重點實驗室，廣州 510663）

雙酚A作為一種工業(yè)原料被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療器械的生產(chǎn)中［1］，如血液透析濾器、植入式心臟起搏器、牙科種植材料、呼吸麻醉設(shè)備等。醫(yī)療設(shè)備與人體接觸時，其中殘留的雙酚A可通過皮膚、消化道、呼吸道、血液、體液等進入體內(nèi)，影響生殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)，導致激素紊亂、代謝異常、神經(jīng)發(fā)育遲緩、心腦血管疾病等危害［2-4］。血液透析器是血液與透析液進行交換的管路與容器，是血液凈化治療中的重要組成部分。血液透析器外殼多使用聚碳酸酯樹脂，中空纖維膜則常用聚砜膜、聚醚砜膜、聚酰胺膜等材料［5］。聚碳酸酯樹脂常使用雙酚A作為單體來進行合成［6-7］，雙酚A的鉀鹽和鈉鹽則是生產(chǎn)聚砜膜的原料［8-11］，因此若是在合成過程中未完全聚合的雙酚A殘留在血液透析器的原料中，就有隨著透析過程進入體的危險。許多臨床數(shù)據(jù)表明［12-16］，血液透析治療的患者體內(nèi)雙酚A水平遠高于非透析的腎臟病患者，這說明在血液透析治療過程中透析器材料中殘留的雙酚A的確會釋放到人體體內(nèi)，因此有必要對血液透析器中雙酚A的溶出量進行檢測，并設(shè)立相應(yīng)法規(guī)標準限制其應(yīng)用和殘留量。

雙酚A的檢測主要集中于食品包裝材料或日用生活品上，醫(yī)療器械如血液透析器中的雙酚A的測定報道較少。彭文啟［17］使用水、純牛奶、10%乙醇與橄欖油作為遷移介質(zhì)測定兒童產(chǎn)品中的雙酚A遷移量；方曉明等［18］采用乙腈提取罐頭食品中的雙酚A；楊曉燕等［19］則選用3%的乙酸溶液作為浸泡液測定食品接觸材料中雙酚A的溶出量?，F(xiàn)有方法用于測定醫(yī)療器械中的雙酚A適應(yīng)性較差，不能夠針對器械的使用特點進行實驗。透析器是血液凈化的載體，若使用純牛奶、食用油或者去離子水進行浸提，就會與實際使用中血液溶出雙酚A的數(shù)值存在差異，不能很好地反應(yīng)出透析器在血液凈化使用中雙酚A的真實溶出情況，因此選擇合適的溶劑非常重要。郭利娟等［30］采用甲醇對血液透析器進行浸提，但甲醇的毒性和揮發(fā)性較大，不適合進行批量化檢測。目前有研究表明乙醇-水混合溶液可以模擬血液，用于輸液管路中增塑劑鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)的溶出的浸提實驗［20-21］。采用乙醇-水的混合溶液模擬血液浸提透析器中的雙酚A，既符合透析器的使用場景，溶劑又符合低毒要求。

在現(xiàn)有檢測方法中，可以使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）法［22-23］、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）法［24-27］、高效液相色譜（HPLC）法［28-30］、抗原抗體結(jié)合法［31］和酶聯(lián)免疫法［32］等方法進行雙酚A的測定，其中采用色譜法的占多數(shù)。因雙酚A沸點高，需經(jīng)過衍生化來增加其揮發(fā)性來提高氣相色譜方法的檢測能力［33］，但衍生化過程操作復(fù)雜且周期長，使其在實際的商業(yè)應(yīng)用中發(fā)展受限；液相分離方法中雙酚A則無需衍生化，大大簡化流程，提高效率，便于操作方法的普及與商用。對比多項檢測方法，色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的檢出限與定量限往往低于單獨的液相色譜，但色譜-質(zhì)譜串聯(lián)的儀器價格普遍高于液相色譜難以普及。生物分析技術(shù)的抗原抗體結(jié)合法［31］和酶聯(lián)免疫法［32］，具有高特異性，高敏感度和高通量的優(yōu)勢，檢測速度快，但是該分析技術(shù)會出現(xiàn)假陽性，只能進行半定量分析，對于微量雙酚A的測定有局限性。汪仕韜等［34］采用高效液相色譜法測定塑料包裝材料中雙酚A的含量，檢出限可達0.05 mg/kg；郭利娟等［35］使用高效液相色譜熒光法測定血液透析器中雙酚A含量時，最低檢出限可以達到0.010 8 μg/mL，這些結(jié)果表明高效液相與熒光檢測器的配合使用能夠達到較低的檢出限，有很高的靈敏度，適用于微量雙酚A的測定。

在樣品液制備方面，選擇了密度為0.937 3～0.937 8 g/mL乙醇-水混合液作為血液模擬溶劑，模擬血液浸提透析器中的雙酚A。所用溶劑低毒，且浸提液可以直接用于測定，無需進行濃縮純化和衍生化。在儀器測試階段，參考上述對比情況，選擇了高效液相色譜聯(lián)用熒光檢測器的方法，可以簡化操作過程和降低檢出限。本方法針對透析器的特點，模擬臨床使用條件，采用乙醇-水混合液進行浸提，結(jié)合高效液相色譜熒光法測定。該方法可用于血液透析器中雙酚A含量的安全性風險評估，為有關(guān)監(jiān)管部門提供技術(shù)參考。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜儀：LC-20AT型，配熒光檢測器，島津企業(yè)管理（中國）有限公司。

滾壓泵：JHBP-200B型，廣州市暨華醫(yī)療器械有限公司。

數(shù)顯電子恒溫水浴鍋：BL810C型，雅馬拓科技貿(mào)易（上海）有限公司

分析天平：SECURA224-1CN型，感量為0.001 g，賽多利斯(上海)貿(mào)易有限公司。

液體密度計：測量范圍為0.9～0.95 g/cm3，精度為0.000 5 g/cm3，衡水創(chuàng)紀儀器儀表有限公司。

雙酚A（BPA）對照品：色譜純，質(zhì)量分數(shù)大于99.8%，批號為L1615026，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

乙腈：色譜純，批號為197164，德國默克公司。

乙醇：分析純，批號為20200623，廣東光華科技有限公司。

實驗室用水為二級水。

1.2 溶液制備

1.2.1 標準溶液的配制

分析天平精密稱量0.100 g 雙酚A，用密度為0.9375 g/mL的乙醇-水混合液溶解，用容量瓶定容至100 mL，搖勻。用乙醇-水混合溶液稀逐級釋，分別配制成質(zhì)量濃度為0.005、0.01、0.05、0.10、0.25、0.75 μg/mL的雙酚A系列對照品工作溶液。

1.2.2 樣品液的制備

參考臨床中血液透析器的使用過程，取一套盡可能短的管路與透析器連接，取液體密度計測定密度ρ為0.937 3～0.937 8 g/mL的乙醇水混合液浸提溶劑500 mL，用恒流泵使溶劑以200 mL/min的流量循環(huán)沖洗血室6 h，同時用乙醇-水溶液充滿透析液室，循環(huán)結(jié)束后，把血室和透析液室內(nèi)的溶液全部吹出，收集全部液體冷至室溫作為檢驗液。取同體積乙醇-水混合液，不裝血液透析器同法制備空白對照液。

圖1 血液透析器雙酚A浸提示意圖

1.3 實驗步驟

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Inertsil?ODS-SP型，250 mm×4.6 mm，5 μm，島津企業(yè)管理（中國）有限公司；激發(fā)波長：227 nm；發(fā)射波長：313 nm；柱溫：35 ℃；進樣體積：20 μL；流動相：A相為乙腈， B相為水，梯度洗脫條件列于表1。

表1 梯度洗脫條件

1.3.2 測定方法

以0.45 μm膜過濾檢驗液和對照品溶液，分別取20 μL注入液相色譜儀測定，利用色譜峰面積計算檢驗液中雙酚A含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 浸提溶劑的選擇

雙酚A易溶于甲醇、乙醇、醋酸、丙酮、苯等有機溶劑，難溶于水。甲醇、苯毒性較大，容易揮發(fā)，而丙酮屬于管制藥品，較難獲得。目前有研究表明乙醇-水混合溶液可以替代血液模擬溶劑來浸提與血液接觸的醫(yī)療器械中的雙酚A［20］，《YYT 0927-2014 聚氯乙烯醫(yī)療器械中鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)溶出量測定指南》［21］中對于接觸血液或者血液成分的醫(yī)療器械如輸血器、透析器、氧合器和血液循環(huán)裝置等，一般可考慮采用密度為0.937 3～0.937 8 g/mL的乙醇-水混合液的替代血液作為浸提溶劑。

因此試驗使用乙醇-水混合液作為血液透析器的模擬浸提試劑，使其以臨床使用相同的方式和條件進行浸提，然后取部分浸提液作為試驗液。

2.2 激發(fā)波長與發(fā)射波長的確定

目前研究顯示［18，36-37］，雙酚A的激發(fā)波長在227 nm左右，發(fā)射波長在313 nm左右有較強的吸收峰，為了與標準方法一致，并增加可操作性，試驗參考《GBT 23296.16-2009 食品接觸材料高分子材料 食品模擬物中2，2-二（4-羥基苯基）丙烷（雙酚A）的測定 高效液相色譜法》［28］中雙酚A的發(fā)射波長和激發(fā)波長，選定激發(fā)波長為227 nm，發(fā)射波長為313 nm。

2.3 專屬性試驗結(jié)果

分別取空白供試液、質(zhì)量濃度為0.1 μg/mL的雙酚A標準品溶液、供試品溶液，在1.2色譜條件下進行測定，空白溶液、標準品溶液、供試品溶液色譜圖見圖2、圖3、圖4。由圖3結(jié)果顯示，雙酚A的保留時間約為5.647 min，理論塔板數(shù)為8 750，分離度為5.452。待測物質(zhì)與其它峰無干擾，樣品供試液的出峰位置表明該色譜條件可以用來測定雙酚A的含量，方法專屬性良好。

圖3 0.1 μg/mL雙酚A標準品色譜圖

圖4 雙酚A供試品色譜圖

2.4 線性方程、定量限與檢出限

取1.2.1中制備的雙酚A系列對照品工作溶液，按照1.2的色譜條件進行分析，以各組分色譜峰面積為縱坐標（Y）、對照品質(zhì)量濃度為橫坐標（X，μg/mL）作圖。計算得到雙酚A的線性回歸方程為Y=1.498 0×107X+62 886.4，相關(guān)系數(shù)為0.999 9。說明本方法測定雙酚A的質(zhì)量濃度在0.005～0.75 μg/mL范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關(guān)系良好。

取雙酚A對照品溶液，用乙醇水混合液按需求等比稀釋，對得到的低濃度對照品溶液進行測定。檢測質(zhì)量濃度為0.005 μg/mL，試驗得到（S/N）為11.42倍的信噪比，符合大于10倍信噪比的定量要求。以3倍的信噪比（S/N）作為檢出限，檢出限為0.001 3 μg/mL。

2.5 重復(fù)性與重現(xiàn)性試驗

根據(jù)中國藥典（2020年版），取質(zhì)量濃度為0.005、0.05、0.25 μg/mL的雙酚A標準品，各連續(xù)測定3次，計算色譜峰面積的相對標準偏差（RSD），結(jié)果列于表2。由表2可知，方法重復(fù)性RSD為1.10%～2.66%。

表2 重復(fù)性試驗結(jié)果

在不同日期由不同分析人員平行制備同重復(fù)性濃度相同的各3份標準品連續(xù)測定計算峰面積的相對標準偏差（RSD），結(jié)果列于表3。由表3中可以看出，重現(xiàn)性RSD為2.98%～3.31%。

表3 重現(xiàn)性試驗結(jié)果

根據(jù)中國藥典（2020年版）9101藥品分析方法驗證指導原則，當樣品質(zhì)量濃度在1 μg/mL級別時，重復(fù)性應(yīng)不大于8%，重現(xiàn)性RSD應(yīng)不大于16%。根據(jù)表2、表3可知，該方法符合中國藥典的相關(guān)規(guī)定。

2.6 加標回收試驗

取樣品浸提液各9份，以樣品浸提液作為基底，分別加入適量的雙酚A對照品溶液，制備成低、中、高三個理論濃度分別為0.05、0.1、0.25 μg/mL的樣品各三份，用0.45 μm膜過濾檢驗液，分別測定3次，計算平均回收率，結(jié)果列于表4。

表4 加標回收率試驗結(jié)果

根據(jù)中國藥典（2020年版）9101藥品分析方法驗證指導原則，當樣品濃度為1 μg/mL級別時，回收率應(yīng)符合75%～120%，RSD值不大于5%。從表4可以看出，平均回收率為92.67%～97.33%，RSD為1.04%～2.37%，結(jié)果符合中國藥典的相關(guān)要求。

2.7 樣品雙酚A的溶出量測定

分別取4種樣品的浸提液，每組樣品浸提液平行測定3次，將得到的質(zhì)量濃度結(jié)果帶入下式（1），結(jié)果列于表5。

表5 血液透析器中雙酚A溶出量結(jié)果

式中：m——每套樣品溶液雙酚A溶出量，μg/套；

c——樣品供試液中雙酚A實測值，μg/mL 。

EFSA（歐洲食品安全局）設(shè)定雙酚A的每日耐受攝入量為50 μg/(體重·天)，即0.05 mg/(kg·d)，并在2015年將其臨時調(diào)整到4 μg/(kg·d)，即0.004 mg/(kg·d)［38-39］。

采用《GB/T 16886.17—2005 可瀝濾物允許限量的建立》中［40］的公式推導，得到人體可耐受量為0.056 mg。根據(jù)表5可知，4種樣品的每套雙 酚A含 量 分 別 為33.5、45.5、21.5、43.5 μg/套，均低于人體可耐受量0.056 mg。

3 結(jié)語

建立了一種高效液相色譜熒光法，測定血液透析器雙酚A的溶出量，乙醇-水混合液作為血液模擬溶劑浸提血液透析器，樣品液可以直接用于色譜測定，不需要進行活化淋洗富集衍生化等過程，大大簡化了操作流程。雙酚A的保留時間約為5.647 min，出峰快，檢測效率高。此方法有較低的檢出限0.001 3 μg/mL，證明此方法有較高靈敏度，適用于醫(yī)療器械中微量雙酚A的測定。